CN111084106A - 一种‘大丁香’荔枝品种离体再生的方法 - Google Patents

一种‘大丁香’荔枝品种离体再生的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111084106A
CN111084106A CN202010025153.7A CN202010025153A CN111084106A CN 111084106 A CN111084106 A CN 111084106A CN 202010025153 A CN202010025153 A CN 202010025153A CN 111084106 A CN111084106 A CN 111084106A
Authority
CN
China
Prior art keywords
medium
culture
final concentration
litchi
somatic embryo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010025153.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111084106B (zh
Inventor
王果
门佳丽
李焕苓
王家保
王树军
李芳�
孙进华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CATAS Environment and Plant Protection Institute
Original Assignee
CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CATAS Environment and Plant Protection Institute filed Critical CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority to CN202010025153.7A priority Critical patent/CN111084106B/zh
Publication of CN111084106A publication Critical patent/CN111084106A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111084106B publication Critical patent/CN111084106B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/40—Afforestation or reforestation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了荔枝大丁香品种离体再生的方法。所述方法包括下述步骤：1)以荔枝花药为外植体进行愈伤组织诱导培养，得到胚性愈伤组织；2)对胚性愈伤组织进行体细胞胚诱导培养得到体细胞胚；培养基包括IAA、ABA、6‑BA、肌醇、水解乳蛋白、椰乳；3)对体细胞胚进行成熟培养，得到成熟的体细胞胚，培养基包括椰乳；4)对成熟的体细胞胚进行再生培养，得到再生植株，培养基包括6‑BA和GA3。本发明建立了‘大丁香’荔枝品种离体再生植株的培养方法，并获得了很高的体细胞胚诱导率和萌发率，提高了生产效率，降低了成本，为荔枝品种改良和生物技术育种奠定了良好的基础。

Description

一种‘大丁香’荔枝品种离体再生的方法
技术领域
本发明涉及‘大丁香’荔枝品种离体再生的方法，具体的，本发明涉及‘大丁香’荔枝品种从愈伤组织诱导经体胚发生途径，发育成完整离体再生植株的培养方法。
背景技术
荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是我国重要的经济作物之一，在热区农业生产中占有重要地位。荔枝成花座果不稳、病虫危害严重、采后保鲜困难等问题严重制约荔枝产业发展，培育荔枝优良品种是解决这些问题的根本途径。
荔枝遗传上高度杂合及部分品种的不育性限制了有性杂交在荔枝品种改良上的应用。通过转基因育种可为品种脱毒复壮、遗传改良和快速繁殖提供新的方法和手段，荔枝离体再生技术体系是转基因育种及砧木无性繁殖的基础。
自1983年傅莲芳等报道荔枝组织培养获得完整植株以来，已有较多关于荔枝离体再生的相关研究报道。目前荔枝离体再生中存在基因型依赖，体胚发生频率低，畸形胚较多及体胚高度不同步，植株再生频率不高，是建立高效荔枝离体再生的技术瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种荔枝离体再生的方法。
本发明提供的荔枝离体再生的方法包括下述步骤：
1)以荔枝花药为外植体，将所述荔枝花药在愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，得到胚性愈伤组织；
2)将所述胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基中进行体细胞胚诱导培养，得到体细胞胚；
3)将所述体细胞胚在成熟培养基中进行成熟培养，得到成熟的体细胞胚；
4)将所述成熟的体细胞胚在再生培养基中进行再生培养，得到再生植株。
