CN108308022B - 一种报春石斛的组织培养育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种报春石斛的组织培养育苗方法，包括以下步骤：外植体的选择、外植体的消毒、播种、继代培养、生根培养、炼苗和驯化移栽。该方法结合报春石斛的分化、生长特点，选择了合适的消毒方式、光照强度、温度和培养基，以高效、经济的方式，得到了报春石斛植株，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织培育技术领域，尤其涉及一种报春石斛的组织培养育苗方法。
背景技术
报春石斛(Dendrobium signatum Lindl.)为兰科，主要分布在印度、缅甸、泰国、老挝、越南等国家。茎下垂，厚肉质，圆柱形，无分枝，具多节；总状花序具1-3朵花，通常从落了叶的茎节上发出，花展开下垂，萼片和花瓣淡玫瑰色，唇瓣淡黄色带淡玫瑰色先端，两面密布短柔毛，边缘具不整齐的细齿，唇盘具有紫红色的脉纹，花期3-4月。
目前国内市场上的报春石斛主要靠进口和野生采挖，有少数人工栽培，一般通过分株繁殖和扦插的方式进行繁殖，繁殖种苗较少，繁殖率低，生长周期较长，正常生长环境下不经人工授粉结果的几率较小；由于果荚少，果粉细小，在自然环境下不易萌发生长等诸多因素的制约，野生的报春石斛资源不断减少。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种存活率高的报春石斛的组织培养育苗方法。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种报春石斛的组织培养育苗方法，包括以下步骤：
1)外植体的选择：选外种壳黄绿色、完好无裂的果荚作为外植体，冷藏；
2)外植体的消毒：取步骤1)得到的外植体，用洗涤液浸泡，刷净果荚表皮，洗净，在无菌环境下用医用酒精浸泡消毒，再依次采用次氯酸钠、升汞消毒，冲洗干净；
3)播种：将步骤2)消毒后的外植体解剖，取果荚中的果粉，将果粉撒至初代培养基，置于24℃-26℃、光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，培养至果粉萌发；所述初代培养基为含有蔗糖和琼脂粉的1/2MS培养基；
4)继代培养：果粉萌发后，将光照强度上调400-600lx，继续培养至种苗长2-3cm，移至继代培养基，培养至种苗长5-6cm；所述继代培养基为含有萘乙酸、6-BA、蔗糖、琼脂粉、土豆汁和活性碳粉的1/2MS培养基；所述继代培养基中，萘乙酸的浓度为0.8-1.2mg/L萘乙酸；
5)生根培养：将继代培养后的种苗置于生根培养基中继续培养，所述生根培养基为含有萘乙酸、6-BA、蔗糖、琼脂粉、土豆汁、香蕉汁和活性碳粉的MS培养基；所述生根培养基中，萘乙酸的浓度为1.8-2.2mg/L萘乙酸；
6)炼苗、驯化移栽：待根充分发育后，将种苗连同生根培养基置于大棚中炼苗；将种苗取出清洗，用多菌灵稀释液浸泡，洗净阴干水分，将种苗至于基质中驯化。
进一步地，步骤1)中，选择健康的报春石斛2-4年的母本植株，人工授粉，培育，得果荚。
进一步地，步骤1)中，冷藏的具体操作为于3-6℃冷藏12-16天。
进一步地，步骤2)中，次氯酸钠的浓度为2wt％；升汞的浓度为0.1wt％。
进一步地，步骤3)中，初代培养基为含有2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉的1/2MS培养基。
进一步地，步骤3)中，所述果粉与初代培养基的播种密度为0.08-0.12g的果粉/30mL初代培养基，所述初代培养基的pH值为5.8-6.0。
进一步地，步骤4)中，继代培养基为含有最终浓度如下所示的以下组分的1/2MS培养基：1.0mg/L的萘乙酸、1.5mg/L的6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉；所述继代培养基的pH值为5.8-6.0。
进一步地，步骤5)中，生根培养基为含有以最终浓度计的以下组分的MS培养基：2.0mg/L的萘乙酸、1.5mg/L的6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁和3g/L的活性碳粉；所述生根培养基的pH值为5.8-6.0。
进一步地，步骤6)中，大棚的光照强度为3000lx-6000lx，湿度为65％-75％。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1)本发明采用严格、有效的消毒手段，保证外植体具有较高的分化发芽率；
