CN107691222A - 一种蓝花丹高效扦插快繁的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蓝花丹高效扦插快繁的方法，其包括如下步骤：将经预先扦插繁育所得蓝花丹子代的嫩枝剪下作为接穗，置于无外源激素的培养基中扦插培养；所述无外源激素的培养基为添加蔗糖和琼脂的MS培养基；所述预先扦插繁育的方法为：将蓝花丹幼苗的嫩枝剪下作为插穗，置于添加植物生长调节剂、蔗糖和琼脂的MS培养基中扦插培养，所述植物生长调节剂为NAA和/或IBA。本发明可以实现无需添加任何外源激素而进行蓝花丹扦插快繁的效果，大幅度降低了成本并减少了相应的污染；本发明的生根时间早、生根率高、生长情况好，适于推广应用；本发明方法操作简单易行，易于蓝花丹商品苗的快速获得。

Description

一种蓝花丹高效扦插快繁的方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，涉及蓝花丹繁育技术领域，具体涉及一种蓝花丹高效扦插快繁的方法。

背景技术

蓝花丹作为一种多功能型园林观赏药用植物，花期极长(可长达半年之久)、花色淡雅独特、萌蘖能力和抗逆性强、管理简单粗放、病虫害少、耐高温、成年植株冠幅较大、耐修剪，现已越来越多的被引种栽培和应用，逐渐成为现代园林植物造景中的新宠儿；其根部大量积累的白花丹素具有抗癌、抗氧化、抗菌、放疗增敏以及避孕等多种药理作用，已越来越受到医学界的关注和重视。因此，兼具极高观赏价值和药用价值的蓝花丹，是值得深入开发和利用的新型花卉，无论是在园林产业还是在药品行业中都具有广阔的应用前景和开发潜力。然而，蓝花丹自交不亲和导致自然结实率极低、种子少且自然发芽率低、幼苗死亡率高等多种原因造成其繁殖较为困难。同时，获取白花丹素的传统方式仍然依赖于以牺牲整个植株为代价，不能满足日益增长的市场需求。加之白花丹素在制药业中越来越明显的需求以及利益的驱动，导致人们仍然采取这一简单粗暴的手段对该植物过度开采，从而使得其野外数量急剧下降，对其种质资源造成了毁灭性的伤害。因此，对蓝花丹的开发应用，首先是要有足够的种质资源作为基础。可见，寻求一种快速有效的繁殖方式是迫切而又重要的课题。

目前蓝花丹的繁殖方法主要依靠种子和有菌扦插。组织培养的相关研究甚少，且未见成功的商品苗报道。由于其种子繁殖系数不高，加之价格昂贵和种源被国外控制，因此，走有性繁殖方式不能满足对该植物应用日益增长的市场需求。无性繁殖中的组织培养技术是一种高效快速获得无菌苗的极好繁殖方式，不仅繁殖系数高、繁殖快、生产周期短、不受季节影响、培养环境几乎恒定，而且出苗整齐、无需脱毒，因此苗木生长具有较好的一致性和商品性，形成商品苗的可能性大。这就大大降低了生产成本，对该优良花卉的大力推广应用提供了有力保障。

不过，目前的快繁体系通常需要大量的外源激素，对于大批量繁育而言，是不利于成本的控制的，也容易造成污染。

综上所述，本领域亟需一种大为简化繁育操作、大幅降低繁育成本、生根情况及生长良好的蓝花丹快繁方法。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种蓝花丹高效扦插快繁的方法，该方法包括如下步骤：

将经预先扦插繁育所得蓝花丹子代的嫩枝剪下作为接穗，置于无外源激素的培养基中扦插培养；所述无外源激素的培养基为添加蔗糖和琼脂的MS培养基；

所述预先扦插繁育的方法为：

将蓝花丹幼苗的嫩枝剪下作为插穗，置于添加植物生长调节剂、蔗糖和琼脂的MS培养基中扦插培养，所述植物生长调节剂为NAA和/或IBA。

根据蓝花丹的生长特性，常用的扦插培养的条件为：温度20～28℃，光照度1500～2500lx，光照时间8～12h/d。

本发明的发明人发现，当利用本发明预先扦插繁育所得的蓝花丹幼苗的嫩枝作为插穗，可以在不添加任何外源激素得情况下，获得很好的扦插繁育效果，所得的生根率和生长情况均十分优秀。

值得一提的是，本发明所得的效果比添加外源激素所得的效果还要优秀，这与适用于其它植物的快繁体系的研究结论是相反的。如在《大花蕙兰组织培养快繁技术》、《不同培养基对大花蕙兰组织培养和快速繁殖的影响》、《大苞鞘石斛组织培养快繁研究》和《高山石斛再生体系的建立》等研究中，所涉及的植物均需要添加相应的外源激素才能诱导生根。另外，在现有的快繁技术中，生根率超过50％所需的时间通常在45天以上，而在本发明中，在第18天时，生根率可达到100％，根长可达5cm以上。上述现象的机理仍在研究当中。