上述方法中，所述1)中，所述愈伤组织诱导培养基包括2,4-D。
进一步的，所述2,4-D在所述愈伤组织诱导培养基中的终浓度可为0.5-3mg/L或0.5-2mg/L或2-3mg/L或0.5mg/L或2mg/L或3mg/L，具体可为2mg/L。
更进一步的，所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、2,4-D、蔗糖和琼脂组成；所述2,4-D在所述愈伤组织诱导培养基中的终浓度为2mg/L，所述蔗糖在所述愈伤组织诱导培养基中的终浓度为30g/L，所述琼脂在所述愈伤组织诱导培养基中的终浓度为7g/L。
上述方法中，所述2)中，所述体细胞胚诱导培养基包括IAA、ABA、6-BA、肌醇、水解乳蛋白和椰乳。
进一步的，所述IAA在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度可为0.5-2mg/L或0.5-1mg/L或1-2mg/L或0.5mg/L或1mg/L或2mg/L，具体可为1mg/L；
所述ABA在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度可为0.5-2mg/L或0.5-1mg/L或1-2mg/L或0.5mg/L或1mg/L或2mg/L，具体可为1mg/L；
所述6-BA在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度可为0.5-2mg/L或0.5-1mg/L或1-2mg/L或0.5mg/L或1mg/L或2mg/L，具体可为1mg/L；
所述肌醇在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度可为50-200mg/L或50-100mg/L或100-200mg/L或50mg/L或100mg/L或200mg/L，具体可为100mg/L；
所述水解乳蛋白在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度可为300-500mg/L或300-400mg/L或400-500mg/L或300mg/L或400mg/L或500mg/L，具体可为400mg/L；
所述椰乳在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度可为50-200ml/L或50-100ml/L或100-200ml/L或50ml/L或100ml/L或200ml/L，具体可为100ml/L。
更进一步的，所述体细胞胚诱导培养基由MS培养基、IAA、ABA、6-BA、肌醇、水解乳蛋白、椰乳、蔗糖和琼脂组成。所述IAA在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为1mg/L，所述ABA在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为1mg/L，所述6-BA在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为1mg/L，所述肌醇在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为100mg/L，所述水解乳蛋白在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为400mg/L，所述椰乳在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为100ml/L，所述蔗糖在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为60g/L，所述琼脂在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为10g/L。
上述方法中，所述3)中，所述成熟培养基包括椰乳。
进一步的，所述椰乳在所述成熟培养基中的终浓度可为50-200ml/L或50-100ml/L或100-200ml/L或50ml/L或100ml/L或200ml/L，具体可为100ml/L。
更进一步的，所述成熟培养基由MS培养基、椰乳、蔗糖和琼脂组成。所述椰乳在所述成熟培养基中的终浓度为100ml/L，所述蔗糖在所述成熟培养基中的终浓度为60g/L，所述琼脂在所述成熟培养基中的终浓度为10g/L。
上述方法中，所述4)中，所述再生培养基包括6-BA和GA3。
进一步的，所述6-BA在所述再生培养基中的终浓度可为0.1-1mg/L或0.1-0.5mg/L或0.5-1mg/L或0.1mg/L或0.5mg/L或1mg/L，具体可为0.5mg/L；
所述GA3在所述再生培养基中的终浓度可为0.1-1mg/L或0.1-0.5mg/L或0.5-1mg/L或0.1mg/L或0.5mg/L或1mg/L，具体可为0.5mg/L。
更进一步的，所述再生培养基由1/2MS培养基、6-BA、GA3、蔗糖和琼脂组成。所述6-BA在所述再生培养基中的终浓度为0.5mg/L，所述GA3在所述再生培养基中的终浓度为0.5mg/L，所述蔗糖在所述再生培养基中的终浓度为30g/L，所述琼脂在所述再生培养基中的终浓度为7g/L。
上述方法中，所述1)还包括将胚性愈伤组织进行继代培养的步骤；
