CN112493137B - 一种黄荆试管苗快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种黄荆试管苗快速繁殖方法，包括以下步骤：步骤1：黄荆外植体的准备及无菌系的建立；步骤2：黄荆外植体愈伤组织诱导；步骤3：黄荆愈伤组织不定芽的增殖；步骤4：黄荆试管苗的生根；步骤5：黄荆生根试管苗的移栽。最佳愈伤组织诱导培养基为MS+TDZ 1.5μM+NAA 0.6μM，出愈率为53.33％；最佳不定芽增殖培养基为MS+6‑BA 1.2μM+NAA 0.6μM，增殖系数为3.35。最佳生根培养基为1/2MS+IAA 1.2mg/L+IBA 1.2mg/L，生根率为100％。

Description

一种黄荆试管苗快速繁殖方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种黄荆试管苗快速繁殖方法。

背景技术

黄荆(Vitex negundo L.)又名布荆、五指柑、五指风、埔姜仔、埔姜，马鞭草科牡荆属落叶灌木或小乔木。我国常见于长江以南地区、北达秦岭淮河；山东亦有分布；国外分布于非洲东部经马达加斯加、亚洲东南部及南美洲的玻利维亚等。黄荆具有止咳、祛痰及缓解支气管痉挛的作用，主治感冒、咳嗽,哮喘,风痹、疟疾、胃痛、疝气、痔漏。黄荆叶清热解表、利湿解毒,主治感冒、中暑、吐泻、痢疾、疟疾、黄疸、风湿、跌打肿痛、疮痛疥癣,并能防止甲醛性关节炎肿胀的发展。黄荆籽、黄荆根煎剂对金黄色葡萄球菌和卡他球菌均有抑制作用，黄荆亦被日本医药界确认为有效的中草药，有祛痰、滋补等功能。我国《本草纲目》、《全国中草药汇编》等记载其果实(黄荆籽)及根、茎、叶均可入药，但极少地区利用，唯客家人有利用习俗。至今，梅州等地客家地区仍习惯以其果实做枕头，以其叶代茶待客或馈赠亲友。已有商家以黄荆为材料开发出系列产品，行销海内外。此外，黄荆还是优良的护坡绿化与水土保持树种、蜜源植物、芳香驱虫植物、纤维植物及盆景制作材料，具有广泛而重要的利用价值和巨大的开发前景。

要加速黄荆的开发利用，首先要能加速培养性质优良的黄荆苗。就目前而言，可以利用快速繁殖技术对黄荆进行培养。植物的快速繁殖技术就是利用组织培养方法将植物体某一部分的组织小块进行培养，并诱导分化成大量的小植株，而达到快速无性繁殖的目的，其特点是繁殖速度快，周期短，不受季节、气候、自然灾害等因素的影响，利用这种技术可以解决药用植物繁殖能力低、资源匾乏等诸多问题，保护物种资源。同时，也由于植物中有很多都带有病毒，严重影响植物的产量和品质，给农业带来灾害。若利用组织培养法进行培养，再生的植株有可能不带病毒，从而获得脱病毒的苗，再用这种苗进行繁殖，则种植的植物就不会或极少发生病毒病。

梅州地处广东省东北部，为亚热带季风气候区，夏长冬短，气温高，雨季长，光照充足，雨量充沛，为各种野生资源植物的生长提供了较优越的气候条件。黄荆在梅州分布较为普遍，常生于山坡、路旁和村寨旁，梅州客家人在酿酒时会利用黄荆进行灭菌，也会采集黄荆子制成睡枕，但黄荆还没有在梅州形成大规模种植利用。

发明内容

本发明旨在研发一种黄荆试管苗快速繁殖方法，为生产大量优质黄荆苗提供理论依据和技术路线，促进黄荆的人工种植和黄荆林的培育，推动黄荆的综合开发利用及其系列产品的大规模生产与深度开发。

