CN107864863A - 一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基及其培养方法。该培养基各成分配比为：MS培养基、2,4‑二氯苯氧乙酸1.5～2mg/L、6‑苄氨基腺嘌呤1.5～2mg/L、酵母提取物0～300mg/L、水解酪蛋白600～650mg/L、蔗糖25～32g/L和植物凝胶3.8～4.5g/L；采用上述培养基诱导麦芽愈伤组织的方法，包括以下步骤：(1)配置培养基，灭菌备用；(2)将藜麦种子置于添加30g/L蔗糖含1/2倍MS培养基含量的生根培养基中，培养5～7天后备用；(3)初代愈伤组织诱导；(4)继代培养。本发明建立了快速诱导藜麦愈伤组织分化的诱导体系。

Description

一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基及其培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基及其培养方法。
背景技术
藜麦(Chenopodium quinoa willd)是苋科(Amaranthaceae)藜属(Chenopodium)一年生双子叶假谷物，起源于玻利维亚和秘鲁，在安第斯地区种植栽培历史已有5000多年。藜麦被联合国粮农组织(FAO)认定为唯一的单一植物，即可满足人体基本营养需求的“全营养食品”。由于其超高的营养价值和经济价值，近年来藜麦在全世界范围内引起各国科学家广泛的关注，并有大量科学家投入到藜麦的分子遗传育种、品种改良的研究。然而，由于藜麦的遗传转化体系尚未成熟，严重阻碍了藜麦优质基因资源的发掘与功能验证，影响了该科研领域的发展。愈伤组织的诱导是藜麦遗传转化体系建立的关键技术。目前，尚未有成熟的藜麦愈伤组织快速诱导体系，因此藜麦愈伤组织诱导培养体系的建立有利于加快藜麦分子遗传学的发展，为后期分子遗传育种奠定坚实的基础。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基及其培养方法，可快速诱导藜麦愈伤组织分化。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基，培养基pH值为5.8～6.0，包括：
MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸1.5～2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5～2mg/L、酵母提取物0～300mg/L、水解酪蛋白600～650mg/L、蔗糖25～32g/L和植物凝胶3.8～4.5g/L。
进一步地，包括：
MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L、酵母提取物300mg/L、水解酪蛋白600mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶4.4g/L。
采用上述培养基诱导麦芽愈伤组织的方法，包括以下步骤：
(1)按配方将培养基的各组分混匀，调节pH值为5.8～6.0，然后于0.1MPa、121℃下，蒸汽灭菌15～20min，冷却备用；
(2)将藜麦种子消毒后置于添加30g/L蔗糖和含1/2倍MS培养基含量的生根培养基中，于光强10000～12000Lx，相对湿度为30％～40％，温度25℃下，每日光照时数14～16h，培养5-7天；
(3)初代愈伤组织诱导：将长出的藜麦幼苗的下胚轴剪成0.5-1.0cm的小段，接种于步骤(1)所得培养基中，于光强10000～12000Lx，相对湿度为30％～40％，20～25℃下，每日光照14～16h，培养21～22天，诱导出初代愈伤组织；
(4)继代培养：从初代愈伤组织中选择直径为1mm-2mm左右的愈伤组织，接种至步骤(1)所得培养基中，于光强10000～12000Lx，相对湿度为30％～40％，20～25℃下，每日光照14～16h，培养14～16d，获得密致健康的藜麦愈伤组织。
进一步地，步骤(2)中消毒过程为：将藜麦种子在超净工作上用50～75％无水乙醇消毒30～50s，然后用3～5％次氯酸钠消毒5-8min，再用无菌水冲洗3-5次。
进一步地，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中培养条件为：光强12000Lx、相对湿度30％、25℃下，每日光照16h，培养21～22天。
本发明的有益效果为：
1、采用本发明方法配置的培养基，并在本发明方法中提及的培养条件的配合下，仅需6周即可快速诱导出藜麦愈伤组织，所需时间较其它方法大大缩短。
2、本发明提出采用酵母提取物为有效添加物，促进外植体被诱导为愈伤组织。
3、本发明诱导出的愈伤组织质地坚实，密致，且多为胚性愈伤组织，适合用于后期农杆菌或基因枪等方法介导的遗传转化法。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基，其pH值为6.0，包括：
MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L、酵母提取物300mg/L、水解酪蛋白600mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶4.4g/L。
其中，MS培养基包括大量元素、微量元素、铁盐和有机元素；
大量元素包括以下组分：NH4NO3 1650.0mg/L、CaCl2 332.2mg/L、MgSO4 180.7mg/L、KNO3 1900.0mg/L以及KH2PO4 170.0mg/L。
微量元素包括以下组分：CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L以及KI 0.83mg/L。
