CN107306791A - 一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，包括材料选择和处理、外植体消毒、不定芽诱导和增殖、生根壮苗培养和步骤。在不定芽诱导和增殖步骤将丛生芽切割成单个芽，然后接种到生根壮苗培养基上进行培养，得到完整植株；不定芽诱导和增殖培养为在改良MS的基础上添加3.0‑5.0毫克/升6‑苄基腺嘌呤、3.0‑5.0毫克/升激动素、1.0‑2.0毫克/升萘乙酸和10‑20%的椰子汁；生根壮苗培养基为改进MS培养基，在改进MS的基础上添加0.5‑1.0毫克/升的萘乙酸、0.5‑1.0毫克/升的吲哚丁酸、50‑150克/升的香蕉汁、0.5‑1.0克/升的活性炭，改进MS培养基为1/2 MS。本发明采用一年生嫩芽进行组织培养繁殖，具有繁殖速度快、种苗品质优良、后代性状统一等特点，只需要简单的组织培养设备就可以完成。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，特别涉及一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法。
背景技术
黄石斛（Dendrobiumtosaense Makino）属于兰科石斛属，仅产于我国江西、广东、台湾地区及日本等地，常被误认为铁皮石斛，在日本和我国台湾地区已被作为中药材广泛应用，产量比铁皮石斛产量高，具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力及扩张血管等作用；同时，黄石斛花朵黄绿色，具有较高的观赏价值，可应用于盆栽观赏，具有广阔的应用前景。但由于黄石斛种源稀缺，严重地制约了其产业的发展。
目前世界上还没有黄石斛种苗繁殖专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，包括下列步骤：
第一步：在超净工作台上，将外植体切除叶片后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水冲洗，接下来再用升汞溶液消毒，然后再用无菌水冲洗；然后接种到外植体培养基上；其中：所述外植体培养基为改良MS培养基，在改良MS培养基的基础上添加3.0-5.0毫克/升6-苄基腺嘌呤、3.0-5.0毫克/升激动素、1.0-2.0毫克/升萘乙酸以及改进MS培养基质量的10-20%的椰子汁，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；
第二步：接种后每隔35-45天更换所述外植体培养基一次，至第5次时开始将所述外植体培养基中的6-苄基腺嘌呤和激动素浓度均降至1.5－2.5毫克/升，培养得到丛生芽；
第三步：将第二步培养得到的丛生芽切割成单个芽，然后接种到生根壮苗培养基上进行培养，得到完整植株；所述生根壮苗培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加0.5-1.0毫克/升的萘乙酸、0.5-1.0毫克/升的吲哚丁酸、50-150克/升的香蕉汁、0.5-1.0克/升的活性炭，所述改进MS培养基为1/2 MS培养基；
第四步：将完整植株转移到具有自然光的温室中炼苗10-15 天，然后洗净根部的培养基，接下来用苔藓包裹所述完整植株的根系，然后以苔藓为基质种植进行培养。
优选的技术方案为：所述外植体为黄石斛当年生嫩芽。
优选的技术方案为：所述黄石斛当年生嫩芽在作为外植体之前，先用500-800倍的多菌灵浇灌一次黄石斛，并且用500-800倍的多菌灵喷施叶片；一星期之后再用72%的农用链霉素可溶性粉剂的3000-4000倍液浇灌一次黄石斛，并用72%的农用链霉素可溶性粉剂的3000-4000倍液喷施叶片，然后两周内重复一次。
优选的技术方案为：接种前用消过毒的解剖刀切取长度2-4厘米的黄石斛侧芽为外植体。
优选的技术方案为：将外植体用体积浓度为70-80%的酒精浸泡30-60秒。
优选的技术方案为：所述升汞溶液的质量百分比浓度为0.1%。
优选的技术方案为：所述苔藓使用之前用水浸泡24-48小时。
上述技术方案中：所述MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。基于此，这种培养基就用他们的名字来命名了。大量元素是指：NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明采用一年生嫩芽进行组织培养繁殖，具有繁殖速度快、种苗品质优良、后代性状统一等特点，只需要简单的组织培养设备就可以完成。
具体实施方式
以下对本发明之实施方式做更详细的说明，使熟悉该项技艺者在阅读本说明书后能据以实施。