本发明采用的技术方案：

一种黄荆试管苗快速繁殖方法，包括以下步骤：

步骤1：黄荆外植体的准备及无菌系的建立

步骤2：黄荆外植体愈伤组织诱导

将步骤1截取好的无菌外植体接种于诱导培养基上，该诱导培养基配方为：基础培养基为MS，添加0.2～0.6μMNAA，0.5～1.5μMTDZ，添加30g/L蔗糖，9g/L琼脂，pH为5.8；培养温度为25±2℃，光照12h·d-1，光强2000lx，观察其愈伤组织的诱导情况；

步骤3：黄荆愈伤组织不定芽的增殖

将诱导培养基上没有发生褐变和污染的愈伤组织转接至分化培养基上，该分化培养基配方为：基础培养基为MS，添加0.8～1.2μM6-BA，0.3～0.7μM NAA，添加30g/L蔗糖，9g/L琼脂，pH为5.8；培养温度为25±2℃，光照12h·d-1，光强2000lx，观察其不定芽增殖情况；

步骤4：黄荆试管苗的生根

将诱导分化出的试管苗切成2～3cm，接种于1/2MS生根培养基上，在培养基中分别添加1.0～1.5mg/LIAA，1.0～1.5mg/L IBA，添加20g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.8；培养温度为25±2℃，光照12h·d-1，光强2000lx；

步骤5：黄荆生根试管苗的移栽

待试管苗根长2cm～4cm左右时，在温室自然光下打开瓶盖炼苗2d～3d，然后将瓶苗小心地取出，洗净根部残留的培养基，即可进行移栽。

优选的，在上述步骤1中，黄荆外植体的准备过程如下：

选长4cm～8cm长的较嫩的黄荆枝条，用剪刀将腋芽两侧的叶柄去除，留下只剩腋芽的茎段。

优选的，在上述步骤1中，黄荆外植体无菌系的建立过程如下：

(1)将准备的黄荆外植体用浓度为5％的洗衣粉水浸泡5min后，用自来水将外植体洗干净，置于流水下冲洗60min；

(2)接着在超净工作台用浓度70％的酒精浸泡5S，无菌水冲洗3遍，再用0.1％的HgCl2溶液消毒4min，无菌水冲洗5次，每次1min；

(3)将完成消毒的外植体置于铺有已灭菌的滤纸的无菌培养皿中，用解剖刀截取无菌的黄荆枝条的腋芽部分，每段长0.5cm～1cm。

优选的，在步骤S2中，诱导培养基的配方为MS+1.5μM TDZ+0.6μMNAA+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH为5.8。

优选的，在步骤S3中，分化培养基配方为MS+1.2μM6-BA+0.6μM NAA+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH为5.8。

优选的，在步骤S4中，生根培养基配方为1/2MS+1.2mg/LIAA+1.2mg/L IBA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH为5.8。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以以黄荆幼嫩茎段的腋芽节段为外植体进行愈伤组织诱导、增殖以及生根培养。最佳愈伤组织诱导培养基为MS+TDZ 1.5μM+NAA 0.6μM，出愈率为53.33％；最佳不定芽增殖培养基为MS+1.2μM6-BA+0.6μM NAA，增殖系数为3.35。最佳生根培养基为1/2MS+1.2mg/LIAA+1.2mg/LIBA，生根率为100％。

附图说明

图1为黄荆腋芽节段的愈伤组织；

图2为黄荆不定芽的增殖，A表示在MS+6-BA 1.2μM+NAA 0.5μM培养基的增殖芽；B表示在MS+6-BA 1.2μM培养基的增殖芽；C在在MS培养基的增殖芽；

图3为不同培养基下黄荆试管苗的生根状况；A为1/2MS+IAA 1.2μM；B为1/2MS+IBA1.2μM；C为1/2MS+IAA 1.2μM+IBA 1.2μM。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明具体提供了一种黄荆试管苗快速繁殖方法，包括以下步骤：

步骤1：黄荆外植体的准备及无菌系的建立

步骤2：黄荆外植体愈伤组织诱导

将步骤1截取好的无菌外植体接种于诱导培养基上，该诱导培养基配方为：基础培养基为MS，添加0.2～0.6μMNAA，0.5～1.5μMTDZ，添加30g/L蔗糖，9g/L琼脂，pH为5.8；培养温度为25±2℃，光照12h·d-1，光强2000lx，观察其愈伤组织的诱导情况；诱导时间为接种培养后第7天至12天。

