CN110495394A - 一种百合卷丹茎段离体诱导珠芽形成的快速高效繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种百合卷丹茎段离体诱导珠芽形成的快速高效繁殖方法，步骤为：(1)种球的预冷处理；(2)茎的伸长培养；(3)茎段诱导珠芽形成、珠芽膨大和生根。其中所述的卷丹茎伸长培养基为：MS+蔗糖30g/L+琼脂5.0g/L；所述的珠芽诱导、膨大和生根培养基为：MS+6‑BA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.0g/L。本发明的卷丹离体诱导珠芽形成繁殖方法，伸长的茎可产生约20个以上的节部叶腋，每个叶腋能够形成2～3个珠芽，显著提高了卷丹的繁殖系数和效率。与自然条件下珠芽形成及鳞片直接诱导丛生芽再产生小鳞茎的过程相比，大大缩短了繁育周期，简化了步骤，具有重要的实际应用价值。

Description

一种百合卷丹茎段离体诱导珠芽形成的快速高效繁殖方法
技术领域
本发明属于花卉培养技术领域，涉及一种食用、药用百合卷丹(Liliumlancifolium)茎段离体诱导珠芽形成的快速高效繁殖方法。
背景技术
卷丹(Lilium lancifolium)，又名宜兴百合、虎皮百合，为百合科百合属多年生球根花卉(龙雅宜,张金政,张兰年.百合—球根花卉之王.北京:金盾出版社,1999.)。其花大色艳，抗性强，具有较高的观赏、食用和药用价值，也是优良的百合育种亲本(中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.第14卷.北京:科学出版社,1980.；国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京:中国医药科技出版社,2015.；Yu X R,Zhang J,Shao S S,etal.Morphological and physicochemical properties of bulb and bulbil starchesfrom Lilium lancifolium.Starch,2015,67:448-458.)。
卷丹为天然的三倍体，其主要通过鳞茎分球、鳞片扦插和地上茎叶腋处形成的珠芽进行繁殖(郑爱珍,张峰.百合的繁殖方法.北方园艺,2004,4:43.)。采用鳞片和小鳞茎进行营养繁殖，繁殖系数低，繁殖时间长，易受病虫害的侵害，经多代繁殖以后，常造成种性退化(邵春昕.西藏卷丹珠芽植株再生体系建立研究.北京:北京林业大学,2006.)。珠芽是卷丹特殊的无性繁殖器官，通常在地上茎的叶腋处形成，每株卷丹形成的珠芽数多达上百粒，且每个成熟的珠芽可自行从母体上脱落，长成一个新的独立个体(McRae E A.Lilies:aguide for growers and collectors.Portland:Timber press,1998.；Suh J K,Roh MS.New technique for cut flower production from bulbils of the Asiatic hybridlily(Lilium×elegans Thunb.).Scientia Horticulturae,2014,165:374-383.)。相比较鳞茎分球、鳞片扦插的无性繁殖方式，珠芽繁殖不仅繁殖系数高，且更为简便和高效。因此，采用珠芽对卷丹进行繁殖具有广阔的应用前景。然而，自然条件下，卷丹叶腋能否形成珠芽受环境影响较大，且珠芽形成和发育周期较长，严重影响了卷丹的繁殖效率。