所述蓝花丹子代为经预先扦插繁育所得蓝花丹子代第1代至第23代中的任何一代。

本发明的发明人发现，本发明可以高效稳定的繁殖至第23代，而且没有发现效果减弱的趋势。

所述嫩枝为带3～4个叶片的上部茎段。

进行所述扦插培养时，采用30°～45°斜插的方式。

所述蔗糖的浓度为30g·L^-1，和/或，所述琼脂的浓度为6g·L^-1；所述MS培养基的pH为5.8。

优选的，所述NAA的浓度为0.5～1.5mg·L^-1；所述IBA的浓度为0.5～1.5mg·L^-1。

最佳的，所述植物生长调节剂为IBA，IBA的浓度为0.5～1.0mg·L^-1；所述植物生长调节剂为IBA和NAA，IBA的浓度为1.0～1.5mg·L^-1，NAA的浓度为0.5mg·L^-1。

利用上述优选或者最佳的方案进行预先扦插繁育，可以获得较好的生根率和生长情况，利于本发明的扦插快繁，但这并非是本发明的限制。本领域技术人员应该理解，经本发明所述的预先扦插繁育所得的蓝花丹幼苗均可用于本发明的扦插繁育。

本发明的有益效果：

本发明可以实现无需添加任何外源激素而进行蓝花丹扦插快繁的效果，大幅度降低了成本并减少了相应的污染；本发明的生根时间早、生根率高、生长情况好，适于推广应用；本发明方法操作简单易行，易于蓝花丹商品苗的快速获得。

附图说明

图1为本发明扦插繁育12d时生根情况照片；

图2为本发明扦插繁育36d时生根情况照片；

图3位本发明实施例2表5中第4号处理组扦插繁育12d时生根情况照片；

图4为本发明实施例2表5中第1号处理组扦插繁育12d时的愈伤组织发生情况和生根情况照片；

图5位本发明实施例2表5中第4号处理组扦插繁育36d时生根情况照片；

图6为本发明实施例2表5中第1号处理组扦插繁育36d时的愈伤组织发生情况和生根情况照片。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1预先扦插繁育

(1)无菌播种和萌发

种子的无菌播种：10～12月份采收成熟的蓝花丹果实，在恒温吹风机中40℃阴干，待完全晾干大部分种子爆裂出后，加以人工适当揉搓，使种子完全裂出。收集并记录种子数，装入牛皮纸袋内并标记，存放于阴暗干燥的种子库备用。选取成熟饱满且无虫害的蓝花丹种子，28℃自来水浸种0～2d后，洗衣粉水浸泡0.5h再自来水流水冲洗2h，在超净工作台上按表1用75％酒精和0.1％HgCl₂浸泡进行单因素完全随机消毒处理，然后分别接种在表2、3所述的培养基上进行两因素三水平的无菌萌发处理，每瓶接种3颗种子，每个处理重复3次。

本方面实验内容，若无特别说明，培养基添加30g·L^-1蔗糖、6g·L^-1琼脂，pH为5.8。培养条件为白天30℃、夜晚15℃黑暗培养，待种子萌发后光照度为1500～2500lx，光照时间为8～12h/d。培养30d统计发芽率和生长情况。

表1蓝花丹种子无菌萌发的消毒方式筛选

表2MS培养基下蓝花丹种子无菌萌发的激素筛选

表3WPM培养基下蓝花丹种子无菌萌发的激素筛选

注：+++表示生长情况良好，++表示生长情况一般，+表示生长情况较差。

最佳种子无菌萌发培养基：无任何激素添加的MS培养基，蔗糖30g·L^-1、琼脂6g·L^-1。

(2)无菌扦插

待无菌播种生长的无菌苗长至高8cm左右时，剪取健壮的上部茎段带3～4个叶片作扦插插穗，采用30°～45°斜插进行无菌扦插。选NAA和IBA按表4进行随机处理，各处理重复3次。

若无特别说明，培养基添加30g·L^-1蔗糖、6g·L^-1琼脂，pH为5.8。培养条件为温度20～28℃，光照度1500～2500lx，光照时间8～12h/d。30d后观察生长情况。

表4蓝花丹无菌扦插生根诱导激素筛选表

注：+++表示生长情况良好，生根率在80％以上，++表示生长情况一般，生根率50％～80％，+表示生长情况较差(生根率20～50％)，空白表示生长情况极差(生根率20％以下)。

由表4可知，在无菌条件下，蓝花丹插穗生根需要外源植物生长调节剂的诱导，含有0.5mg/L IBA的培养基中，蓝花丹插穗生根率最好，可达到80％以上，且新根生长状况良好。

实施例2

经实施例1的预先扦插繁育之后，待生根接穗生长至10cm以上，可第二次剪取接穗，长度不超过原长度的1/2。将新剪下嫩枝作为第二代接穗(简记为F2)分别接入含NAA(0.51.01.5mg/L)，IBA(0.51.01.5mg/L)，以及无激素添加的MS培养基中。结果如下：

表5蓝花丹F2无菌扦插生根诱导激素筛选表

由表5可知，蓝花丹第二代接穗在激素空白培养基中的生根情况已经达到或者超过使用IBA的培养基。与空白培养基和IBA培养基想比，含有NAA的培养基并不能有效诱导F2接穗生根，同时会出现大量的愈伤组织。