所述继代培养的方法包括如下步骤：挑选淡黄色、松散型的胚性愈伤组织在继代培养基I和继代培养基II中交替培养，筛选获得淡黄色、生长旺盛、颗粒细小且松散型的胚性愈伤组织；
所述继代培养基I包括2,4-D；
所述继代培养基II包括2,4-D、KT和AgNO3。
进一步的，所述2,4-D在所述继代培养基I中的终浓度可为0.5-2mg/L或0.5-1mg/L或1-2mg/L或0.5mg/L或1mg/L或2mg/L，具体可为1mg/L；
所述2,4-D在所述继代培养基II中的终浓度可为0.5-2mg/L或0.5-1mg/L或1-2mg/L或0.5mg/L或1mg/L或2mg/L，具体可为1mg/L；
所述KT在所述继代培养基II中的终浓度可为0.5-2mg/L或0.5mg/L或2mg/L，具体可为0.5mg/L；
所述AgNO3在所述继代培养基II中的终浓度可为3-7mg/L或3-5mg/L或5-7mg/L或3mg/L或5mg/L或7mg/L，具体可为5mg/L。
更进一步的，所述继代培养基I由MS培养基、2,4-D、蔗糖和琼脂组成；所述2,4-D在所述继代培养基I中的终浓度为1mg/L，所述蔗糖在所述继代培养基I中的终浓度为30g/L，所述琼脂在所述继代培养基I中的终浓度为7g/L。
所述继代培养基II由MS培养基、2,4-D、KT、AgNO3、蔗糖和琼脂组成；所述2,4-D在所述继代培养基II中的终浓度为1mg/L，所述KT在所述继代培养基II中的终浓度为0.5mg/L，所述AgNO3在所述继代培养基II中的终浓度为5mg/L，所述蔗糖在所述继代培养基II中的终浓度为30g/L，所述琼脂在所述继代培养基II中的终浓度为7g/L。
上述任一所述方法中，所述MS培养基和1/2MS培养基均可为现有技术中的常用培养基，可通过商业途径购买，也可按照以下成分及浓度自己配制：
MS培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：大量元素：1900mg/L硝酸钾(KNO3)，1650mg/L硝酸铵(NH4NO3)，170mg/L磷酸二氢钾(KH2PO4)，370mg/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，440mg/L二水氯化钙(CaCl2·2H2O)；微量元素：0.83mg/L碘化钾(KI)，6.2mg/L硼酸(H3BO3)，22.3mg/L四水硫酸锰(MnSO4·4H2O)，8.6mg/L七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，0.25mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，0.025mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)，0.025mg/L六水氯化钴(CoCl2·6H2O)；铁盐：37.25mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)，27.85mg/L七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)；有机成分：100mg/L肌醇，2mg/L甘氨酸，0.1mg/L盐酸硫胺素(VB1)，0.5mg/L盐酸吡哆醇(VB6)，0.5mg/L烟酸(VB3)或烟酰胺(VPP)。
1/2MS培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：大量元素：950mg/L硝酸钾(KNO3)，825mg/L硝酸铵(NH4NO3)，85mg/L磷酸二氢钾(KH2PO4)，185mg/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，220mg/L二水氯化钙(CaCl2·2H2O)；微量元素：0.415mg/L碘化钾(KI)，3.1mg/L硼酸(H3BO3)，11.15mg/L四水硫酸锰(MnSO4·4H2O)，4.3mg/L七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，0.125mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，0.0125mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)，0.0125mg/L六水氯化钴(CoCl2·6H2O)；铁盐：18.625mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)，13.925mg/L七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)；有机成分：50mg/L肌醇，1mg/L甘氨酸，0.05mg/L盐酸硫胺素(VB1)，0.25mg/L盐酸吡哆醇(VB6)，0.25mg/L烟酸(VB3)或烟酰胺(VPP)。
上述方法中，所述1)中，所述培养条件如下：23-27℃(例如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃)暗培养45-60天(例如45天、48天、50天、52天、54天、56天、58天或60天)。