2)本发明选用的适宜于幼芽分化和生长的1/2基础培养基，有助于幼芽进一步生长和生根；且能有效降低培育成本；
3)本发明选用MS培养基和相于对继代培养基更高浓度的生长素，以促进幼苗生根以及进一步生长；
4)本发明结合植株的生长特点和培养基的成本，提供了一种更加经济、高效的报春石斛组培扩繁育苗的方法。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明提供一种报春石斛的组织培养育苗方法，包括以下步骤：
1)外植体的选择：选外种壳黄绿色、完好无裂的果荚作为外植体，冷藏；
2)外植体的消毒：取步骤1)得到的外植体，用洗涤液浸泡，刷净果荚表皮，洗净，在无菌环境下用医用酒精浸泡消毒，再依次采用次氯酸钠、升汞消毒，冲洗干净；
本步骤中，采用医用酒精、次氯酸钠、升汞依次消毒，以保证种子彻底消毒，而又不影响种子的活性，播种后培养基不感染；
3)播种：将步骤2)消毒后的外植体解剖，取果荚中的果粉，将果粉撒至初代培养基，置于24℃-26℃、光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，培养至果粉萌发；所述初代培养基为含有蔗糖和琼脂粉的1/2MS培养基；
步骤中的播种后的温度和光照强度能保证种子的发芽率大于85％；
4)继代培养：果粉萌发后，将光照强度上调400-600lx，继续培养至种苗长2-3cm，移至继代培养基，培养至种苗长5-6cm；所述继代培养基为含有萘乙酸、6-BA、蔗糖、琼脂粉、土豆汁和活性碳粉的1/2MS培养基；
5)生根培养：将继代培养后的种苗置于生根培养基中继续培养，所述生根培养基为含有萘乙酸、6-BA、蔗糖、琼脂粉、土豆汁、香蕉汁和活性碳粉的MS培养基；
6)炼苗、驯化移栽：待根充分发育后，将种苗连同生根培养基置于大棚中炼苗；将种苗取出清洗，用多菌灵稀释液浸泡，洗净阴干水分，将种苗至于基质中驯化。
本发明提供的报春石斛的组织培养育苗方法，能够有效的提高报春石斛种苗的繁育的速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现报春石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。
实施例1：
一种报春石斛的组织培养育苗方法，包括以下步骤：
1)外植体的选择：选择健康的报春石斛3年株龄的母本植株，在3月下旬报春石斛开花期间对石斛进行人工授粉，让其长出果荚，经过3-4个月培育，选外种壳黄绿色、完好无裂的果荚作为外植体，外植体于3-6℃保存2周；
2)外植体的消毒：取步骤1)得到的外植体，用洗涤液浸泡，刷净果荚表皮，洗净，在无菌环境下用医用酒精浸泡消毒，再依次采用2wt％的次氯酸钠、0.1wt％升汞消毒，冲洗干净；
3)播种：将步骤2)消毒后的外植体解剖，取果荚中的果粉，将0.1g果粉撒至30mL初代培养基，置于25℃、光照强度为2300lx，光照时间为11小时/天的条件下，培养至果粉萌发；所述初代培养基为含有2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉的1/2MS培养基，初代培养基的pH值为5.8-6.0；
4)继代培养：果粉萌发后，将光照强度上调400-600lx，继续培养至种苗长2-3cm，移至继代培养基，培养至种苗长5-6cm；继代培养基为含有最终浓度如下所示的以下组分的1/2MS培养基：1.0mg/L的萘乙酸、2.0mg/L的6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉；所述继代培养基的pH值为5.8-6.0；
5)生根培养：将继代培养后的种苗置于生根培养基中继续培养，生根培养基为含有以最终浓度计的以下组分的MS培养基：2.0mg/L的萘乙酸、1.5mg/L的6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁和3g/L的活性碳粉；所述生根培养基的pH值为5.8-6.0；
6)炼苗、驯化移栽：将生根培养后的种苗连同生根培养基置于大棚中炼苗；将种苗取出清洗，用稀释800倍的水溶液多菌灵液浸泡根部15min，洗净阴干水分，将种苗至于基质中驯化；其中，大棚光照强度为3000lx-6000lx，湿度为65％-75％。
实施例2：
实施例2与实施例1不同的是，选用2年株龄的报春石斛作为母本植物。
实施例3：
实施例3与实施例1不同的是，步骤3)中，光照强度为2500lx。
实施例4
实施例4与实施例1不同的是，步骤4)中，光照强度上调600lx。
对比例1
对比例1与实施例1不同的是，步骤3)中，光照强度为3500lx。