步骤3：黄荆愈伤组织不定芽的增殖

将诱导培养基上没有发生褐变和污染的愈伤组织转接至分化培养基上，该分化培养基配方为：基础培养基为MS，添加0.8～1.2μM6-BA，0.3～0.7μM NAA，添加30g/L蔗糖，9g/L琼脂，pH为5.8；培养温度为25±2℃，光照12h·d-1，光强2000lx，观察其不定芽增殖情况；培养时间为继代培养后第5至7天。

步骤4：黄荆试管苗的生根

将诱导分化出的试管苗切成2～3cm，接种于1/2MS生根培养基上，在培养基中分别添加1.0～1.5mg/LIAA，1.0～1.5mg/L，添加20g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.8；培养温度为25±2℃，光照12h·d-1，光强2000lx；培养时间为生根培养后第10至15天。

步骤5：黄荆生根试管苗的移栽

待试管苗根长2cm～4cm左右时，在温室自然光下打开瓶盖炼苗2d～3d，然后将瓶苗小心地取出，洗净根部残留的培养基，即可进行移栽。

在上述步骤1中，黄荆外植体的准备过程如下：选长4cm～8cm长的较嫩的黄荆枝条，用剪刀将腋芽两侧的叶柄去除，留下只剩腋芽的茎段。

在上述步骤1中，黄荆外植体无菌系的建立过程如下：

(1)将准备的黄荆外植体用浓度为5％的洗衣粉水浸泡5min后，用自来水将外植体洗干净，置于流水下冲洗60min；

(2)接着在超净工作台用浓度70％的酒精浸泡5S，无菌水冲洗3遍，再用0.1％的HgCl2溶液消毒4min，无菌水冲洗5次，每次1min；

(3)将完成消毒的外植体置于铺有已灭菌的滤纸的无菌培养皿中，用解剖刀截取无菌的黄荆枝条的腋芽部分，每段长0.5cm～1cm。

下面结合上述制备方法，研究其试管苗培育技术。

1.实验材料

1.1材料

试验材料为黄荆茎段的腋芽，采自广东省梅州市梅江区嘉应学院生命科学学院资源引种驯化园内。选择当年生、发育充实且生长健壮，腋芽饱满、粗壮适中无病害的较嫩的黄荆枝条。将采来的黄荆枝条进行修剪。

1.2实验仪器

FA1640A普析通用仪器电子分析天平：上海精天电子仪器厂。

DHG-9246型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

果树修剪刀、标签纸、烧杯(100mL、500mL、1000mL)、玻璃棒、电炉、石棉网、锥形瓶(50mL、250mL)、培养皿(35mm)、移液管(1mL、5mL、10mL)、容量瓶(500mL)、镊子、解剖刀、胶头滴管、精密pH试纸、吹吸球、纱布、棉花、牛皮纸、棉线、保鲜膜。

1.3实验药品

NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、KI、H₃BO₃、MnSO₄·

4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MoO₄·2H2O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、FeSO₄·7H₂O、Na₂-EDTA·2H₂O、肌醇、ⅣB烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸、琼脂条、蔗糖、NaOH、6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、TDZ(噻二唑苯基脲)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚-3-乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、HgCl₂、酒精。

2.实验方法

2.1黄荆外植体的准备及无菌系的建立

选长4cm～8cm长的较嫩的黄荆枝条，用剪刀将腋芽两侧的叶柄去除，留下只剩腋芽的茎段。用浓度为5％的洗衣粉水浸泡5min后，用自来水将外植体洗干净，置于流水下冲洗60min。接着在超净工作台用浓度70％的酒精浸泡5S，无菌水冲洗3遍，再用0.1％的HgCl2溶液消毒4min，无菌水冲洗5次，每次1min。将完成消毒的外植体置于铺有已灭菌的滤纸的无菌培养皿中，用解剖刀截取无菌的黄荆枝条的腋芽部分，每段长约0.5cm～1cm，接种在培养基上。每个处理10个培养基，每个培养基上接种一个腋芽茎段，重复3次。