植物组织培养技术是生命科学中重要的研究技术和手段之一。利用组织培养技术，可加快百合的繁殖速度，缩短百合籽球的生育周期，弥补种球繁育的不足，因而在百合商品化及产业化过程中被广泛应用(谭文澄,戴策刚.观赏植物组织培养技术.北京:中国林业出版社,1999.；赵庆芳,李巧峡,丁兰等.西伯利亚的组织培养和离体快繁.甘肃科学学报,2003,15(4):52-55.)。百合的组织培养常通过5种途径来实现。第一是器官型，即通过腋芽发育和不定芽的产生、形成丛生芽块的过程；第二是器官发生型，即外植体脱分化形成愈伤组织再分化出器官的方式；第三是胚状体发生型，即外植体按胚胎发生方式形成胚状体或先形成愈伤组织、再经愈伤组织形成胚状体再生植株的过程；第四是鳞茎型，即鳞片近轴面或在边缘直接形成带根的小鳞茎；第五是孢子型，即用成熟或未成熟的孢子进行培养(蒋细旺,司怀军.百合的组织培养技术综述.湖北农业科学,2004,(1):78-82.)。目前，卷丹上多采用鳞片为外植体，通过器官发生型和鳞片诱导籽球形成的鳞茎型来进行繁殖(马素娴,田志强,亢秀萍.山西野生卷丹百合鳞茎组织培养.山西农业科学,2012,40(4):319-321,377.；蒋瑶,陈文波,周增丽.野生卷丹不定芽诱导及再生体系的建立.贵州农业科学,2016,44(5):97-102.)，其他外植体及组培方法未见报道。
综上所述，如果能利用茎段组织培养方法诱导食用、药用百合卷丹珠芽形成，可显著提高卷丹的繁殖效率，从而为卷丹大规模繁殖及生产提供理论依据和技术指导。
发明内容
针对卷丹珠芽繁殖系数高的优势及自然条件下卷丹珠芽形成易受环境影响和繁育周期长的不足，本发明旨在提供一种食用、药用百合卷丹离体诱导珠芽形成的快速繁殖方法，以期缩短卷丹珠芽形成和培育时间，提高繁殖效率和繁殖系数。
一种百合卷丹茎段离体诱导珠芽形成的快速高效繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体的获得及表面灭菌：新收获的卷丹种球经基质包埋后于4℃冷库中进行冷藏，待萌芽至芽长9-10cm时，剥去鳞片，用双面刀片将茎芽自鳞茎基部切下，取长9-10cm，将叶片包裹的茎芽清洗干净，再表面灭菌；
(2)茎伸长培养：表面灭菌后，切去芽下端1-2cm的茎段，之后将芽接种于茎伸长培养基中，于25±1℃条件下进行暗培养；茎伸长培养10-12d后，节间明显可见；
(3)珠芽诱导、膨大和生根培养：切取带叶腋的茎段1.5cm，接种于珠芽诱导培养基中，于25±1℃，16h光照/8h黑暗光暗交替培养，诱导珠芽形成、使其膨大和生根；其中所述的珠芽诱导、膨大和生根培养基为：MS+6-BA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，PH 5.8；培养10d，叶腋处即可产生肉眼可见的白色点状珠芽结构，继续培养至30d，珠芽膨大，培养60d，珠芽直径增大，珠芽基部生成长约10-12mm的根；
(4)按常规方法移植。
所述步骤(1)中表面灭菌步骤：先用75％的酒精对茎芽灭菌30s，无菌水清洗一遍后再用10％的NaClO灭菌5min，最后用无菌水清洗4遍，每次5min。
所述表面灭菌是茎芽装入广口瓶中，于超净工作台上进行。
所述清洗步骤：叶片包裹的茎芽于流水下洗去基质，用洗洁精水清洗10min，流水下冲洗干净，直至不再有泡沫产生。
所述步骤(2)的中的茎伸长培养基为：MS+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，PH 5.8；
所述步骤(2)的培养是在试管中培养。
本发明提供的食用、药用百合卷丹带叶腋茎段离体诱导产生珠芽的快速繁殖方法有以下优点：
(1)叶腋可以稳定形成珠芽。离体环境可控性强，较自然条件下珠芽的形成更为稳定。
(2)提高了繁殖系数。卷丹伸长的茎可产生20个以上带叶腋的茎段，每个带叶腋的茎段又可以形成2-3个珠芽。与自然条件下珠芽形成及其他百合腋生籽球形成相比，繁殖系数显著提高(表1)。
(3)缩短了培育时间。自然条件下珠芽的形成及传统的鳞片诱导鳞茎需要较长的时间，而带叶腋茎段离体诱导直接产生的珠芽，大小均匀，整齐一致，诱导培养10天即产生肉眼可见的珠芽结构，30天珠芽的直径达5-7mm。诱导珠芽形成过程中可直接在珠芽基部产生较长的根，不需要专门的诱导生根阶段。
附图说明
图1为实施例中卷丹茎的伸长培养，
其中a为种球萌芽，b为茎芽，c为茎伸长培养10d后茎芽；
图2为卷丹珠芽诱导培养0d和30d，
其中a为带叶腋的茎段诱导培养0d，b为茎段诱导培养30d；
图3为诱导培养30d的卷丹珠芽(解剖镜下观察)，
其中a为诱导培养30d的卷丹珠芽(正视图)，b为诱导培养30d的卷丹珠芽(俯视图)；
图4为诱导培养60d生根的卷丹珠芽(解剖镜下观察)，