所述2)中，所述培养条件如下：23-27℃(例如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃)暗培养30-45天(例如30天、32天、34天、36天、38天、40天、42天或45天)。
所述3)还包括如下步骤：从体细胞胚中挑选形态大小基本一致、白色体细胞胚接种至成熟培养基中进行成熟培养。
所述3)中，所述培养条件如下：23-27℃(例如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃)暗培养50-65天(例如50天、52天、54天、56天、58天、60天、62天或65天)。
所述4)还包括如下步骤：从成熟的体细胞胚中挑选形态大小基本一致、白色体细胞胚接种至再生培养基中进行再生培养。
所述4)中，所述培养条件如下：23-27℃(例如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃)光照培养10-20天(例如10天、12天、14天、16天、18天或20天)，光照强度为1800-2500Lx(例如1800Lx、2000Lx或2500Lx)，光照时间为15-17小时/天(例如15小时/天、16小时/天或7小时/天)。
所述继代培养条件如下：23-27℃(例如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃)、暗培养；每隔20-25天(例如20天、21天、22天、23天、24天或25天)继代一次，继代的次数可为2-4次(例如2次、3次或4次)。
上述任一所述培养基的pH值均为5.8。
上述任一所述培养基均在灭菌处理后进行使用。
本发明还提供了用于荔枝离体再生的成套培养基。所述成套培养基包括上述愈伤组织诱导培养基和/或体细胞胚诱导培养基和/或成熟培养基和/或再生培养基和/或继代培养基I和/或继代培养基II。
如下a1)-a4)任一种应用也属于本发明的保护范围：
a1)上述成套培养基在荔枝离体再生培养中的应用；
a2)上述成套培养基在制备荔枝离体再生培养的产品中的应用；
a3)上述体细胞胚诱导培养基在提高荔枝体细胞胚发生数和/或体细胞胚诱导率中的应用；
a4)上述再生培养基在提高荔枝体细胞胚萌发率中的应用。
上述应用中，所述体细胞胚发生数是指鲜重为1克的愈伤组织诱导的体细胞胚个数。
上述任一所述方法或成套培养基或应用中，所述荔枝品种为大丁香。
本发明建立了‘大丁香’荔枝品种从愈伤组织诱导经体胚发生途径，发育成完整离体再生植株的方法，攻克了荔枝离体再生体系难建立的问题，并获得了很高的体细胞胚诱导率和萌发率，提高了生产效率，降低了成本，为荔枝品种改良和生物技术育种奠定了良好的基础。
附图说明
图1为‘大丁香’荔枝品种离体再生体系建立过程中的图片。(a)为‘大丁香’荔枝品种离体再生体系建立过程中诱导筛选的胚性愈伤组织；(b)为‘大丁香’荔枝品种离体再生体系建立过程中初始诱导的体细胞胚；(c)为‘大丁香’荔枝品种离体再生体系建立过程中成熟的体细胞胚；(d)为‘大丁香’荔枝品种离体再生体系建立过程中初始抽茎的体细胞胚；(e)为‘大丁香’荔枝品种离体再生体系建立过程中的离体再生植株；(f)为‘大丁香’荔枝品种离体再生体系建立过程中移栽的再生植株。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及的试剂及培养基的来源如下：
2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)是上海源聚生物科技有限公司的产品，货号为081223。
KT(6糠氨基嘌呤)是上海伯奥生物科技有限公司的产品，货号为080623。
IBA(吲哚乙酸)是国药集团化学试剂有限公司的产品，货号为F20080508。
ABA(脱落酸)是源叶生物的产品，货号为S21F8J29658。
6-BA(6-苄氨基嘌呤)是上海伯奥生物科技有限公司的产品，货号为090601。
TDZ(噻苯隆)是上海源聚生物科技有限公司的产品，货号为100312。
GA3(赤霉素)是源叶生物的产品，货号为S27S10P98642。
椰乳(或者椰汁)为将新鲜椰子倒出的椰子汁经双层纱布过滤后得到的椰子水。
水解乳蛋白是BBI Life Sciences的产品，货号为BB07BA0326。
肌醇是上海源聚生物科技有限公司的产品，货号为071013。
M153(1/2MS培养基)是北京西美杰科技有限公司的产品，货号为AHR0153011A。
M519(MS培养基)是北京西美杰科技有限公司的产品，货号为AAK0519209A。
下述实施例中涉及的荔枝品种‘大丁香’记载于文献：吉训志,李焕苓,王果,高兆银,孙进华,王家保.2个荔枝品种体胚发生过程中糖含量及相关酶活性变化[J].热带作物学报,2019,40(04):675-680.中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、荔枝品种‘大丁香’离体再生的方法
一、外植体的制备
实验材料：荔枝品种‘大丁香’露白点期花蕾，2010年2月取自海南省海口市永兴镇吴开茂果农院子内。
实验方法：自来水冲洗摘取的花蕾30min，得到预处理过的花蕾；然后在无菌操作台上将预处理过的花蕾用70％(体积分数)的酒精溶液浸泡消毒30s后再放入0.1％(质量分数)的HgCl2溶液中消毒8min，最后用高压灭菌无菌水冲洗5-6次，获得无菌花蕾。用手术刀和尖头镊子将花药从无菌花蕾里轻轻拨出后作为外植体，该外植体用于接种在愈伤组织诱导培养基上进行暗培养。
