CN116439137B - 一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，具体包括以下步骤：(1)外植体的选取；(2)对外植体超声波处理；(3)愈伤组织诱导：将超声波处理后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，暗培养；(4)体胚诱导：将诱导培养的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，暗培养，得到胚状体；(5)植株诱导：将胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可高效扩繁橡胶树植株。本发明利用超声波处理工艺对外植体进行适当加工，既可以对橡胶树体细胞胚进行微创伤处理，又能有效避免超声波处理对活体细胞组织的损伤。实验证实能有效提高SRJC扩繁效率，采用最佳处理条件的方案其扩繁效率较对照提高了35.00％。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法。
背景技术
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是中国和世界其他地区天然橡胶(NR)工业的主要原材料来源。自根幼态无性系(Self Rooting Juvenile Clone,SRJC)与芽接苗相比，具有生长快、产量高、抗性强的优点(陈雄庭等，2002)。目前，已有几种离体组织培养方法可获得橡胶树自根幼态无性系。其中次生体胚循环增殖是目前为止效率最高的方法(Hua等，2010；华玉伟等，2007)，每工人每年可生产2万株以上SRJC。依托该技术，我国已建成全球首个橡胶树SRJC规模化生产基地。
然而基于目前扩繁效率，SRJC生产成本是芽接苗的3倍，远高于芽接苗，生产单位对降低生产成本需求迫切，因此，急需探索出一种提高扩繁效率、降低SRJC生产成本的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，利用超声波处理工艺对外植体加工从而提高SRJC扩繁效率。其原理在于：超声波发生器发出的高频振荡信号，产生数以万计的直径为50-500μm的微小气泡，这些气泡爆炸时产生冲击波，形成几百度的高温和超过1000个气压的瞬间高压，可以在植物表面形成大量微小伤口，从而利于愈伤组织诱导分化。本发明通过选择适宜的外植体、超声波处理参数及方案设计，有效控制了超声波处理时组织损伤发生率、避免影响细胞的正常机制，进而得到高次生体胚扩繁效率，低SRJC生产成本的技术方案。
为实现上述目的，本发明提供一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，具体包括以下步骤：
(1)外植体的选取；
(2)对外植体超声波处理；
(3)愈伤组织诱导：将步骤(2)超声波处理后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，进行培养；
(4)体胚诱导：将步骤(3)诱导培养的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，进行培养，得到胚状体；
(5)植株诱导：将步骤(4)得到的成熟胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可得到橡胶树再生植株。
在一优选的实施方式中，步骤(1)中，所述外植体为增殖世代小于10代的成熟子叶形胚状体。
在一优选的实施方式中，步骤(2)中，所述超声波处理方法为：将步骤(1)得到的外植体置于保护装置内，再将保护装置放置于超声波清洗机中，进行超声波处理。
在一优选的实施方式中，步骤(2)中，所述超声波处理条件为以10-80kHZ处理5-180s。
在一优选的实施方式中，步骤(3)中，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：以MS培养基为基础培养基，附加2,4-D 1-2mg/L，萘乙酸0.5-1.5mg/L，激动素1-2mg/L，天冬酰胺0.3g/L，肌醇0.1g/L，蔗糖50-70g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L；调培养基的pH至5.8-6.2。
在一优选的实施方式中，步骤(3)中，所述愈伤组织诱导培养条件为：
在24-28℃条件下，暗培养22-30d。
在一优选的实施方式中，步骤(4)中，所述胚状体诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加6-苄基氨基嘌呤0.5-2mg/L，细胞激动素1-3mg/L，2,4-D 0.02-0.06mg/L，赤霉素0.3-0.8mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖50-70g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2。
在一优选的实施方式中，步骤(4)中，所述体胚诱导培养条件为：
在24-28℃条件下，暗培养50-60d。
在一优选的实施方式中，步骤(5)中，所述植株诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加细胞激动素0.2-0.5mg/L，赤霉素2-3mg/L，吲哚乙酸0.1-0.3mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖30-50g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2。
在一优选的实施方式中，步骤(5)中，所述植株诱导培养条件为：
