CN105532452B - 一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法,包括如下步骤:(1)以欧亚瑞香优质种子为外植体进行消毒;(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中培养诱导出芽;(3)将无菌芽置于MS基本培养基中,经继代增殖培养后长成丛生芽;(4)将丛生芽剪切成单芽置于壮苗生根培养基中培养得到完整的带根苗。采用本发明能促进欧亚瑞香种苗的繁殖速度,种子原生苗不易发生退化,保证种苗质量。为进一步开展该物种的研究提供优质种源,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物种子诱导及快速繁殖的方法,特别是一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法。
背景技术
瑞香科植物分布于世界各地,产于欧洲、亚洲西部。有67属约1200种,其中瑞香属(Daphne genus)有95种,我国有52种,全国均有分布。自20世纪70年代初,人们从瑞香属植物中分离出具有抗肿瘤活性的欧亚瑞香素(mezerein)和瑞香毒素(daphnotoxin)后,该属植物便成为一个研究热点。欧亚瑞香(Daphne mezereum L.)株型优美、四季常青,在冬天和早春开花且香味浓郁,深受园艺爱好者的青睐,被视为很珍贵的植物;欧洲用瑞香树皮制的膏药做辛辣剂、刺激剂、康复药;法国用果实做黑胡椒的代用品。欧亚瑞香种子繁殖或扦插繁殖存活率不高且生长缓慢,较难满足市场需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法,能够促进欧亚瑞香种苗的繁殖速度,种子原生苗不易发生退化,保证种苗质量,为进一步开展该物种的研究提供优质种源。
本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法,包括以下步骤:
(1)外植体的消毒:将2~5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中,取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min,用纱布擦洗种子表面污垢,线状自来水冲洗5min~10min,在超净工作台内用75v/v%的乙醇灭菌30S,无菌水冲洗1次,再用0.1v/v%HgCl2消毒12min,无菌水冲洗3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分,获得外植体,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水;
(2)无菌芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中,在培养温度为23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下培养20~30d开始萌发,得到无菌芽,所述启动培养基是以MS为基本培养基,还加入0.5~2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0~1.0mg/L的萘乙酸NAA,0.05~1.5mg/L的赤霉素GA3,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)无菌芽的增殖:将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1~2cm长接种于MS增殖培养基中,在培养温度为23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下培养15~20d便长出更多的芽丛,所述增殖培养基为MS基本培养基,添加0.1~2.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5~2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05~1.0mg/L的吲哚乙酸IBA,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(4)无菌苗的壮苗生根:将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行生根培养,培养10~25d开始生根,所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基,还加入0~1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3~1.5mg/L的萘乙酸NAA、0~1.5g/L的活性炭,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
本发明的突出优点在于:
(1)采用生物技术方法实现了欧亚瑞香种子诱导和快速繁殖。该方法能促使种子较早萌发并提高了诱导率,缩短组培苗生长周期,降低组织培养成本,提高组培苗的质量。
(2)采用本发明所述的方法培养20d能够诱导出芽,芽诱导率达最高达89.1%,培养30d,增殖系数为4.9,生根率为84.8%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例1
本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法一个实例,包括如下步骤:
(1)外植体的消毒:将2~5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中,取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min,用纱布擦洗种子表面污垢,线状自来水冲洗5min~10min,在超净工作台内用75v/v%的乙醇灭菌30S,无菌水冲洗1次,再用0.1v/v%HgCl2消毒12min,无菌水冲洗3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分,获得外植体,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)无菌芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行培养,培养30d开始萌发,得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基,还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的萘乙酸NAA,0.05mg/L的赤霉素GA3,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,芽诱导率为69.6%。
(3)无菌芽的增殖:将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1~2cm长接种于MS增殖培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下培养,培养15~20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基,添加0.1mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05mg/L的吲哚乙酸IBA,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,增殖系数为3.2。
(4)无菌苗的壮苗生根:将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行生根培养,培养25d开始生根,所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基,还加入1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5g/L的活性炭,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,生根率为73.9%。
实施例2
本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法另一个实例,包括如下步骤:
(1)外植体的消毒:将2~5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中,取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min,用纱布擦洗种子表面污垢,线状自来水冲洗5min~10min,在超净工作台内用75v/v%的乙醇灭菌30S,无菌水冲洗1次,再用0.1v/v%HgCl2消毒12min,无菌水冲洗3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分,获得外植体,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)无菌芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行培养,培养20d开始萌发,得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基,还加入1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA,0.2mg/L的赤霉素GA3,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,芽诱导率为89.1%。