2.2黄荆外植体愈伤组织和诱导

将截取好的无菌外植体接种于诱导培养基上，基本培养基为MS，培养基添加30g/L蔗糖，9g/L的琼脂。添加不同浓度的NAA(0.2μM、0.4μM、0.6μM)和TDZ(0.5μM、1μM、1.5μM)组合(表1所示)，pH为5.8。培养温度为25±2℃，光照12h·d^-1，光强2000lx左右，观察其愈伤组织的诱导情况。

表1培养基成分

2.3黄荆愈伤组织不定芽的增殖

将诱导培养基上没有发生褐变和污染的愈伤组织转接于分化培养基上：以不加任何激素的MS培养基为对照，在培养基中添加单独添加6-BA 1.2μM、另外一种培养基添加6-BA 1.2μM和NAA 0.6μM组合。添加30g/L蔗糖，9g/L的琼脂，pH为5.8。培养温度为25±2℃，光照12h·d^-1，光强2000lx左右，观察其不定芽增殖情况。

2.4黄荆试管苗的生根

将诱导分化出的试管苗切成2-3cm左右，接种于1/2MS生根培养基上，在培养基中分别添加浓度相同的IAA 1.2mg/L、IBA 1.2mg/L、IAA 1.2mg/L+IBA 1.2mg/L。调查其生根率及根的生长情况。以上的1/2MS培养基中大量元素减半和微量元素不变，培养基添加蔗糖20g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。培养温度为25±2℃，光照12h·d^-1，光强2000lx左右。

2.6评价指标

外植体接种到诱导培养基上之后，每天进行观察，记录每个组合最早长出愈伤组织的天数及愈伤组织的生长情况。愈伤组织转接于分化培养基上后，每天进行观察，观察愈伤组织的变化情况、最早长出芽的时间及芽的生长速度、数目和长度。诱导分化出的试管苗接种于1/2MS生根培养基上后，观察在不同激素下最早长出根所需的天数、根的数目和长度。

出愈率＝出愈外植体数/接种外植体数×100％

污染率＝污染外植体数/接种外植体数×100％

褐化率＝褐化外植体数/接种外植体数×100％

增殖系数＝增殖的丛生芽数/接种芽数

生根率＝生根个数/接种个数×100％

2.7数据的统计与分析

用Mirosoft Office Excel 2003进行数据的初步处理和作图。用SPSS数据处理软件系统进行单因素方差分析。

3.结果与分析

3.1黄荆外植体愈伤组织的诱导

3.1.1不同培养基对黄荆愈伤组织长势的影响

表2不同培养基对黄荆愈伤组织长势的影响

附注：“++++”表示长势最好；“+++”表示长势较好；“++”表示长势好；“+”表示长势一般。

将已消毒的外植体分别横放接种于诱导培养基上，由表2可知，在诱导的第7天开始有愈伤组织出现。接种于培养基上的外植体两端先慢慢膨胀变大，继而出现了愈伤组织。到了第12天，绝大多数外植体都诱导出愈伤组织。不同的培养基上愈伤组织的颜色和形态不一样，当TDZ的浓度从0.5μM上升到1.0μM时，愈伤组织的颜色越来越偏向于黄绿偏白色，愈伤组织也越来越疏松，同时，愈伤组织的腋芽部分有少许的不定芽出现，30d后，每个茎段腋芽部分的芽点长出1-2个不定芽，长约为0.2-0.5cm(如图1)。当TDZ的浓度上升到1.5μM时，愈伤组织分化的不定芽数目普遍较多，基本能达到两个或以上。实验表明，当TDZ的浓度为0.5μM时，愈伤组织无法分化出不定芽，也就是说，当TDZ浓度较低时，无法诱导出不定芽。当TDZ的浓度上升到1.0μM时，愈伤组织开始诱导出不定芽，TDZ的浓度为1.5μM时，诱导出的不定芽较多。

