CN105104147B - 一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法 - Google Patents

一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法，该方法在水稻幼芽阶段接种稻瘟病菌，因而能在短期内获得接种发病结果，实施方法步骤如下：1)准备配套营养液；2)配备育苗琼脂基质；3)播种；4)在封闭小生境内培育水稻幼芽；5)准备接种体孢子液；6)接种病菌；7)接种后培育管理。本发明的优点是：整套方法全程时间短，从播种到典型发病一般只需要8天；温度、湿度、水肥和小生境微生物等重要发病条件均能高度一致，而且容易控制；容易创造无菌的育苗环境；实施操作简易，总体技术简单，容易实现技术方法的标准化。

Description

一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法
技术领域
本发明涉及植物病理学技术和微生物学技术。具体是一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法。
背景技术
稻瘟病是我国水稻生产的重大病害，大流行年曾给我国造成稻粮损失150亿公斤。尽管目前对稻瘟病的认识已相当深入，但要实现持续安全高效地控防稻瘟病的危害，仍需要大量的研究投入。而稻瘟病的许多研究均离不开人工诱发病害这基本手段，即使是分子领域的研究，如病菌致病相关基因问题，或寄主抗病相关基因问题，往往都需要人工诱发病害的结果来解答。至今，有关稻瘟病人工诱发病害的技术已经相当成熟，这些诱发病害技术归结起来，主要有水稻成株期接种发病和苗期接种发病方法两大类。通常成株期诱发病害能获得较为切合生产实际的结果，因而在水稻抗病性评比和某些生产试验中应用较多，但在成株期诱发病害的方法体系中，存在耗时费力；颇占空间场地；环境条件容易影响试验结果等突出弊病；因而限制了其在许多试验工作中的应用。一般地，苗期诱发病害的方法，使用的稻苗比成株期的相对地小，试验占用时间和空间方面，与成株期诱发病害相比，已大有改观。不过，目前广为应用的苗期诱发病害方法均是在稻苗的3～5叶期后，利用完全展开的幼苗叶片进行接种，这种方法体系中，育苗耗时2周以上，接种观察耗时1周以上，试验周期通常要跨越3周多的时长，这对某些要求短期内获得结果的研究工作，如分子植病研究的致病突变体鉴定，抗病基因表达，以及侵染过程的病菌-寄主互作信息传递等，仍有耗时过长之嫌；而且，为获得健壮的稻苗，需要提供充分的阳光和补充营养，整个方法体系仍需使用温室等较大的空间场地；试验期间的湿度、温度、肥水等局部条件控制，也存在较大的技术难度，或者颇受装备条件的限制等。
发明内容
本发明的目的是提供一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法，是利用琼脂作育苗基质，在微小水稻幼芽阶段，接种稻瘟病菌，因而能在短期内获得接种发病结果，快捷诱发稻瘟病方法的步骤如下：
1.准备配套营养液
按比例配备配套营养液，该营养液组分为：硝酸钾0.5g、磷酸二氢钾0.5g、尿素0.5g、水1000.0ml。
2.配备育苗琼脂基质
用琼脂与步骤1配备的营养液组配成育苗基质，组配比例为：琼脂4g、营养液1000ml；加热至琼脂充分熔化后，分别倒入洁净的培养皿内，冷却后凝固形成平板，即为育苗琼脂基质。
3.播种
按常规条件将水稻种子浸种和催芽，获得露白萌发种子，用小镊子夹取已露白萌发的水稻种子，分别播埋在步骤2备好的培养皿育苗琼脂基质内。
4.在封闭的小生境内培育水稻幼芽
步骤3播种完毕后，将培养皿及其盛载的材料一起置于小方盘内，取保湿罩将培养皿全部罩在小方盘内，往小方盘内注入薄层清水，使保湿罩内处于封闭状态，然后将该全套育苗器具转到普通实验室内近窗口的桌面上，在室温为28℃条件下培育水稻，直至第一完全叶生长露出，形成针状幼芽。