二、愈伤组织诱导与继代培养
1、愈伤组织诱导培养基的制备
愈伤组织诱导培养基为在MS培养基的基础上添加终浓度为2mg/L的2,4-D、终浓度为30g/L的蔗糖和终浓度为7g/L琼脂，调节PH值至5.8，灭菌后得到的培养基。
其中，MS培养基为常用培养基，可通过商业途径购买，也可按照以下成分及浓度自己配制：MS培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：大量元素：1900mg/L硝酸钾(KNO3)，1650mg/L硝酸铵(NH4NO3)，170mg/L磷酸二氢钾(KH2PO4)，370mg/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，440mg/L二水氯化钙(CaCl2·2H2O)；微量元素：0.83mg/L碘化钾(KI)，6.2mg/L硼酸(H3BO3)，22.3mg/L四水硫酸锰(MnSO4·4H2O)，8.6mg/L七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，0.25mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，0.025mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)，0.025mg/L六水氯化钴(CoCl2·6H2O)；铁盐：37.25mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)，27.85mg/L七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)；有机成分：100mg/L肌醇，2mg/L甘氨酸，0.1mg/L盐酸硫胺素(VB1)，0.5mg/L盐酸吡哆醇(VB6)，0.5mg/L烟酸(VB3)或烟酰胺(VPP)。
2、诱导培养
将步骤一获得的大丁香荔枝品种花药(外植体)接种至步骤1中的愈伤组织诱导培养基上，在温度为25±2℃条件下暗培养45-60天，诱导并经筛选获得胚性愈伤组织(图1中a)。
3、继代培养
挑选淡黄色、松散型的胚性愈伤组织接种至继代培养基I和继代培养基II上交替培养，培养条件与步骤2所述愈伤组织诱导培养相同，每隔20-25天继代一次，继代2-4次，筛选获得淡黄色、生长旺盛、颗粒细小且松散型的胚性愈伤组织。
继代培养基I为在MS培养基的基础上添加终浓度为1mg/L的2,4-D、终浓度为30g/L的蔗糖和终浓度为7g/L的琼脂，调pH值至5.8，灭菌后得到的培养基。
继代培养基II为在MS培养基的基础上添加终浓度为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.5mg/L的KT、终浓度为5mg/L的AgNO3、终浓度为30g/L的蔗糖和终浓度为7g/L的琼脂，调pH值至5.8，灭菌后得到的培养基。
三、体细胞胚诱导培养
1、将步骤二获得的淡黄色、生长旺盛、颗粒细小且松散型的胚性愈伤组织分别接种至表1中D1-D16所示的含有不同生长调节剂种类及浓度的体细胞胚诱导培养基中进行体细胞胚诱导，研究不同生长调节剂种类及浓度对体细胞胚诱导的影响。
D1-D16所示的体细胞胚诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，采用正交法设计，添加IAA(终浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L或2mg/L)、ABA(终浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L或2mg/L)、TDZ(终浓度为0mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L或1mg/L)、6-BA(终浓度为0mg/L、1mg/L、3mg/L或5mg/L)、终浓度为100mg/L的肌醇、终浓度为400mg/L的水解乳蛋白、终浓度为100ml/L的椰乳、终浓度为60g/L的蔗糖和终浓度为10g/L的琼脂，调pH值至5.8，灭菌后得到的培养基。
培养条件如下：在温度为25±2℃条件下暗培养30-45天。
培养45天时统计体细胞胚发生数(鲜重为1克的愈伤组织诱导的体细胞胚个数)。
结果表明：将淡黄色、生长旺盛、颗粒细小且松散型的胚性愈伤组织接种至不同生长调节剂组合的体细胞胚诱导培养基上进行诱导培养，培养30天左右可获得高分化率的体细胞胚(诱导的体细胞胚，图1中b)。由表1可以看出，D1体细胞胚诱导培养基诱导的体细胞胚个数最多，每鲜克愈伤组织诱导体细胞胚达2094个，其次是D11体细胞胚诱导培养基，每鲜克愈伤组织诱导体细胞胚达988个。但D1培养基上获得的体细胞胚经过下述成熟培养不能萌发，皆处于球形胚阶段，发育已经终止，因此确定D11体细胞胚诱导培养基为荔枝离体再生中的最佳体细胞胚诱导培养基，具体配方如下：MS+1mg/L IAA+1mg/L ABA+1mg/L 6-BA+100mg/L肌醇+400mg/L水解乳蛋白+100ml/L椰乳+60g/L蔗糖+10g/L琼脂。
表1、不同生长调节剂种类及浓度对‘大丁香’荔枝体胚诱导的影响
Figure BDA0002362191080000081