诱导培养基中A1(MS+TDZ0.5μM+NAA0.2μM)愈伤组织的长势较为一般，诱导培养基A2(MS+TDZ0.5μM+NAA0.4μM)、A4(MS+TDZ1.0μM+NAA0.2μM)、A5(MS+TDZ1.0μM+NAA0.4μM)、A8(MS+TDZ1.5μM+NAA0.4μM)的愈伤组织长势好，诱导培养基A3(MS+TDZ 0.5μM+NAA0.6μM)、M6(MS+TDZ1.0μM+NAA0.6μM)、A7(MS+TDZ1.5μM+NAA0.2μM)中愈伤组织长势较好，诱导培养基A9(MS+TDZ1.5μM+NAA0.6μM)的愈伤组织长势最好。由此可见，当NAA的浓度为0.6μM时，愈伤组织的长势普遍较好，其中MS+TDZ1.5μM+NAA0.6μM的培养基对愈伤组织的诱导效果最好，出现不定芽的数目也是最多的，愈伤组织的长势是TDZ和NAA共同作用的结果。

3.1.2不同培养基对黄荆愈伤组织出愈率、污染率、褐化率的影响

由表3可以看出，在愈伤组织诱导过程中污染率相对来说比较高，培养基A5(MS+TDZ1.0μM+NAA0.4μM)中，污染率高达73.33％。A7(MS+TDZ1.5μM+NAA0.2μM)培养基中污染率最低，为26.67％。其余培养基的污染率基本在40％-60％之间。平均污染率为50％。

而诱导培养基中褐化率对于污染率来说相对较低，褐化率最高的是A2(MS+TDZ0.5μM+NAA0.4μM)培养基，为33.33％，褐化情况较为严重，其次为A7(MS+TDZ1.5μM+NAA0.2μM)培养基，褐化率为30％。在A5(MS+TDZ1.0μM+NAA0.4μM)培养基中褐化率为0，没有出现褐化现象，但是污染率最高。平均褐化率为15.18％。

在不同初代诱导培养基上出愈率差异较大，A9(MS+TDZ1.5μM+NAA0.6μM)的出愈率最高，达到53.33％，且其褐化率低，仅3.33％。其次为A7(MS+TDZ 1.5μM+NAA0.2μM)，为43.33％，且其污染率为最低。A3(MS+TDZ0.5μM+NAA0.6μM)中出愈率最低，仅有20％。平均出愈率为33.7％。因此，在初代愈伤组织的诱导中，诱导效果最好的为A9(MS+TDZ1.5μM+NAA0.6μM)，其外植体的出愈率最高，并且愈伤组织的长势最好。

表3培养基对黄荆愈伤组织诱导率的影响

注：同列数字后不同小写字母表示在0.05水平有显著差异。

3.2继代增殖培养

3.2.1不同培养基对不定芽增殖的影响

初代培养得到不定芽后需要进一步继代增殖才能得到大量的小苗。将初代培养诱导的愈伤组织接种到不定芽的增殖培养基B1(MS)、B2(MS+6-BA1.2μM)、B3(MS+6-BA1.2μM+NAA0.6μM)，20d后的统计结果。

由表4可知，诱导不定芽增殖的最适宜培养基为B3(MS+6-BA1.2μM+NAA0.6μM)，其增殖速度最快，增殖的不定芽的数目最多，芽的平均长度最长。B3培养基中不定芽的颜色为绿色，芽的节点较长，长势良好(如图2-A)。接种于培养基B2中的愈伤组织块不定芽生长速度慢，增殖倍数小，不定芽的颜色为绿色，芽的长度较短(图2-B)。在B1培养基上愈伤组织块增大幅度比B2、B3培养基上的愈伤组织块小，当愈伤组织块增大到一定程度之后便开始发生褐变，初代生长出的不定芽也开始变黑最后枯萎(图2-C)。由此可以看出，在没有添加任何激素的MS培养基上并不能使不定芽增殖，当在培养基添加6-BA1.2μM，在一定程度上能促进不定芽的增殖，但其效果并不理想。当在添加6-BA1.2μM的基础上添加NAA0.6μM，在NAA和6-BA的相互作用下，不定芽的增殖效果得到明显的改善，增殖速度增快，不定芽的长度和数量也增加。