5.准备接种体孢子液
按常规方法培养制备稻瘟病菌的分生孢子，用清水将孢子洗脱悬浮，配成孢子浓度为1×106个/ml的孢子液，作为接种体孢子液。
6.接种病菌
将步骤5准备的孢子液装入喷雾器，取出步骤4准备的水稻幼芽材料，打开罩在幼芽外面的保湿罩，把接种体孢子液对着幼芽均匀喷雾，直至针状幼芽表面布满一层雾滴为止，然后重新罩回保湿罩。
7.接种后培育管理
将步骤6接种后的幼芽，重新转回原来育苗之处，保持原来育苗的温度条件继续培育。接种5天后，在幼小的植株上呈现清晰的稻瘟病坏死病斑。
本发明的优点是：
1)整套方法全程时间短，从播种到典型发病一般只需要8天。
2)温度、湿度、水肥和小生境微生物等重要发病条件均能高度一致，而且容易控制。
3)容易创造无菌的育苗环境。
4)实施操作简易，总体技术简单，容易实现技术方法的标准化。
附图说明
图1是本发明水稻种子播种后示意图。
图中，水稻种子播种在培养皿内的琼脂基质内，培养皿置于小方盘内。
图2是本发明水稻种子播种后罩上保湿罩的示意图。
图中，水稻种子播种在培养皿内的琼脂基质内，培养皿置于小方盘内，保湿罩将培养皿及其皿内材料罩封在小方盘内。
图3是本发明播种3天后水稻种子生长形成的针状幼芽。
图4是本发明水稻幼芽接种病菌5天后的稻苗外观。
图中，A是未接种病菌对照，B是接种病菌出现坏死病斑。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。
一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法，是利用琼脂作育苗基质，在微小水稻幼芽阶段，接种稻瘟病菌，因而能在短期内获得接种发病结果，快捷诱发稻瘟病方法的步骤如下：
1.准备配套营养液
按比例配备配套营养液，该营养液组分为：硝酸钾0.5g、磷酸二氢钾0.5g、尿素0.5g、水1000.0ml。
2.配备育苗琼脂基质
用琼脂与步骤1配备的营养液组配成育苗基质，组配比例为：琼脂4g、营养液1000ml；加热至琼脂充分熔化后，分别倒入洁净的培养皿内，冷却后凝固形成平板，即为育苗琼脂基质。
3.播种
按常规条件将水稻种子浸种和催芽，获得露白萌发种子，用小镊子夹取已露白萌发的水稻种子，分别播埋在步骤2备好的培养皿育苗琼脂基质内。
4.在封闭的小生境内培育水稻幼芽
步骤3播种完毕后，将培养皿及其盛载的材料一起置于小方盘内，取保湿罩将培养皿全部罩在小方盘内，往小方盘内注入薄层清水，使保湿罩内处于封闭状态，然后将该全套育苗器具转到普通实验室内近窗口的桌面上，在室温为28℃条件下培育水稻，直至第一完全叶生长露出，形成针状幼芽。
5.准备接种体孢子液
按常规方法培养制备稻瘟病菌的分生孢子，用清水将孢子洗脱悬浮，配成孢子浓度为1×106个/ml的孢子液，作为接种体孢子液。
6.接种病菌
将步骤5准备的孢子液装入喷雾器，取出步骤4准备的水稻幼芽材料，打开罩在幼芽外面的保湿罩，把接种体孢子液对着幼芽均匀喷雾，直至针状幼芽表面布满一层雾滴为止，然后重新罩回保湿罩。
7.接种后培育管理
将步骤6接种后的幼芽，重新转回原来育苗之处，保持原来育苗的温度条件继续培育。接种5天后，在幼小的植株上呈现清晰的稻瘟病坏死病斑。
发明采用如下技术解决常规苗期诱发稻瘟病的技术弊病：1)在稻苗的针状幼芽期接种稻瘟病菌，因而能大幅度缩短诱发稻瘟病的试验周期；2)将水稻育苗和接种发病技术体系，设计在一个相对独立且封闭的微小生长空间内，因而能较大限度地简化技术装备和条件。
本发明使用的小方盘、培养皿属实验室常规使用的器具，保湿罩为有机保湿罩。育苗基质用的琼脂属实验室常用试剂，琼脂所含水稻生长所需的养分极为贫乏，因而育苗基质的背景养分简单易控；也由于琼脂和培养皿易于消毒和灭菌操作，因而容易创造无菌的育苗环境。配套营养液的目的是改进提高诱发稻瘟病的效果。