*：每鲜克愈伤组织诱导体细胞胚个数；鲜克是指愈伤组织的鲜重，单位为克。
四、体细胞胚的成熟及植株离体再生培养
1、从步骤三中获得的体细胞胚中挑选形态大小基本一致、白色体细胞胚接种至成熟培养基，在温度25±2℃条件下暗培养60天左右可发育成大小一致的成熟的体细胞胚(图1中c)。
成熟培养基为在MS培养基的基础上添加终浓度为100ml/L的椰乳、终浓度为60g/L的蔗糖、终浓度为10g/L的琼脂，调pH至5.8，灭菌后得到的培养基。
所述成熟培养的条件为温度23-27℃，黑暗培养，培养时间为50-65天。
2、从步骤1中获得的成熟的体细胞胚中挑选形态大小基本一致、白色体细胞胚接种至表2中DR1-DR9所示的再生培养基中培养，得到再生植株。
DR1-DR9所示的再生培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，采用正交法设计，添加6-BA(终浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L)、IBA(终浓度为0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L)、GA3(终浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L)、终浓度为30g/L的蔗糖和终浓度为7g/L的琼脂，调pH至5.8，灭菌后得到的培养基。
再生培养的条件为温度25±2℃，光照培养(光照强度为2000Lx，光照时间为16小时/天)，培养时间为10-20天。
在再生培养基中培养40天后统计体细胞胚萌发率。体细胞胚萌发率＝萌发的体细胞胚个数/接种至再生培养基中的体细胞胚总数。
结果如表2所示。从表中可以看出：DR4再生培养基的体细胞胚萌发率最高，因此确定DR4培养基为离体再生中的最佳再生培养基，具体配方如下：1/2MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。
表2、不同生长调节剂种类及浓度对‘大丁香’荔枝体胚萌发的影响
处理编号 6-BA IBA GA3 萌发率
DR1 0 0 0 4.12b
DR2 0 0.2 0.5 2.73c
DR3 0 0.4 1 2.66c
DR4 0.5 0 0.5 7.34a
DR5 0.5 0.2 1 2.16d
DR6 0.5 0.4 0 1.62ef
DR7 1 0 1 1.84de
DR8 1 0.2 0 1.24f
DR9 1 0.4 0.5 1.47ef
成熟的体细胞胚在DR4再生培养基中培养15天后可见体细胞胚初始抽茎萌发(图1中d)，在DR4再生培养基中培养16天后可形成完整再生植株(图1中e)。
3、开盖炼苗2-3天，洗根，同时对移栽基质(泥炭土：珍珠岩：椰糠＝1：1：1)进行杀菌，然后进行移栽，移栽的再生植株见图1中f。移栽后的注意保温保湿，避免放在强光照射区，待苗健壮后移栽至大田。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种荔枝离体再生的方法，包括下述步骤：
1)以荔枝花药为外植体，将所述荔枝花药在愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，得到胚性愈伤组织；
2)将所述胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基中进行体细胞胚诱导培养，得到体细胞胚；
3)将所述体细胞胚在成熟培养基中进行成熟培养，得到成熟的体细胞胚；
4)将所述成熟的体细胞胚在再生培养基中进行再生培养，得到再生植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述1)中，所述愈伤组织诱导培养基包括2,4-D；
或，所述2,4-D在所述愈伤组织诱导培养基中的终浓度为0.5-3mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述2)中，所述体细胞胚诱导培养基包括IAA、ABA、6-BA、肌醇、水解乳蛋白和椰乳；
或，所述IAA在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为0.5-2mg/L；
所述ABA在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为0.5-2mg/L；
所述6-BA在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为0.5-2mg/L；
所述肌醇在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为50-200mg/L；
所述水解乳蛋白在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为300-500mg/L；
所述椰乳在所述体细胞胚诱导培养基中的终浓度为50-200ml/L。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：
所述3)中，所述成熟培养基包括椰乳；
或，所述椰乳在所述成熟培养基中的终浓度为50-200ml/L。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：