本文中使用的术语的目的仅在于说明特别实施例，并不意图对本发明做限制。除非上下文明确显示，否则本文中使用的单数形式“一”、“一个”、“该”亦旨在包括复数形式。
在说明较佳实施例时，可能基于清楚的目的而使用特别的术语；然而，本说明书所揭露者并不意图被限制在所选择的该特别术语；并且应当理解，每一个特定元件包括具有相同功能、以相似方式操作并达成相似效果的所有等效技术。
实施例1：一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法
（1）材料选择和处理
选择植株生长健壮、生长势强的黄石斛当年生嫩芽为外植体。在切取外植体28天前，先用500倍的多菌灵浇灌一次并喷施叶片，一星期后再用72%农用链霉素可溶性粉剂4000倍浇灌一次并喷施叶片。然后两周内重复上述步骤。接种前用75%酒精消过毒的解剖刀切取长度2厘米的侧芽为外植体。
（2）外植体消毒
在超净工作台上将切下的外植体切除叶片，先用70%酒精中浸泡10秒后，用0.1%升汞溶液消毒5分钟，无菌水冲洗４次，再用0.1%升汞溶液消毒4分钟，无菌水冲洗４次。接种到外植体培养基，所述外植体培养基为改良MS培养基，在改良MS培养基的基础上添加3.0毫克/升6-苄基腺嘌呤、3.0毫克/升激动素、1.0毫克/升萘乙酸（即每升改进MS培养基添加1毫克的萘乙酸）以及改进MS培养基质量的10%的椰子汁，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；消毒成功率70%。
（3）不定芽诱导和增殖
接种后培养30天外植体茎节上形成不定芽。以后每隔45天在和初代培养相同的培养基上继代一次，至第4代时，增殖系数可达到4.0倍。第5代开始可将培养基中的6-苄基腺嘌呤（6-BA）和激动素（KT）浓度均降至1.5毫克/升，继续增殖，增殖系数可维持在4.0倍。
（5）生根壮苗培养
丛生芽增殖多代后，可将丛生芽切割成单个芽，接种到生根壮苗培养基上进行生根壮苗培养。40天左右能形成株高4厘米的带根的完整植株。所述生根壮苗培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加0.5毫克/升的萘乙酸、0.5毫克/升的吲哚丁酸、50克/升的香蕉汁、0.5克/升的活性炭，所述改进MS培养基为1/2 MS培养基（MS培养基均减半）。
（6）试管苗移栽
春季和秋季是试管苗出瓶的适宜时期，将具4厘米高完整植株将培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10 天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入用水浸泡24小时的进口苔藓为基质，种植时将苔藓的水分拧干，包裹根系基地种植于穴盘中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90%。
基质含蔗糖含量20克/升，pH 5.6，琼脂7g/L，在实验中所采用的培养温度24℃，光照度1500 lx，光照12小时/天。
实施例2: 一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法
（1）材料选择和处理
选择植株生长健壮、生长势强的黄石斛当年生嫩芽为外植体。在切取外植体28天前，先用600倍的多菌灵浇灌一次并喷施叶片，一星期后再用72%农用链霉素可溶性粉剂3500倍浇灌一次并喷施叶片。然后两周内重复上述步骤。接种前用75%酒精消过毒的解剖刀切取长度3厘米的侧芽为外植体。
（2）外植体消毒
在超净工作台上将切下的外植体切除叶片，先用75%酒精中浸泡20秒后，用0.1%升汞溶液消毒7.5 分钟，无菌水冲洗５次，再用0.1%升汞溶液消毒5 分钟，无菌水冲洗5次。接种到外植体培养基，所述外植体培养基为改良MS培养基，在改良MS培养基的基础上添加4.0毫克/升6-苄基腺嘌呤、4.0毫克/升激动素、1.5毫克/升萘乙酸（即每升改进MS培养基添加1.5毫克的萘乙酸）以及改进MS培养基质量的15%的椰子汁，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；消毒成功率80%。
（3）不定芽诱导和增殖
接种后培养28天外植体茎节上形成不定芽。以后每隔40天在和初代培养相同的培养基上继代一次，至第4代时，增殖系数可达到4.5倍。第5代开始可将培养基中的6-BA和KT浓度均降至2.0毫克/升，继续增殖，增殖系数可维持在4.5倍。
（5）生根壮苗培养