铁盐包括以下组分：FeSO4·7H2O 27.8mg/L和Na2-EDTA 37.26mg/L。
有机元素包括以下组分：甘氨酸2.0mg/L、肌醇100.0mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B60.5mg/L以及维生素B1 0.1mg/L。
采用上述培养基诱导麦芽愈伤组织的方法，包括以下步骤：
(1)按配方将培养基的各组分混匀，调节pH值为6.0，然后于0.1MPa、121℃下，蒸汽灭菌15min，冷却后倒入无菌培养杯中备用；
(2)将藜麦种子在超净工作上用75％无水乙醇消毒30s，然后用3％次氯酸钠消毒8min，最后用无菌水冲洗4次，将消毒后的种子放置添加30g/L蔗糖和含1/2倍MS培养基含量的生根培养基中，于光强10000Lx，相对湿度为40％，温度22℃下，每日光照14h，培养5-7天后备用；
(3)初代愈伤组织诱导：将长出的藜麦幼苗的下胚轴用剪刀剪成0.5-1.0cm的小段，接种于步骤(1)所得培养基中，于光强10000Lx，相对湿度为40％，22℃下，每日光照14h，培养21天，诱导出初代愈伤组织；
(4)继代培养：从初代愈伤组织分离的愈伤组织中选择直径为1mm-2mm左右的颗粒愈伤，接种至步骤(1)所得培养基中，于光强10000Lx，相对湿度为40％，22℃下，每日光照14h，培养14d即可获得密致健康的藜麦愈伤组织。
实施例2
一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基，其pH值为6.0，包括：
MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L、酵母提取物200mg/L、水解酪蛋白650mg/L、蔗糖32g/L和植物凝胶4.5g/L。
其中，MS培养基包括大量元素、微量元素、铁盐和有机元素；
大量元素包括以下组分：NH4NO3 1650.0mg/L、CaCl2 332.2mg/L、MgSO4 180.7mg/L、KNO3 1900.0mg/L以及KH2PO4 170.0mg/L。
微量元素包括以下组分：CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L以及KI 0.83mg/L。
铁盐包括以下组分：FeSO4·7H2O 27.8mg/L和Na2-EDTA 37.26mg/L。
有机元素包括以下组分：甘氨酸2.0mg/L、肌醇100.0mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B60.5mg/L以及维生素B1 0.1mg/L。
采用上述培养基诱导麦芽愈伤组织的方法，包括以下步骤：
(1)按配方将培养基的各组分混匀，调节pH值为5.8，然后于0.1MPa、121℃下，蒸汽灭菌20min，冷却后倒入无菌培养杯中备用；
(2)将藜麦种子在超净工作上用70％无水乙醇消毒50s，然后用5％次氯酸钠消毒8min，最后用无菌水冲洗5次，将消毒后的种子放置添加30g/L蔗糖和和含1/2倍MS培养基含量的生根培养基中，生根培养基中，于光强12000Lx，相对湿度为30％，温度25℃下，每日光照16h，培养5-7天后备用；
(3)初代愈伤组织诱导：将长出的藜麦幼苗的下胚轴用剪刀剪成0.5-1.0cm的小段，接种于步骤(1)所得培养基中，于光强12000Lx，相对湿度为30％，25℃下，每日光照16h，培养21天，诱导出初代愈伤组织；
(4)继代培养：从初代愈伤组织分离的愈伤组织中选择直径为1mm-2mm左右的颗粒愈伤，接种至步骤(1)所得培养基中，于光强12000Lx，相对湿度为30％，25℃下，每日光照16h，培养14d即可获得密致健康的藜麦愈伤组织。
实施例3
一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基，其pH值为5.8，包括：
MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸1.8mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.6mg/L、酵母提取物100mg/L、水解酪蛋白600mg/L、蔗糖25g/L和植物凝胶3.8g/L。
其中，MS培养基包括大量元素、微量元素、铁盐和有机元素；
大量元素包括以下组分：NH4NO3 1650.0mg/L、CaCl2 332.2mg/L、MgSO4 180.7mg/L、KNO3 1900.0mg/L以及KH2PO4 170.0mg/L。
微量元素包括以下组分：CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L以及KI 0.83mg/L。
铁盐包括以下组分：FeSO4·7H2O 27.8mg/L和Na2-EDTA 37.26mg/L。
有机元素包括以下组分：甘氨酸2.0mg/L、肌醇100.0mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B60.5mg/L以及维生素B1 0.1mg/L。
采用上述培养基诱导麦芽愈伤组织的方法，包括以下步骤：
(1)按配方将培养基的各组分混匀，调节pH值为5.8，然后于0.1MPa、121℃下，蒸汽灭菌20min，冷却后倒入无菌培养杯中备用；
(2)将藜麦种子在超净工作上用50％无水乙醇消毒50s，然后用3％次氯酸钠消毒5min，最后用无菌水冲洗5次，将消毒后的种子放置添加30g/L蔗糖和和含1/2倍MS培养基含量的生根培养基中，生根培养基中，于光强11000Lx，相对湿度为35％，温度25℃下，每日光照14h，培养5-7天后备用；
(3)初代愈伤组织诱导：将长出的藜麦幼苗的下胚轴用剪刀剪成0.5-1.0cm的小段，接种于步骤(1)所得培养基中，于光强11000Lx，相对湿度为40％，25℃下，每日光照14h，培养21天，诱导出初代愈伤组织；