在24-28℃，光源采用光源组合盒，所述光源组合盒由白光和红光的LED灯珠按7：1数量共组成84个LED灯珠，总光照强度为3500-3800Lux，光照周期为12/12h(光照/黑暗)的光照条件下培养40-50d。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：
1、本发明中，所用的超声波清洗设备价格低廉，超声波操作简单易行，耗时短、效率高，可大规模工业化加工处理。
2、本发明中通过选择适宜的外植体及将外植体置于保护装置中，既可以对橡胶树体细胞胚进行微创伤处理，又能有效避免超声波处理对活体细胞组织的损伤。室温及短时间的超声波处理参数也能进一步保护活体细胞组织，避免造成不可逆的致命作用。
3、本发明所提供的技术方案还具有如下经济和科研价值：
①提高次生体胚发生率。
②提高正常子叶胚诱导率。
③提高SRJC成苗率。
④提高SRJC扩繁效率，采用最佳处理条件的技术方案其扩繁效率较对照提高了35.00％。
⑤降低SRJC生产成本，推动SRJC在生产上推广应用。
⑥该技术也可用于转化实验提高遗传转化效率。
⑦优化后的参数保证了对植物细胞的无害作用及其机理。
⑧本发明提供的超声波处理步骤可应用于其他物种体外扩繁(愈伤组织发生/器官形成)。
附图说明
从下面结合附图对本发明实施例的详细描述中，本发明的这些和/或其它方面和优点将变得更加清楚并更容易理解，其中：
图1为本发明实施例中不同超声波频率和超声波处理时间对外植体的影响，统计在超声波处理后的不同时间下存活胚胎数量。
图2为本发明实施例中不同超声波频率和超声波处理时间对外植体损伤情况，第I行是体视显微镜结果，第II行是组织切片结果，第III行是超微结果；图中标记分别为ab：远轴面；Ad：近轴面；PB：蛋白体；S:淀粉粒；CW：细胞壁；V：液泡；
图3为对照组(G1)和超声波处理最优组(G5，50s40kHZ)次生体细胞胚胎发生和幼苗再生情况；其中，红色星号为超声波处理造成的微小伤口；
图4为本发明实施例中不同超声波频率和超声波处理时间对提高次生体胚诱导率的影响；
图5为本发明实施例中不同超声波频率和超声波处理时间对提高SRJC诱导率的影响。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明实施例通过提供一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，解决现有技术中SRJC生产成本高昂，效率低下的问题。
本发明中的技术方案为解决上述问题，总体思路如下：
本发明提供一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，具体包括以下步骤：
(1)外植体的选取；
(2)对外植体超声波处理；
(3)愈伤组织诱导：将步骤(2)超声波处理后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，进行培养；
(4)体胚诱导：将步骤(3)诱导培养的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，进行培养，得到胚状体；
(5)植株诱导：将步骤(4)得到的成熟胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可得到橡胶树再生植株。
在一优选的实施方式中，步骤(1)中，所述外植体为增殖世代小于10代的成熟子叶形胚状体。
在一优选的实施方式中，步骤(1)中，所述胚状体尺寸为1-2cm，表面呈亮黄色。
在一优选的实施方式中，步骤(2)中，所述超声波处理方法为：将步骤(1)得到的外植体置于保护装置内，再将保护装置放置于超声波清洗机中，进行超声处理。
所述保护装置的形状、材质和容量规格不作限定，以保护外植体不直接受到超声波冲击为目的。在一优选的实施方式中，所述保护装置材质包括玻璃、高分子聚合物、木材、石头或陶瓷中的一种或多种；所述保护装置材质形状包括长方形、圆形、锥形、柱形或其他异形结构中的一种或多种；更优选的，所述保护装置为高压灭菌锥形玻璃瓶，规格为100ml。
在一优选的实施方式中，所述保护装置使用前包括高温灭菌步骤，可采用本领域技术人员所掌握的常规方法，达到灭菌目的即可；例如，将保护装置密封，以100-200℃高温灭菌20-60min，烘干备用；所述烘干方法也可采用本领域技术人员掌握的常规方法，如在干燥箱中以40-60℃处理1-2h。
在一优选的实施方式中，所述保护装置中可依据装置的容量放置单个或多个体胚，例如单个保护装置中放置5-20个体胚。
在一优选的实施方式中，为保证无菌环境，放置体胚后，经密封后再进行超声波处理。
在一优选的实施方式中，步骤(2)中，所述超声波处理条件为以10-80kHZ处理5-180s。
在一优选的实施方式中，所述超声波处理温度为室温，更优选的，所述超声波处理条件为以20-40kHZ处理10-90s，最优选的，所述超声波处理频率为20kHZ、25kHZ、30kHZ、35kHZ、40kHZ，所述超声波处理时间为20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s。
在一优选的实施方式中，步骤(3)中，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：以MS培养基为基础培养基，附加2,4-D 1-2mg/L，萘乙酸0.5-1.5mg/L，激动素1-2mg/L，天冬酰胺0.3g/L，肌醇0.1g/L，蔗糖50-70g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L；调培养基的pH至5.8-6.2。
在一优选的实施方式中，步骤(3)中，所述愈伤组织诱导培养条件为：
在24-28℃条件下，暗培养22-30d。