(3)无菌芽的增殖:将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1~2cm长接种于MS增殖培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下培养,培养15~20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基,添加1.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚乙酸IBA,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,增殖系数为4.8。
(4)无菌苗的壮苗生根:将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行生根培养,培养16d开始生根,所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基,还加入1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的萘乙酸NAA、5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,生根率为69.6%。
实施例3
本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法再一个实例,包括如下步骤:
(1)外植体的消毒:将2~5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中,取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min,用纱布擦洗种子表面污垢,线状自来水冲洗5min~10min,在超净工作台内用75v/v%的乙醇灭菌30S,无菌水冲洗1次,再用0.1v/v%HgCl2消毒12min,无菌水冲洗3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分,获得外植体,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)无菌芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行培养,培养25d开始萌发,得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基,还加入1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的萘乙酸NAA,1.0mg/L的赤霉素GA3,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,芽诱导率为82.6%。
(3)无菌芽的增殖:将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1~2cm长接种于MS增殖培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下培养15~20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基,添加1.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的吲哚乙酸IBA,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,增殖系数为4.5。
(4)无菌苗的壮苗生根:将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行生根培养18d开始生根,所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基,还加入0.8g/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.5mg/L的萘乙酸NAA、1.0g/L的活性炭5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,生根率为80.4%。
实施例4
本发明所述的欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法又一个实例,包括如下步骤:
(1)外植体的消毒:将2~5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中,取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min,用纱布擦洗种子表面污垢,线状自来水冲洗5min~10min,在超净工作台内用75v/v%的乙醇灭菌30S,无菌水冲洗1次,再用0.1v/v%HgCl2消毒12min,无菌水冲洗3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分,获得外植体,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)无菌芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行培养,培养23d开始萌发,得到无菌芽。所述启动培养基是以MS为基本培养基,还加入2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA,1.5mg/L的赤霉素GA3,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,芽诱导率为76.1%。
(3)无菌芽的增殖:将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1~2cm长接种于MS增殖培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下培养15~20d便长出更多的芽丛。所述增殖培养基为MS基本培养基,添加2.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的吲哚乙酸IBA,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,增殖系数为4.3。
(4)无菌苗的壮苗生根:将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行生根培养,培养10d开始生根,所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基,还加入0.3mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、1.5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,培养30d,生根率为84.8%。
Claims (1)
1.一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:
(1)外植体的消毒:将2~5滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中,取无病虫害欧亚瑞香种子置于烧杯中浸泡5min,用纱布擦洗种子表面污垢,线状自来水冲洗5min~10min,在超净工作台内用75v/v%的乙醇灭菌30S,无菌水冲洗1次,再用0.1v/v%HgCl2消毒12min,无菌水冲洗3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分,获得外植体,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水;
(2)无菌芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种于MS启动培养基中,在培养温度为23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下培养20~30d开始萌发,得到无菌芽,所述启动培养基是以MS为基本培养基,还加入0.5~2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0~1.0mg/L的萘乙酸NAA,0.05~1.5mg/L的赤霉素GA3,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)无菌芽的增殖:将步骤(2)中得到的无菌芽剪切成1~2cm长接种于MS增殖培养基中,在培养温度为23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下培养15~20d便长出更多的芽丛,所述增殖培养基为MS基本培养基,添加0.1~2.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5~2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05~1.0mg/L的吲哚乙酸IBA,30g/L蔗糖,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(4)无菌苗的壮苗生根:将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中,在培养温度23±2℃,光照强度20~30μmol/m2·s,光照时间为12h/d的条件下进行生根培养,培养10~25d开始生根,所述生根培养基是以1/2MS为基本培养基,还加入0~1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3~1.5mg/L的萘乙酸NAA、0~1.5g/L的活性炭,5g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
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