丛生芽增殖多代后，可将丛生芽切割成单个芽，接种到生根壮苗培养基上进行生根壮苗培养。40天左右能形成株高5厘米的带根的完整植株。所述生根壮苗培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加0.75毫克/升的萘乙酸、0.75毫克/升的吲哚丁酸、100克/升的香蕉汁、0.75克/升的活性炭，所述改进MS培养基为1/2 MS培养基（MS培养基均减半）。
（6）试管苗移栽
春季和秋季是试管苗出瓶的适宜时期，将具5厘米高完整植株将培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗13天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入用水浸泡48小时的进口苔藓为基质，种植时将苔藓的水分拧干，包裹根系基地种植于穴盘中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95%。
基质含蔗糖含量25克/升，pH 5.8，琼脂6.5g/L，在实验中所采用的培养温度26℃，光照度1800 lx，光照14小时/天。
实施例3: 一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法
（1）材料选择和处理
选择植株生长健壮、生长势强的黄石斛当年生嫩芽为外植体。在切取外植体28天前，先用800倍的多菌灵浇灌一次并喷施叶片，一星期后再用72%农用链霉素可溶性粉剂4000倍浇灌一次并喷施叶片。然后两周内重复上述步骤。接种前用75%酒精消过毒的解剖刀切取长度4厘米的侧芽为外植体。
（2）外植体消毒
在超净工作台上将切下的外植体切除叶片，先用80%酒精中浸泡30秒后，用0.1%升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗6次，再用0.1%升汞溶液消毒6分钟，无菌水冲洗6次。接种到外植体培养基，所述外植体培养基为改良MS培养基，在改良MS培养基的基础上添加5.0毫克/升6-苄基腺嘌呤、5.0毫克/升激动素、2.0毫克/升萘乙酸（即每升改进MS培养基添加2毫克的萘乙酸）以及改进MS培养基质量的20%的椰子汁，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；消毒成功率80%。
（3）不定芽诱导和增殖
接种后培养25天外植体茎节上形成不定芽。以后每隔35天在和初代培养相同的培养基上继代一次，至第4代时，增殖系数可达到5.0倍。第5代开始可将培养基中的6-BA和KT浓度均降至2.5毫克/升，继续增殖，增殖系数可维持在5.0倍。
（5）生根壮苗培养
丛生芽增殖多代后，可将丛生芽切割成单个芽，接种到生根壮苗培养基上进行生根壮苗培养。40天左右能形成株高6厘米的带根的完整植株。所述生根壮苗培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加1毫克/升的萘乙酸、1毫克/升的吲哚丁酸、150克/升的香蕉汁、1克/升的活性炭，所述改进MS培养基为1/2 MS培养基（MS培养基均减半）。
（6）试管苗移栽
春季和秋季是试管苗出瓶的适宜时期，将具6厘米高完整植株将培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗15 天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入用水浸泡72小时的进口苔藓为基质，种植时将苔藓的水分拧干，包裹根系基地种植于穴盘中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达98%。
基质含蔗糖含量30克/升，pH 6.0，琼脂6g/L，在实验中所采用的培养温度28℃，光照度2000 lx，光照16小时/天。
实施例4: 一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法
一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，包括下列步骤：
第一步：在超净工作台上，将外植体切除叶片后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水冲洗，接下来再用升汞溶液消毒，然后再用无菌水冲洗；然后接种到外植体培养基上；其中：所述外植体培养基为改良MS培养基，在改良MS培养基的基础上添加4.2毫克/升6-苄基腺嘌呤、3.8毫克/升激动素、1.5毫克/升萘乙酸以及改进MS培养基质量的13%的椰子汁，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；