在一优选的实施方式中，步骤(4)中，所述胚状体诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加6-苄基氨基嘌呤0.5-2mg/L，细胞激动素1-3mg/L，2,4-D 0.02-0.06mg/L，赤霉素0.3-0.8mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖50-70g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2。
在一优选的实施方式中，步骤(4)中，所述体胚诱导培养条件为：
在24-28℃条件下，培养50-60d。
在一优选的实施方式中，步骤(5)中，所述植株诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加细胞激动素0.2-0.5mg/L，赤霉素2-3mg/L，吲哚乙酸0.1-0.3mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖30-50g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2。
在一优选的实施方式中，步骤(5)中，所述植株诱导培养条件为：在24-28℃，光源采用光源组合盒，所述光源组合盒由白光和红光的LED灯珠按7：1数量共组成84个LED灯珠，总光照强度为3500-3800Lux，光照周期为12/12h(光照/黑暗)的光照条件下培养40-50d。
下面通过具体实施例详细说明本申请的技术方案：
若未特别指明，本发明中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明中所用的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。本发明所用试剂如无特殊说明均为分析纯。本发明所用橡胶树试管苗名称为：无菌橡胶树试管苗商业化品种热研73397，来源为：中国热带农业科学院橡胶研究所天然橡胶新型种植材料创新基地；本发明所用超声波清洗机型号为：宁波新芝SB-5200DTD。本发明实施例中所述室温为25±5℃。
实施例
实验材料:超声波清洗仪，无菌锥形烧瓶(100ml)，橡胶树体细胞胚。
实验步骤：
(1)外植体的选取：取增殖世代为1代的成熟子叶形胚状体，胚状体尺寸为1-2cm，表面呈亮黄色。
(2)对外植体超声波处理：将锥形烧瓶密封，在121℃下高温灭菌30分钟，然后在烘箱中干燥至无水分残留。在超声波仪器中盛蒸馏水，直到水位标记处，关闭温度设置。每个锥形瓶无菌保存10个体胚，再次密封。按实验组给每个锥形瓶贴上标签。按超声波处理参数进行超声波处理，取出锥形瓶。
(3)将步骤(2)超声波处理后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，进行培养；具体的，愈伤组织诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加2,4-D 1.5mg/L，萘乙酸1.5mg/L，激动素1.5mg/L，天冬酰胺0.3g/L，肌醇0.1g/L，蔗糖70g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L；调培养基的pH至5.8；培养条件为：在23℃条件下，暗培养25d。
(4)体胚诱导：将步骤(3)诱导培养的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，进行培养，得到胚状体；具体的，胚状体诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加6-苄基氨基嘌呤1mg/L，细胞激动素3mg/L，2,4-D0.06mg/L，赤霉素0.6mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖50g/L，椰子水5％V/V)，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8；培养条件为：在24℃条件下，培养50d。
(5)植株诱导：将步骤(4)得到的成熟胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可得到橡胶树再生植株；具体的，植株诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加细胞激动素0.5mg/L，赤霉素3mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖50g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8；
培养条件为：在28℃，光源采用光源组合盒，所述光源组合盒由白光和红光的LED灯珠按7：1数量共组成84个LED灯珠，总光照强度为3500Lux，光照周期为12/12h(光照/黑暗)的光照条件下培养40d。
(6)对每组取标本进行组织学分析。
其中，在步骤(2)中，对超声波处理参数设计不同的测试组，具体如下所示：
组1(G1):对照组(无超声波处理)
组2(G2):20kHZ频率10s超声波处理；
组3(G3):40kHZ频率10s超声波处理；
组4(G4):20kHZ频率50s超声波处理；
组5(G5):40kHZ频率50s超声波处理；
组6(G6):20kHZ频率90s超声波处理；
组7(G7):40kHZ频率90s超声波处理。
结果与讨论
图1为不同超声波频率和超声波处理时间对外植体的影响，统计在超声波处理后的不同时间下存活胚胎数量。由图中可以看出，G2组-G5组其结果数据与对照组近似，说明上述处理条件对组织细胞伤害较小。