所述4)中，所述再生培养基包括6-BA和GA3；
或，所述6-BA在所述再生培养基中的终浓度为0.1-1mg/L；
或，所述GA3在所述再生培养基中的终浓度为0.1-1mg/L。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：
所述1)还包括将胚性愈伤组织进行继代培养的步骤；
或，所述继代培养的方法包括如下步骤：挑选淡黄色、松散型的胚性愈伤组织在继代培养基I和继代培养基II中交替培养；
所述继代培养基I包括2,4-D；
所述继代培养基II包括2,4-D、KT和AgNO3；
或，所述2,4-D在所述继代培养基I中的终浓度为0.5-2mg/L；
所述2,4-D在所述继代培养基II中的终浓度为0.5-2mg/L；
所述KT在所述继代培养基II中的终浓度为0.5-2mg/L；
所述AgNO3在所述继代培养基II中的终浓度为3-7mg/L。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：
所述1)中，所述培养条件如下：23-27℃暗培养45-60天；
或，所述2)中，所述培养条件如下：23-27℃暗培养30-45天；
或，所述3)中，所述培养条件如下：23-27℃黑暗培养50-65天；
或，所述4)中，所述培养条件如下：23-27℃光照培养10-20天，光照强度为1800-2500Lx，光照时间为15-17小时/天；
或，所述继代培养条件如下：23-27℃、暗培养；每隔20-25天继代一次，继代的次数为2-4次。
8.用于荔枝离体再生的成套培养基，其包括权利要求1-7中任一所述的愈伤组织诱导培养基和/或体细胞胚诱导培养基和/或成熟培养基和/或再生培养基和/或继代培养基I和/或继代培养基II。
9.如下a1)-a4)任一种应用：
a1)权利要求8所述的成套培养基在荔枝离体再生培养中的应用；
a2)权利要求8所述的成套培养基在制备荔枝离体再生培养的产品中的应用；
a3)权利要求1-7中任一所述的体细胞胚诱导培养基在提高荔枝体细胞胚发生数和/或体细胞胚诱导率中的应用；
a4)权利要求1-7中任一所述的再生培养基在提高荔枝体细胞胚萌发率中的应用。
10.根据权利要求1-7任一所述的方法或权利要求8所述的成套培养基或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述荔枝品种为大丁香。
CN202010025153.7A 2020-01-10 2020-01-10 一种‘大丁香’荔枝品种离体再生的方法 Active CN111084106B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010025153.7A CN111084106B (zh) 2020-01-10 2020-01-10 一种‘大丁香’荔枝品种离体再生的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010025153.7A CN111084106B (zh) 2020-01-10 2020-01-10 一种‘大丁香’荔枝品种离体再生的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111084106A true CN111084106A (zh) 2020-05-01
CN111084106B CN111084106B (zh) 2023-04-28

Family

ID=70399169

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010025153.7A Active CN111084106B (zh) 2020-01-10 2020-01-10 一种‘大丁香’荔枝品种离体再生的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111084106B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114223540A (zh) * 2021-11-12 2022-03-25 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种含氨基酸复合液用于荔枝离体再生的产品及方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101186910A (zh) * 2007-10-18 2008-05-28 中国科学院亚热带农业生态研究所 花生转基因的方法
CN103053420A (zh) * 2013-01-05 2013-04-24 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种“妃子笑”荔枝品种离体再生的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101186910A (zh) * 2007-10-18 2008-05-28 中国科学院亚热带农业生态研究所 花生转基因的方法