第二步：接种后每隔35天更换所述外植体培养基一次，至第5次时开始将所述外植体培养基中的6-苄基腺嘌呤和激动素浓度均降至1.55毫克/升，培养得到丛生芽；
第三步：将第二步培养得到的丛生芽切割成单个芽，然后接种到生根壮苗培养基上进行培养，得到完整植株；所述生根壮苗培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加0.7毫克/升的萘乙酸、0.6毫克/升的吲哚丁酸、98克/升的香蕉汁、0.7克/升的活性炭，所述改进MS培养基为1/2 MS培养基；
第四步：将完整植株转移到具有自然光的温室中炼苗10 天，然后洗净根部的培养基，接下来用苔藓包裹所述完整植株的根系，然后以苔藓为基质种植进行培养。
优选的实施方式为：所述外植体为黄石斛当年生嫩芽。
优选的实施方式为：所述黄石斛当年生嫩芽在作为外植体之前，先用600倍的多菌灵浇灌一次黄石斛，并且用500倍的多菌灵喷施叶片；一星期之后再用72%的农用链霉素可溶性粉剂的3000倍液浇灌一次黄石斛，并用72%的农用链霉素可溶性粉剂的3000倍液喷施叶片，然后两周内重复一次。
优选的实施方式为：接种前用消过毒的解剖刀切取长度4厘米的黄石斛侧芽为外植体。
优选的实施方式为：将外植体用体积浓度为72%的酒精浸泡38秒。
优选的实施方式为：所述升汞溶液的质量百分比浓度为0.1%。
优选的实施方式为：所述苔藓使用之前用水浸泡28小时。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (7)
1.一种黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：在超净工作台上，将外植体切除叶片后用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水冲洗，接下来再用升汞溶液消毒，然后再用无菌水冲洗；然后接种到外植体培养基上；其中：所述外植体培养基为改良MS培养基，在改良MS培养基的基础上添加3.0-5.0毫克/升6-苄基腺嘌呤、3.0-5.0毫克/升激动素、1.0-2.0毫克/升萘乙酸以及改进MS培养基质量的10-20%的椰子汁，所述改良MS培养基为大量元素减半的MS培养基；
第二步：接种后每隔35-45天更换所述外植体培养基一次，至第5次时开始将所述外植体培养基中的6-苄基腺嘌呤和激动素浓度均降至1.5－2.5毫克/升，培养得到丛生芽；
第三步：将第二步培养得到的丛生芽切割成单个芽，然后接种到生根壮苗培养基上进行培养，得到完整植株；所述生根壮苗培养基为改进MS培养基，在改进MS培养基的基础上添加0.5-1.0毫克/升的萘乙酸、0.5-1.0毫克/升的吲哚丁酸、50-150克/升的香蕉汁、0.5-1.0克/升的活性炭，所述改进MS培养基为1/2 MS培养基；
第四步：将完整植株转移到具有自然光的温室中炼苗10-15 天，然后洗净根部的培养基，接下来用苔藓包裹所述完整植株的根系，然后以苔藓为基质种植进行培养。
2.根据权利要求1所述的黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述外植体为黄石斛当年生嫩芽。
3.根据权利要求2所述的黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述黄石斛当年生嫩芽在作为外植体之前，先用500-800倍的多菌灵浇灌一次黄石斛，并且用500-800倍的多菌灵喷施叶片；一星期之后再用72%的农用链霉素可溶性粉剂的3000-4000倍液浇灌一次黄石斛，并用72%的农用链霉素可溶性粉剂的3000-4000倍液喷施叶片，然后两周内重复一次。
4.根据权利要求1所述的黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于：接种前用消过毒的解剖刀切取长度2-4厘米的黄石斛侧芽为外植体。
5.根据权利要求1所述的黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于：将外植体用体积浓度为70-80%的酒精浸泡30-60秒。
6.根据权利要求1所述的黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述升汞溶液的质量百分比浓度为0.1%。
7.根据权利要求1所述的黄石斛种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述苔藓使用之前用水浸泡24-48小时。
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