对比例2
对比例2与实施例1不同的是，步骤3)中，光照强度为1000lx。
各实施例的每30mL的培养基的成形株数、起始分化时间、株高2-3cm的时间、株高5-6cm的时间如下表所示，其中，株高2-3cm和5-6cm以培养基中95％的种苗的高度达到该标准时的时间；炼苗时间为95％的幼苗茎粗株高1.2-1.5cm的时间。
| <u>实施例1</u> | <u>实施例2</u> | <u>实施例3</u> | <u>实施例4</u> | <u>对比例1</u> | <u>对比例2</u> | |
| 萌芽株数 | 19 | 13 | 19 | 20 | 11 | 14 |
| 起始分化 | 27 | 32 | 27 | 27 | 26 | 38 |
| 株高2-3cm | 72 | 75 | 72 | 70 | 73 | 97 |
| 株高5-6cm | 121 | 138 | 119 | 118 | 166 | 169 |
| 炼苗时间 | 19 | 23 | 22 | 22 | 15 | 28 |
如上表所示，采用本发明提供的方法，0.1g果粉即可培育长成16-20株成熟幼苗，成活率较高，且培育至5-6cm的时间均为在120天左右，周期相对较短，效率高。实施例2采用的果荚的株龄短，果荚的质量不佳，萌芽株数相对较少，分化率低，分化时间晚；实施例3初代培养时，光强较实施例1强，实施例4中继代培养时光强较实施例1强100lx，都有肋于缩短培养时间，植株生长更快；而对比例1中，光照强度过高，反而不利于植株的分化和继代培养，表现在萌芽株数减少或长至相同的株高耗时更长。本发明分化和继代培养阶段，使用1/2MS培养基，相对于传统的MS培养基，生产原料大幅减少，在生产中每瓶培养基可节约1.0-1.5元的成本。本发明在分化阶段和继代培养阶段采用的光照参数对幼苗的分化率、分化时间、继代生长时间和炼苗时间都产生了较大的影响，一方面光照不足条件下，分化慢、生长慢、苗体不够健壮，炼苗耗时长；另一方面光照太强，分化和存活率低，苗体不够健壮，炼苗耗时长。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种报春石斛的组织培养育苗方法，包括以下步骤：
1)外植体的选择：选择健康的报春石斛3年的母本植株，人工授粉，培育，得果荚；选外种壳黄绿色、完好无裂的果荚作为外植体，于3-6℃冷藏12-16天；
2)外植体的消毒：取步骤1)得到的外植体，用洗涤液浸泡，刷净果荚表皮，洗净，在无菌环境下用医用酒精浸泡消毒，再依次采用次氯酸钠、升汞消毒，冲洗干净；
3)播种：将步骤2)消毒后的外植体解剖，取果荚中的果粉，将果粉撒至初代培养基，置于24℃-26℃、光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天的条件下，培养至果粉萌发；初代培养基为含有2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉的1/2MS培养基；
4)继代培养：果粉萌发后，将光照强度上调400-600lx，继续培养至种苗长2-3cm，移至继代培养基，培养至种苗长5-6cm；继代培养基为含有最终浓度如下所示的以下组分的1/2MS培养基：1.0mg/L的萘乙酸、2.0mg/L的6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉；所述继代培养基的pH值为5.8-6.0；
5)生根培养：将继代培养后的种苗置于生根培养基中继续培养，生根培养基为含有以最终浓度计的以下组分的MS培养基：2.0mg/L的萘乙酸、1.5mg/L的6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁和3g/L的活性碳粉；所述生根培养基的pH值为5.8-6.0；
6)炼苗、驯化移栽：待根充分发育后，将种苗连同生根培养基置于大棚中炼苗，大棚的光照强度为3000lx-6000lx，湿度为65％-75％；将种苗取出清洗，用多菌灵稀释液浸泡，洗净阴干水分，将种苗至于基质中驯化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，次氯酸钠的浓度为2wt％；升汞的浓度为0.1wt％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述果粉与初代培养基的播种密度为0.08-0.12g的果粉/30mL初代培养基，所述初代培养基的pH值为5.8-6.0。
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