表4不同培养基对黄荆不定芽增殖的影响

注：同列数字后不同小写字母表示在0.05水平有显著差异。

3.2.2切取不定芽后对黄荆二次不定芽增殖的影响

研究切取不定芽后愈伤组织块第二代不定芽的再生情况，以B3培养基上长势良好的不定芽为实验对象，当不定芽生长到一定长度时，将不定芽从愈伤组织块分离，把已经切去不定芽的愈伤组织块接种到新的B3培养基中，结果发现愈伤组织块仍然能长出不定芽。在15个实验对象中，有66.67％的愈伤组织块能分化出新的不定芽，但是新长出的第二代不定芽数目减少，增殖系数减少为2.15，芽的平均长度也变短，为2.58cm。第二代不定芽的叶片数目也有所下降。而剩下的没有诱导出第二代不定芽的愈伤组织块均发生褐变。由此可以得出，愈伤组织块的不定芽被切取后仍有一定的再生能力，对不定芽进行增殖培养时可对愈伤组织块进行重复利用，以诱导出更多的不定芽。

3.3不同培养基对黄荆试管苗生根的影响

将继代培养长出的不定芽剪取2-3cm接种到生根培养基上，以1/2MS为基本培养基，附加有不同激素配比的培养基均能诱导黄荆试管苗生根。在接种7天左右，黄荆试管苗的下端逐渐膨大，开始生根。30天后的统计结果，绝大部分的黄荆试管苗已经生根，试管苗上的叶片也有所增大和增加。

由表4可知，C1(1/2MS+IAA1.2mg/L)的生根率最低，为80％，有少许试管苗并没有分化生长出根，其根的长度最短，平均根长仅有0.94cm，根的数目也少。但其根较为粗壮，二级根却比较少(图3-A)。C3(1/2MS+IAA1.2mg/L+IBA1.2mg/L)培养基的生根率最高，达到100％，没有发生任何污染现象。其平均根的长度最长，为3.47cm，最长根可达到8.0cm，平均根的数目最多，可达到约6.8条，该培养基诱导出来的根长势良好，根最为粗壮，数目也多，根系生长最好，二级根数目多，有利于根系对水分和矿物质的吸收(图3-C)。C2(1/2MS+IBA1.2mg/L)培养基的生根率仅次于C3，有一个培养基出现了污染现象。其根的数量也较多，与C3培养基诱导出来根的数目的差异并不显著。但是其根的平均长度比C3培养基的根短，根也较为细弱，二级根也较少(图3-B)。因此，黄荆试管苗的最适生根培养基为1/2MS+IAA1.2mg/L+IBA1.2mg/L。

表5不同培养基对黄荆试管苗生根的影响

注：同列数字后不同小写字母表示在0.05水平有显著差异。

4讨论

4.2 TDZ和NAA不同的激素配比对黄荆愈伤组织诱导的影响

在上述实验过程中，不同质量分数TDZ+NAA组合都可以诱导出愈伤组织，但是获得的愈伤组织色泽与质地有差异。TDZ+NAA组合大多数能诱导出不定芽，当TDZ浓度较低时，无法诱导出不定芽。当TDZ的浓度上升时，能诱导出不定芽。这表明一定浓度的TDZ能促进不定芽的分化。NAA对愈伤组织的长势也起着重要作用，从实验结果上看，NAA0.6μM的愈伤组织长势普遍较好，可以看出一定浓度的NAA对愈伤组织的诱导有促进作用。在上述实验中，在TDZ和NAA的共同作用下，TDZ 1.5μM+NAA 0.6μM组合的愈伤组织诱导率最高，诱导出的愈伤组织呈现黄绿带白色，质地疏松，较轻易分化出不定芽，诱导效果较好。

4.3 NAA和6-BA对黄荆不定芽增殖的影响

本实验在6-BA 1.2μM和NAA 0.6μM的共同作用下诱导不定芽，不定芽的增殖效果较好。6-BA与生长素配比能促进芽的产生。

4.4 IAA和IBA对黄荆试管苗生根的影响

本实验结果表明，IAA和IBA均能诱导黄荆试管苗生根，但其结果有一定的差异。IAA 1.2mg/L能使黄荆试管苗的根系较为粗壮，但根的数目少且长度短。IBA 1.2mg/L诱导出的黄荆试管苗的根的数目较多且长度较长，但其根并没有IAA 1.2mg/L诱导出来的粗壮，相对来说比较细小。在IAA1.2mg/L+IBA 1.2mg/L的共同作用下，诱导出来的根系结合了IAA和IBA单独诱导时的优点，诱导出来的根粗壮，数目多，长度较长，二级根数目也多，有利于黄荆摄取养分，更好地生长。