CN103053420A (zh) * 2013-01-05 2013-04-24 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种“妃子笑”荔枝品种离体再生的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吉训志等: "2个荔枝品种胚性愈伤组织诱导体胚发生过程的细胞学观察", 《热带作物学报》 *
胡自华等: "胡萝卜人工种子制备的初步研究", 《中山大学学报（自然科学）论丛》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114223540A (zh) * 2021-11-12 2022-03-25 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种含氨基酸复合液用于荔枝离体再生的产品及方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111084106B (zh) 2023-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112616668B (zh) 荔枝“岭南15号”品种离体再生的方法
Rossin et al. Effect of explant source and auxins on somatic embryogenesis of selected cassava (Manihot esculenta Crantz) cultivars
US4665030A (en) Process for regenerating corn
CN112931198B (zh) 一种菠萝抗寒种质的制备方法
Blasco et al. Somatic embryogenesis in holm oak male catkins
CN111492973B (zh) 普通油茶通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法
CN113068615B (zh) 荔枝离体再生的方法、产品及其应用
Wu et al. In vitro mass propagation of hermaphroditic Carica papaya cv. Meizhonghong
Sheibani et al. Induction of somatic embryogenesis in saffron using thidiazuron (TDZ)
Onay In Vitro organogenesis and embryogenesis of pistachio, Pistacia vera L.
CN101926285B (zh) 克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法
CN109392721B (zh) 一种诱导甘薯植株再生的方法
JP2901021B2 (ja) 植物組織培養による球根類の増殖方法
Al-Busaidi et al. In vitro regeneration of Mango (Mangifera indica L.) cv. Baramasi through nucellar embryogenesis
CN111084106A (zh) 一种‘大丁香’荔枝品种离体再生的方法
CN112931197B (zh) 一种菠萝组织培养苗的制备方法
CN112568125A (zh) 一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法
CN101703002B (zh) 克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养基
Sivanesan et al. Secondary somatic embryogenesis in Crocus vernus (L.) Hill
Le et al. Plant regeneration of cassava (Manihot esculenta CRANTZ) plants
Vengadesan et al. Ontogeny of somatic embryos in cucumber (Cucumis sativus L.)
Getu et al. In vitro regeneration of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Convolvulaceae, from leaf and petiole explants
Krishania et al. Effects of heavy metals on Eleusine coracana (L.) Gaertn
Ziarani et al. Optimizing culture condition for high frequency regeneration in vitro tissue culture in Daucus Carota L. and genetic stability assessment
US4837152A (en) Process for regenerating soybeans

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant