CN115968778A - 树莓离体再生培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种树莓离体再生培养的方法。该方法包括以下步骤：选择茎干半木质化的树莓植株，取休眠的腋芽作为外植体材料；将休眠的腋芽进行消毒处理；剥去消毒后的休眠的腋芽的外表皮鳞片组织，切去芽底部，留下2～5mm的芽尖端；将芽尖端接种于增殖培养基中进行光照增殖培养；将光照增殖培养后的芽尖端移入生根培养基进行光照生根培养，得到组培树莓苗。本发明的树莓再生方法具有广谱性，在不同的树莓品种上均可高效离体再生培养，且发芽率高，培养周期短，可作为树莓资源在农业上使用，具有广泛的应用价值和推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种树莓离体再生培养的方法。
背景技术
树莓，又名覆盆子，蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus L.)多年生开花植物，其广泛分布在欧洲、亚洲、北美洲等的温带气候区，并且自公元4世纪便被作为食物和药物使用。时至今日，树莓已经成为一种具有较高经济价值的全球性果树种类，且近年消费需求仍不断增长。这与树莓独特的风味、极高的营养、保健和药用潜力紧密相关，其富含花青素、鞣花酸、维生素和γ-氨基丁酸等健康因子，且树莓果实超氧化物歧化酶(SOD)含量居各类水果之首，具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌抗炎、调节免疫、降低血液胆固醇等药用功效。树莓，属于我国药食同源植物，具有极高的营养和保健价值，1993年被FAO评为“第三代果树”。
树莓果实除用于鲜食外，还被用于制药、保健品、化妆品等生产领域。同时，还被加工成果酱、果汁、果酒、蜜饯等食品。目前我国已有部分地区或企业涉及了树莓深加工领域，如黑龙江省尚志市已经建成浓缩汁、果酱、果酒等系列产品生产线，其产品果酒、果酱畅销国内外，为我国树莓开发利用开辟了广阔的前景。
树莓属于多年生落叶小灌木果树植物，生长周期相对较短，具有作为大型木本果树研究模式的潜能，以期在理论上建立树莓果实发育模式，鉴定和挖掘树莓品质性状相关的基因，揭示其遗传调控机制，生产上有利于树莓优良种质资源的筛选，后期有望运用基因编辑技术辅助和加快分子育种进程。
全世界约有悬钩子属植物1000余种，主要分布在北半球的温带、寒带和热带地区。其中我国约有悬钩子属植物204种104变种，其中特有种138种，分布在黑龙江、辽宁、贵州、云南等27个省、自治区，拥有丰富的野生资源。
我国树莓野生资源丰富，分布广泛，因此，当下充分开发利用我国树莓野生资源，加快技术积累和育种进程极为迫切。
发明内容
本发明旨在提供一种树莓离体再生培养的方法，以充分开发利用我国树莓野生资源。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种树莓离体再生培养的方法。该方法包括以下步骤：选择茎干半木质化的树莓植株，取休眠的腋芽作为外植体材料；将休眠的腋芽进行消毒处理；剥去消毒后的休眠的腋芽的外表皮鳞片组织，切去芽底部，留下2～5mm的芽尖端；将芽尖端接种于增殖培养基中进行光照增殖培养；将光照增殖培养后的芽尖端移入生根培养基进行光照生根培养，得到组培树莓苗。
进一步地，方法还包括：将组培树莓苗进行炼苗移栽的步骤。
进一步地，炼苗移栽包括将组培树莓苗放置于温室大棚中练苗5～10天，然后将组培树莓苗移栽至大田中生长；优选的，温室大棚中的温度为22～25℃，湿度为60～70％，光照强度为6～10klux。
进一步地，消毒处理包括：用休眠的腋芽放入75％乙醇溶液消毒处理5～10s，用无菌水洗2-3次；接着用30％次氯酸钠消毒10～15min,无菌水冲洗至少6遍。
进一步地，增殖培养基包括4.43g/L MS培养基、3.5g/L Phytagel、20g/L蔗糖、0.5～0.8mg/L6-BA、0.1～0.3mg/L TDZ和0.1～0.3mg/L NAA，pH＝5.8。
进一步地，增殖培养基包括4.43g/L MS培养基、3.5g/L Phytagel、20g/L蔗糖、0.6mg/L6-BA、0.2mg/L TDZ和0.1mg/L NAA，pH＝5.8。
进一步地，生根培养基包括4.43g/L MS、3.5g/L Phytagel、20g/L sucrose和0.1mg/L IBA，pH＝5.8。
进一步地，增殖培养的温度为22～25℃，光照强度为6～10klux，光周期为14h/10h。
进一步地，生根培养的温度为22～25℃，光照强度为6～10klux，光周期为14h/10h。
进一步地，树莓植株的品种为波尔卡、哈瑞太兹、苏蜜特、波鲁特、黑树莓或秋福。
本发明的树莓再生方法具有广谱性，在不同的树莓品种上均可高效离体再生培养，且发芽率高，培养周期短，可作为树莓资源在农业上使用，具有广泛的应用价值和推广价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了树莓离体再生培养图；以及
图2示出了再生树莓苗示意图。
图3示出了树莓离体再生培养图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
为了充分开发利用我国树莓野生资源，加快技术积累和育种进程，根据本发明一种典型的实施方式，提供一种树莓离体再生培养的方法。该方法包括以下步骤：选择茎干半木质化的树莓植株，取休眠的腋芽作为外植体材料；将休眠的腋芽进行消毒处理；剥去消毒后的休眠的腋芽的外表皮鳞片组织，切去芽底部，留下2～5mm的芽尖端；将芽尖端接种于增殖培养基中进行光照增殖培养；将光照增殖培养后的芽尖端移入生根培养基进行光照生根培养，得到组培树莓苗。
其中，半木质化是指嫩枝至木质化枝条的过渡生长阶段。一般来说半木质化枝条是指一年生枝条。植物的木质化枝条具有形成层和韧皮，有传输水份的功能，形成层以内至木心已硬化，而半木质化枝条整个枝条都能传输水份，枝条较软，有一定的韧性和硬度。半木质化枝条生命力强于木质化枝条。
本发明的树莓再生方法具有广谱性，在不同的树莓品种上均可高效离体再生培养，且发芽率高，培养周期短，可作为树莓资源在农业上使用，具有广泛的应用价值和推广价值。
为了提高后期树莓的成活率，本发明的树莓离体再生培养的方法还包括：将组培树莓苗进行炼苗移栽的步骤。优选的，炼苗移栽包括将组培树莓苗放置于温室大棚中练苗10天，然后将组培树莓苗移栽至大田中生长；优选的，温室大棚中的温度为22～25℃，湿度为60～70％，光照强度为6～10klux。以使树莓苗能够尽快的适应自然生长环境。
在本发明一优选的实施方式中，消毒处理包括：用休眠的腋芽放入75％乙醇溶液消毒处理5-10s，用无菌水洗2-3次；接着用30％次氯酸钠消毒10-15min,无菌水冲洗至少6遍。
根据本发明一种典型的实施方式，增殖培养基包括4.43g/L MS培养基(Murashigeand Skoog Stock)、3.5g/L Phytagel(植物凝胶)、20g/L sucrose(蔗糖)、0.5-0.8mg/L 6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄基腺嘌呤)、0.1-0.3mg/L TDZ(Thidiazuron，噻苯隆)和0.1-0.3mg/L NAA(Naphthaleneacetic Acid，萘乙酸)，pH＝5.8；优选的，增殖培养基包括4.43g/L MS培养基、3.5g/L Phytagel、20g/L蔗糖、0.6mg/L 6-BA、0.2mg/L TDZ和0.1mg/LNAA，pH＝5.8。此配方特别适合树莓的培植。将消毒后的树莓腋芽置于增殖培养基中培养，20～30天腋芽开始展开。优选的，增殖培养的温度为22～24℃，光照强度为6-10klux，光周期为14h/10h。
根据本发明一实施例，生根培养基包括4.43g/L MS、3.5g/L Phytagel、20g/Lsucrose和0.1～0.3mg/L IBA，pH＝5.8。将长至2cm左右的树莓苗于生根培养基中，15～25天树莓苗开始生根，30天生根率为90％。优选的，生根培养的温度为22～24℃，光照强度为6-10klux，光周期为14h/10h。
本发明的树莓离体再生培养的方法几乎适合所有的树莓品种，特别适合植株的品种为波尔卡、哈瑞太兹、苏蜜特、波鲁特、黑树莓或秋福。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的实验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
实施例1
一种树莓高效离体再生培养的方法，包括以下步骤：
(1)树莓腋芽选择
选择茎干半木质化的树莓植株，用刀片切取尚未萌发的腋芽作为外植体材料；本实验中选择的树莓品种包括波尔卡、哈瑞太兹、苏蜜特、波鲁特、黑树莓、秋福，均种植于本单位的人工智能气候室。
(2)树莓腋芽消毒
将步骤(1)切取的树莓腋芽，放入75％乙醇溶液消毒处理10s，用无菌水洗2-3次；接着用30％次氯酸钠消毒10min,无菌水冲洗至少6遍，得到消毒后的树莓外植体材料；
(3)树莓腋芽处理
将步骤(2)消毒后的树莓腋芽置于灭过菌的培养皿中，用镊子剥去上一步得到的树莓腋芽外表皮鳞片组织，并于无菌滤纸上切去芽底部，留下2-5mm左右的芽尖端；
(4)树莓腋芽培养
将上述步骤(3)处理后的树莓腋芽外植体接种于增殖培养基中，该培养基为4.43g/L MS+3.5g/L Phytagel+20g/L sucrose+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L TDZ+0.1mg/LNAA，pH＝5.8，进行光照培养，培养温度为22-24℃，光照强度为7000lx，光周期为14h/10h，培养20-30天腋芽开始展开；
(5)树莓再生植株生根培养
将上述步骤(4)培养的树莓无菌苗，接种到生根培养基进行生根培养，该培养基为4.43g/L MS+3.5g/L Phytagel+20g/L sucrose+0.1mg/L IBA，pH＝5.8，进行光照培养，培养条件同步骤(4)；
(6)炼苗移栽
将树莓组培苗放置于温室中练苗10天，期间注意保湿，不可暴晒，然后将树莓再生苗移栽至人工智能气候室中生长。
所有树莓品种包括波尔卡、哈瑞太兹、苏蜜特、波鲁特、黑树莓、秋福均得到了长势良好的再生植株，如图1所示，图1示出了实施例1树莓离体再生培养图，树莓增殖培养阶段。图2示出了实施例1再生树莓苗示意图，图片植株为秋福品种，培育时间为3个月左右。
实施例2
一种树莓高效离体再生培养的方法，包括以下步骤：
(1)树莓腋芽选择
选择茎干半木质化的树莓植株，用刀片切取尚未萌发的腋芽作为外植体材料；本实验中选择的树莓品种包括波尔卡、哈瑞太兹(简称哈瑞)、波鲁特，均种植于本单位的人工智能气候室。
(2)树莓腋芽消毒
将步骤(1)切取的树莓腋芽，放入75％乙醇溶液消毒处理10s，用无菌水洗2-3次；接着用30％次氯酸钠消毒10min,无菌水冲洗至少6遍，得到消毒后的树莓外植体材料；
(3)树莓腋芽处理
将步骤(2)消毒后的树莓腋芽置于灭过菌的培养皿中，用镊子剥去上一步得到的树莓腋芽外表皮鳞片组织，并于无菌滤纸上切去芽底部，留下2-5mm左右的芽尖端；
(4)树莓腋芽培养
将上述步骤(3)处理后的树莓腋芽外植体接种于增殖培养基中，该培养基为4.43g/L MS+3.5g/L Phytagel+20g/L sucrose+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L TDZ+0.3mg/LNAA，pH＝5.8，进行光照培养，培养温度为22-24℃，光照强度为7000lx，光周期为14h/10h，培养20-30天腋芽开始展开；
(5)树莓再生植株生根培养
将上述步骤(4)培养的树莓无菌苗，接种到生根培养基进行生根培养，该培养基为4.43g/L MS+3.5g/L Phytagel+20g/L sucrose+0.1mg/L IBA，pH＝5.8，进行光照培养，培养条件同步骤(4)；
(6)炼苗移栽
将树莓组培苗放置于温室中练苗10天，期间注意保湿，不可暴晒，然后将树莓再生苗移栽至人工智能气候室中生长。
图3示出了实施例2树莓离体再生培养图，树莓增殖培养阶段。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：该方法发芽率高，栽培成活率，且栽培周期短，实现了树莓离体的快速组培和繁育，并运用于多种树莓品种，不仅增加了树莓种苗繁殖系数，还可解决树莓种子繁殖困难等问题，组培苗壮实且成活率高，具有广泛的应用价值和推广价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种树莓离体再生培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
选择茎干半木质化的树莓植株，取休眠的腋芽作为外植体材料；
将所述休眠的腋芽进行消毒处理；
剥去消毒后的所述休眠的腋芽的外表皮鳞片组织，切去芽底部，留下2～5mm的芽尖端；
将所述芽尖端接种于增殖培养基中进行光照增殖培养；
将光照增殖培养后的所述芽尖端移入生根培养基进行光照生根培养，得到组培树莓苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述组培树莓苗进行炼苗移栽的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述炼苗移栽包括将所述组培树莓苗放置于温室大棚中练苗5～10天，然后将所述组培树莓苗移栽至大田中生长；
优选的，所述温室大棚中的温度为22～25℃，湿度为60～70％，光照强度为6～10klux。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒处理包括：用所述休眠的腋芽放入75％乙醇溶液消毒处理5～10s，用无菌水洗2-3次；接着用30％次氯酸钠消毒10～15min,无菌水冲洗至少6遍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基包括4.43g/L MS培养基、3.5g/L Phytagel、20g/L蔗糖、0.5～0.8mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/L TDZ和0.1～0.3mg/LNAA，pH＝5.8。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基包括4.43g/L MS培养基、3.5g/L Phytagel、20g/L蔗糖、0.6mg/L 6-BA、0.2mg/L TDZ和0.1mg/L NAA，pH＝5.8。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基包括4.43g/L MS、3.5g/LPhytagel、20g/L sucrose和0.1mg/L IBA，pH＝5.8。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养的温度为22～25℃，光照强度为6～10klux，光周期为14h/10h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养的温度为22～25℃，光照强度为6～10klux，光周期为14h/10h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树莓植株的品种为波尔卡、哈瑞太兹、苏蜜特、波鲁特、黑树莓或秋福。
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