1.愈伤组织的诱导：适合黄荆腋芽节段愈伤组织诱导的培养基为MS+TDZ 1.5μM+NAA 0.6μM，出愈率为53.33％，一定浓度的TDZ能促进初代培养中不定芽的分化。

2.不定芽的增殖：适合黄荆不定芽的增殖的培养基是MS+6-BA 1.2μM+NAA 0.6μM，增殖系数为3.35。细胞分裂素6-BA和生长素NAA共同作用能促进不定芽的增殖，增加不定芽的数目和长度。

3.不定芽的增殖：适合黄荆不定芽的增殖的培养基是MS+6-BA1.2μM+NAA0.2μM，增殖系数为3.35。细胞分裂素6-BA和生长素NAA共同作用能促进不定芽的增殖，增加不定芽的数目和长度。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (4)

1.一种黄荆试管苗快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：黄荆外植体的准备及无菌系的建立

步骤2：黄荆外植体愈伤组织诱导

将步骤1截取好的无菌外植体接种于诱导培养基上，该诱导培养基配方为：基础培养基为MS，添加0.2～0.6µMNAA，0.5～1.5µM TDZ，添加30g/L蔗糖，9g/L琼脂，pH为5.8；培养温度为25±2℃，光照12 h•d-1，光强2000lx，观察其愈伤组织的诱导情况；

步骤3：黄荆愈伤组织不定芽的增殖

将诱导培养基上没有发生褐变和污染的愈伤组织转接至分化培养基上，该分化培养基配方为：基础培养基为MS，添加0.8～1.2µM6-BA，0.3～0.7µM NAA，添加30g/L蔗糖，9g/L琼脂，pH为5.8；培养温度为25±2℃，光照12 h•d-1，光强2000lx，观察其不定芽增殖情况；

步骤4：黄荆试管苗的生根

将诱导分化出的试管苗切成2～3cm，接种于1/2MS生根培养基上，在培养基中分别添加1.0～1.5mg/L IAA，1.0～1.5 mg/L IBA，添加20g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.8；培养温度为25±2℃，光照12 h•d-1，光强2000lx；

步骤5：黄荆生根试管苗的移栽

待试管苗根长2 cm～4cm时，在温室自然光下打开瓶盖炼苗2d～3d，然后将瓶苗小心地取出，洗净根部残留的培养基，即可进行移栽；

在上述步骤1中，黄荆外植体的准备过程如下：

选长4cm～8cm长的较嫩的黄荆枝条，用剪刀将腋芽两侧的叶柄去除，留下只剩腋芽的茎段；

在上述步骤1中，黄荆外植体无菌系的建立过程如下：

（1）将准备的黄荆外植体用浓度为5%的洗衣粉水浸泡5min后，用自来水将外植体洗干净，置于流水下冲洗60min；

（2）接着在超净工作台用浓度70%的酒精浸泡5S，无菌水冲洗3遍，再用0.1%的HgCl2 溶液消毒4min，无菌水冲洗5次，每次1min；

（3）将完成消毒的外植体置于铺有已灭菌的滤纸的无菌培养皿中，用解剖刀截取无菌的黄荆枝条的腋芽部分，每段长0.5 cm～1cm。

2.在根据权利要求1所述的一种黄荆试管苗快速繁殖方法，其特征在于，在步骤S2中，诱导培养基的配方为MS+1.5µM TDZ+0.6µMNAA+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH为5.8。

3.根据权利要求1所述的一种黄荆试管苗快速繁殖方法，其特征在于，在步骤S3中，分化培养基配方为MS+1.2µM6-BA +0.6µM NAA+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH为5.8。

4.根据权利要求1所述的一种黄荆试管苗快速繁殖方法，其特征在于，在步骤S4中，生根培养基配方为1/2MS+1.2mg/L IAA +1.2 mg/L IBA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH为5.8。

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