图2为不同超声波频率和超声波处理时间对外植体损伤情况，由图中可以看出，G1(对照组)表型正常；G2(10s 20kHZ)与G1相似；G3(10s 40kHZ)无可见损伤，部分细胞轻微变形，细胞内部成分无变化，细胞间的空间轻微变形；G4(50s 20kHZ)有轻微损伤(红星，下同)，细胞壁轻微变形，体胚整体与G3无显著差异，可见胞间连丝(黄色箭头，下同)；G5(50s40kHZ)有小损伤，细胞壁中度变形，胞间间隙扩大，细胞成分无损伤，胞间连丝将相邻细胞的淀粉粒连接起来；G6(90s 20kHZ)体胚表面大量伤口，远轴面(Ab)和近轴面(Ad)损伤明显，可看到胶乳渗出，细胞壁及细胞成分均受致死变形，胞间排列变形，胞间连丝变弱；G7(90s 40kHZ)对外植体也表现出很高的致死性，远轴面(Ab)完全损坏，所有的细胞成分都从破碎的细胞壁扩散出去，胞间连丝混乱无序。
组织学分析证实，超声波频率为20kHZ(G2)和40kHZ(G3)时10s超声在外植体中没有明显的解剖学变化。超声波频率为20kHZ(G4)和40kHZ(G5)进行50s的超声波处理后在组织学上有明显变化。两组细胞表皮层均有轻微损伤，细胞间隙也有轻微损伤，但是G4和G5都没有发生严重的破坏。超声波频率为20kHZ(G6)和40kHZ(G7)超声波处理90秒后组织学分析上表明损伤明显。显微镜分析显示表皮层和其他细胞成分完全损伤。在40kHZ(G7)组中，损伤更为严重。可以清楚地看到，所有的细胞成分都通过破碎的细胞壁扩散出去。
将对照组和处理组进行次生体胚发生，以明确超声波处理对胚胎发生的影响。三次重复试验后，计算每次重复的体胚数、子叶型体胚数和出苗数。与未施超声波处理的对照组进行育苗效率比较。结果如图3、图4和图5所示。
图3为对照组(G1)和超声波处理最优组(G5，50s40kHZ)次生体细胞胚胎发生和幼苗再生情况；由图中可以看出，对照组仅在切口边缘诱导体胚(G1B)，超声波处理可在整个表皮诱导体胚(G5B)，在次生胚胎诱导率(图4)和SRJC扩繁率(图5)比其他试验组有明显优势。与对照相比，以50s40kHZ超声波处理体胚诱导率提高了14.55％，植株再生率提高了35.00％。而且，超声波处理诱导再生的植株在形态上和对照没有差异(图3，G1D和G5D)。
综上，本发明提供的技术方案技术简单、可行性好，尤其适用于大规模SRJC育苗生产过程，将大幅提高生产效率，降低生产成本，具有良好的经济效益。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一种通过超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的选取；
（2）对外植体超声波处理；
（3）愈伤组织诱导：将步骤（2）超声波处理后的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，进行培养；
（4）体胚诱导：将步骤（3）诱导培养的愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，进行培养，得到胚状体；
（5）植株诱导：将步骤（4）得到的成熟胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可得到橡胶树再生植株；
其中，步骤（1）中，所述外植体为增殖世代小于10代的成熟子叶形胚状体；
步骤（2）中，所述超声波处理方法为：将步骤（1）得到的外植体置于保护装置内，再将保护装置放置于超声波清洗机中，进行超声波处理；所述超声波处理条件为以20-40kHZ处理10-50 s。
2.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述愈伤组织诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加2,4-D 1-2mg/L，萘乙酸 0.5-1.5mg/L，激动素 1-2mg/L，天冬酰胺 0.3g/L，肌醇 0.1g/L，蔗糖 50-70g/L，椰子水5％ V/V，Phytagel 2.2g/L；调培养基的pH至5.8-6.2。
3.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述愈伤组织诱导培养条件为：
在24-28℃条件下，暗培养22-30d。
4.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述胚状体诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加6-苄基氨基嘌呤 0.5-2mg/L，细胞激动素 1-3mg/L，2,4-D 0.02-0.06mg/L，赤霉素 0.3-0.8mg/L，肌醇 0.1g/L，活性碳0.1％ W/V，蔗糖 50-70g/L，椰子水5％ V/V，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2。
5.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述体胚诱导培养条件为：
在24-28℃条件下，暗培养50-60d。
6.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述植株诱导培养基的成分为：
以MS培养基为基础培养基，附加细胞激动素 0.2-0.5mg/L，赤霉素2-3mg/L，吲哚乙酸0.1-0.3mg/L，肌醇 0.1g/L，活性碳0.1％ W/V，蔗糖 30-50g/L，椰子水5％V/V，Phytagel2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2。
7.如权利要求1所述超声波处理提高巴西橡胶树自根幼态无性系繁殖效率的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述植株诱导培养条件为：
在24-28℃，光源采用光源组合盒，所述光源组合盒由白光和红光的LED灯珠按7：1数量共组成84个LED灯珠，总光照强度为3500-3800Lux，光照周期为12/12h(光照/黑暗)的光照条件下培养40-50d。
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