将含有1.0mg·L^-1NAA、0.5mg·L^-1IBA以及空白培养基上获得的植株，按照上述标准截取F3接穗，并接入对应培养基中，结果如下：

表3蓝花丹F3无菌扦插生根诱导激素筛选表

含有1.0mg·L^-1NAA的处理中，生根率仅为12％，同时发现如果外植体没有生根，外植体亦不会生长，只会有愈伤组织的增殖，叶片出现黄斑或枯死，有些外植体整体会死亡。大部分情况是地上部分既不生长亦不枯萎，地下部分增殖愈伤组织。NAA组生根差，数量也不满足因此也没有研究其继代的变化。

含有0.5mg·L^-1IBA的培养基中，F3继代生根能力退化。

实验组(不添加外源激素组)继代则表现与F2代持平。

目前，实验组已继代至23代，表现稳定。含有的激素的培养基，F5代时，基本无生根，接穗不能存活。

成本计算：

1L种子无菌播种培养基成本+其它费用(电费、人工费、瓶子等耗材费用)＝1L MS培养基+30g蔗糖+6g琼脂+其它费用＝4+0.9+2.16+10.5≈17.5元

1L无菌扦插培养基成本+其它费用(电费、人工费、瓶子等耗材费用)＝1L MS培养基+30g蔗糖+6g琼脂+其它费用＝4+0.9+2.16+10.5≈17.5元

首次无菌扦插总价＝1L种子无菌播种培养基成本+3倍×1L无菌扦插培养基成本＝17.5+3×17.5＝70元(表6)

无菌扦插总价＝3倍×1L无菌扦插培养基成本＝3×17.5＝52.5元(表7)

表6蓝花丹首次无菌扦插成本样表

表7蓝花丹无菌扦插成本样表

对比实施例1

本实施例采用传统的播种繁殖方法繁殖蓝花丹。

选取成熟饱满无病虫害的种子，自来水冲掉多余杂质后用3％的高锰酸钾溶液浸泡30min，蒸馏水冲净后，将种子置于28℃的光照恒温培养箱中进行黑暗吸涨处理2d。每个处理3次重复，每个重复30粒种子，将种子分别平铺于底部铺有浸润脱脂棉和滤纸并高压灭菌冷却的培养皿中，置于光照恒温培养箱中培养，培养温度为25℃/28℃(白天/夜晚)，黑暗培养，当种子有子叶露白时进行光照培养12h/d。

培养期间用蒸馏水保持种子表面湿润，发霉种子取出洗净再放回，并去除腐烂种子。每天观察种子发芽及生长情况，记录发芽粒数并测量根长，直至连续2次观察到种子发芽数均为0，以培根突破种皮2mm作为萌发标准，在根长达到1.5cm时移栽，移栽15d后，统计其成活率，并计算每株苗分成本价(表8).

表8蓝花丹播种繁殖成本价表

将实施例2中的平均成本价(元/株)0.2～0.3元和对比实施例1的6元的平均成本价比较，可以看出：采用本方法无菌扦插快繁的蓝花丹与传统的播种繁殖方法相比，所用的成本大大降低，成活率高。

经过上述实施例和对比实施例的比较，以及结合本领域的常识，可以知道本发明的优点在于：采用本发明方法培养的蓝花丹成活率高，生根时间早，生长发育快，在降低成本的基础上，扩大繁殖系数，且不受季节限制，为蓝花丹的生产提供了新的高效无菌扦插繁殖方法，为解决目前蓝花丹有菌扦插受季节限制，丛芽继代增殖系数低、易玻璃化等不稳定现象作出贡献。本发明方法操作简单易行，易于蓝花丹商品苗的快速获得。

Claims (8)

1.一种蓝花丹高效扦插快繁的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将经预先扦插繁育所得蓝花丹子代的嫩枝剪下作为接穗，置于无外源激素的培养基中扦插培养；所述无外源激素的培养基为添加蔗糖和琼脂的MS培养基；

所述预先扦插繁育的方法为：

将蓝花丹幼苗的嫩枝剪下作为插穗，置于添加植物生长调节剂、蔗糖和琼脂的MS培养基中扦插培养，所述植物生长调节剂为NAA和/或IBA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扦插培养的条件为：温度20～28℃，光照度1500～2500lx，光照时间8～12h/d。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蓝花丹子代为经预先扦插繁育所得蓝花丹子代第1代至第23代中的任何一代。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嫩枝为带3～4个叶片的上部茎段。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述扦插培养时，采用30°～45°斜插的方式。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔗糖的浓度为30g·L^-1，和/或，所述琼脂的浓度为6g·L^-1；所述MS培养基的pH为5.8。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NAA的浓度为0.5～1.5mg·L^-1；所述IBA的浓度为0.5～1.5mg·L^-1。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物生长调节剂为IBA，IBA的浓度为0.5～1.0mg·L^-1；所述植物生长调节剂为IBA和NAA，IBA的浓度为1.0～1.5mg·L^-1，NAA的浓度为0.5mg·L^-1。