其中a为诱导培养60d生根的卷丹珠芽，b为诱导培养60d的卷丹珠芽(单个)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1一种百合卷丹茎段离体诱导珠芽形成的快速高效繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体的获得及表面灭菌：新收获的卷丹种球经基质包埋后于4℃冷库中进行冷藏，待萌芽至芽长10cm(图1a)时，剥去鳞片，用双面刀片将茎芽自鳞茎基部切下，取长10cm，叶片包裹的茎芽(图1b)流水下洗去基质，用洗洁精水清洗10min，流水下冲洗干净，直至不再有泡沫产生，之后装入广口瓶中，于超净工作台上进行表面灭菌。表面灭菌：先用75％的酒精对茎芽灭菌30s，无菌水清洗一遍后再用10％的NaClO灭菌5min，最后用无菌水清洗4遍，每次5min。
(2)茎伸长培养：表面灭菌后，切去芽下端1-2cm的茎段，之后将芽接种于茎伸长培养基中，于25±1℃条件下进行暗培养。其中所述的茎伸长培养基为：MS+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，PH 5.8。茎伸长培养10d后茎芽伸长至试管顶部，节间明显可见(图1c)，即可切取茎段进行珠芽诱导培养。
(3)珠芽诱导、膨大和生根培养：切取带叶腋的茎段1.5cm(图2a)，接种于珠芽诱导培养基中，于25±1℃，光暗交替(16h光照/8h黑暗)培养，诱导珠芽形成、使其膨大和生根。其中所述的珠芽诱导、膨大和生根培养基为：MS+6-BA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，PH5.8。培养10d，叶腋处即可产生肉眼可见的白色点状珠芽结构，继续培养至30d，珠芽膨大，直径达5-7mm(图3)，培养60d，直径达10mm，珠芽基部可生成长约11.5mm的根(图4)。
表1百合珠芽形成情况比较
(4)移植
按常规方法移植。

Claims (6)

1.一种百合卷丹茎段离体诱导珠芽形成的快速高效繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体的获得及表面灭菌：新收获的卷丹种球经基质包埋后于4℃冷库中进行冷藏，待萌芽至芽长10-12cm时，剥去鳞片，用双面刀片将茎芽自鳞茎基部切下，取长10-12cm，将叶片包裹的茎芽清洗干净，再表面灭菌；
(2)茎伸长培养：表面灭菌后，切去芽下端1-2cm的茎段，之后将芽接种于茎伸长培养基中，于25±1℃条件下进行暗培养；茎伸长培养10-12d后，节间明显可见；
(3)珠芽诱导、膨大和生根培养：切取带叶腋的茎段1.5cm，接种于珠芽诱导培养基中，于25±1℃，16h光照/8h黑暗光暗交替培养，诱导珠芽形成、使其膨大和生根；其中所述的珠芽诱导、膨大和生根培养基为：MS+6-BA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，PH 5.8；培养10d，叶腋处即可产生肉眼可见的白色点状珠芽结构，继续培养至30d，珠芽膨大，培养60d，珠芽直径增大，珠芽基部生成长约10-12mm的根；
(4)按常规方法移植。
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)中表面灭菌步骤：先用75％的酒精对茎芽灭菌30s，无菌水清洗一遍后再用10％的NaClO灭菌5min，最后用无菌水清洗4遍，每次5min。
3.根据权利要求2所述的方法，所述表面灭菌是茎芽装入广口瓶中，于超净工作台上进行。
4.根据权利要求1所述的方法，所述清洗步骤：叶片包裹的茎芽于流水下洗去基质，用洗洁精水清洗10min，流水下冲洗干净，直至不再有泡沫产生。
5.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(2)的茎伸长培养基为：MS+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，PH 5.8。
6.根据权利要求5所述的方法，所述步骤(2)的培养是在试管中培养。
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