(4)继代培养：从初代愈伤组织分离的愈伤组织中选择直径为1mm-2mm左右的颗粒愈伤，接种至步骤(1)所得培养基中，于光强11000Lx，相对湿度为40％，25℃下，每日光照14h，培养14d即可获得密致健康的藜麦愈伤组织。
实施例4
一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基，其pH值为5.8，包括：
MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸1.8mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.6mg/L、水解酪蛋白600mg/L、蔗糖25g/L和植物凝胶3.8g/L。
其中，MS培养基包括大量元素、微量元素、铁盐和有机元素；
大量元素包括以下组分：NH4NO3 1650.0mg/L、CaCl2 332.2mg/L、MgSO4 180.7mg/L、KNO3 1900.0mg/L以及KH2PO4 170.0mg/L。
微量元素包括以下组分：CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L以及KI 0.83mg/L。
铁盐包括以下组分：FeSO4·7H2O 27.8mg/L和Na2-EDTA 37.26mg/L。
有机元素包括以下组分：甘氨酸2.0mg/L、肌醇100.0mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B60.5mg/L以及维生素B1 0.1mg/L。
采用上述培养基诱导麦芽愈伤组织的方法，包括以下步骤：
(1)按配方将培养基的各组分混匀，调节pH值为5.8，然后于0.1MPa、121℃下，蒸汽灭菌20min，冷却后倒入无菌培养杯中备用；
(2)将藜麦种子在超净工作上用50％无水乙醇消毒50s，然后用3％次氯酸钠消毒5min，最后用无菌水冲洗5次，将消毒后的种子放置添加30g/L蔗糖和和含1/2倍MS培养基含量的生根培养基中，生根培养基中，于光强11000Lx，相对湿度为35％，温度25℃下，每日光照14h，培养5-7天后备用；
(3)初代愈伤组织诱导：将长出的藜麦幼苗的下胚轴用剪刀剪成0.5-1.0cm的小段，接种于步骤(1)所得培养基中，于光强11000Lx，相对湿度为40％，25℃下，每日光照14h，培养21天，诱导出初代愈伤组织；
(4)继代培养：从初代愈伤组织分离的愈伤组织中选择直径为1mm-2mm左右的颗粒愈伤，接种至步骤(1)所得培养基中，于光强11000Lx，相对湿度为40％，25℃下，每日光照14h，培养14d即可获得密致健康的藜麦愈伤组织。
对比例
与实施例2相比，藜麦诱导培养基的配方为：MS培养基、30g/L蔗糖、激动素0.1mg/L、吲哚乙酸3mg/L、萘乙酸3mg/L以及琼脂粉1500mg/L，其余诱导过程均与实施例2相同。
检测实施例2和对比例诱导藜麦愈伤组织的诱导率，其中，对比例所述培养基诱导藜麦愈伤组织的诱导率较低，仅有15％～20％左右，时间需要8周；
而采用本发明的培养基愈伤诱导率达98％以上；诱导藜麦愈伤组织所需时间为6周，较对比培养基诱导时间缩短2周。

Claims (5)

1.一种用于诱导藜麦愈伤组织的培养基，其特征在于，所述培养基pH值为5.8～6.0，包括：
MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸1.5～2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5～2mg/L、酵母提取物0～300mg/L、水解酪蛋白600～650mg/L、蔗糖25～32g/L和植物凝胶3.8～4.5g/L。
2.根据权利要求1所述的用于诱导藜麦愈伤组织的培养基，其特征在于，包括：
MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L、酵母提取物300mg/L、水解酪蛋白600mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶4.4g/L。
3.采用权利要求1或2所述培养基诱导麦芽愈伤组织的方法，包括以下步骤：
(1)按配方将培养基的各组分混匀，调节pH值为5.8～6.0，然后于0.1MPa、121℃下，蒸汽灭菌15～20min，冷却备用；
(2)将藜麦种子消毒后置于添加30g/L蔗糖和含1/2倍MS培养基含量的生根培养基中，于光强10000～12000Lx，相对湿度为30％～40％，温度25℃下，每日光照时数14～16h，培养5-7天；
(3)初代愈伤组织诱导：将长出的藜麦幼苗的下胚轴剪成0.5-1.0cm的小段，接种于步骤(1)所得培养基中，于光强10000～12000Lx，相对湿度为30％～40％，20～25℃下，每日光照14～16h，培养21～22天，诱导出初代愈伤组织；
(4)继代培养：从初代愈伤组织中选择直径为1mm-2mm左右的愈伤组织，接种至步骤(1)所得培养基中，于光强10000～12000Lx，相对湿度为30％～40％，20～25℃下，每日光照14～16h，培养14～16d，获得密致健康的藜麦愈伤组织。
4.根据权利要求3所述的诱导麦芽愈伤组织的方法，其特征在于，步骤(2)中所述消毒过程为：将藜麦种子在超净工作上用50～75％无水乙醇消毒30～50s，然后用3～5％次氯酸钠消毒5-8min，再用无菌水冲洗3-5次。
5.根据权利要求3所述的诱导麦芽愈伤组织的方法，其特征在于，步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中所述培养条件为：光强12000Lx、相对湿度30％、25℃下，每日光照16h，培养21～22天。
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