播种前，按常规方式在温度为30℃下浸种1天和催芽1天，获得露白萌发的种子；必要时将稻种进行表面消毒；准备播种时，先将配套营养液与琼脂混合加热熔化，再倒入培养皿内制成育苗基质；播种时，用小镊子夹取已萌发的水稻种子，轻轻按入琼脂基质内，一个培养皿能播种多颗种子，具体每皿播种量可视培养皿大小与研究工作需要而定。
播种完毕后，将培养皿及其皿内材料转到一个小方盘内，如图1所示；往小方盘内注入薄层清水，再取保湿罩将培养皿及其皿内材料全部罩在小方盘内，形成水稻种子处在一个封闭的小生境空间内，如图2所示；然后将整套器具及其上面所载的水稻材料置于普通实验室内窗口附近的实验桌面上培育，室内温度调整为28℃，光照条件维持日常散射光即可，无需增加人工光。
本技术体系，通常水稻播种1天后长出胚芽鞘，2天后能长出不完全叶，3天后能长出第一完全叶。本发明设计人工接入病菌的时期为第一完全叶伸出、但叶片还未展开之前的针状幼芽期，如图3所示，显然，播种3天后即能进行病菌接种，因而育苗所需时间比常规育苗所需时间能大幅度缩短。
接种时只需打开保湿罩，将孢子液对着水稻幼芽喷雾，直至幼芽表面布满孢子雾滴即可，接种完毕将保湿罩按原样罩回材料，并将整套器具及材料转放回原来育苗的条件下继续培育，直至获得发病结果。
从播种到结果观察，除了接种操作需要打开保湿罩之外，中途无需打开保湿罩换气和补充水分，幼芽的生长以及接种后幼芽与病菌致病互作过程，全部处于一个相对独立和封闭的小生境内。可见，与稻瘟病诱发关系密切的条件，如基质营养、罩内小环境微生物群落、培育温度、小环境湿度等均能保持高度一致，而且非常容易控制，因而在技术控制方面较为容易实现标准化。
本发明设计的诱发稻瘟病技术体系，通常接种3天后，接种部位开始显现病斑小点，5天后可见较大的坏死病斑，如图4所示。
实施例1
一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法，用稻瘟病菌菌株Mg2013-1在水稻品种宜香优7633稻苗上诱发稻瘟病，按如下步骤操作：
1.准备配套营养液
按比例配备配套营养液，该营养液组分为：硝酸钾0.5g、磷酸二氢钾0.5g、尿素0.5g、水1000.0ml。
2.配备育苗琼脂基质
用琼脂与步骤1配备的营养液组配成育苗基质，组配比例为：琼脂4g、营养液1000ml；加热至琼脂充分熔化，取洁净的9cm培养皿倒入熔化后的琼脂基质50ml/皿，冷却后凝固形成平板，即为育苗琼脂基质。
3.播种
先在30℃温度条件下将水稻品种宜香优7633浸种1天和催芽1天，获得露白萌发种子。用小镊子夹取已露白萌发的水稻种子，播埋在步骤2备好的9cm培养皿育苗琼脂基质内，每皿播10颗种子。
4.在封闭的小生境内培育水稻幼芽
步骤3播种完毕后，将9cm培养皿及其盛载的材料一起置于小方盘内，取保湿罩将9cm培养皿全部罩在小方盘内，往小方盘内注入薄层清水，使保湿罩内处于封闭状态，然后将该全套育苗器具转到普通实验室内近窗口的桌面上，在室温为28℃条件下培育水稻，直至第一完全叶生长露出，形成针状幼芽。
5.准备接种体孢子液
用燕麦培养基(燕麦培养基组分比例：燕麦167g，琼脂20g，水1000ml)按常规方法培养制备菌株Mg2013-1的分生孢子，配成孢子浓度为1×106个/ml的孢子液，作为接种体孢子液。
6.接种病菌
将步骤5准备的接种体孢子液装入普通手按式喷雾器，取出步骤4准备的水稻幼芽材料，打开罩在幼芽外面的保湿罩，将孢子液对着幼芽均匀喷雾，直至针状幼芽表面布满一层雾滴为止，然后重新罩回保湿罩。
7.接种后培育管理
将步骤6接种后的幼芽，重新转回原来育苗之处，保持原来育苗的温度条件继续培育，接种5天后，同图4所示一样，在宜香优7633幼小的植株上出现清晰的稻瘟病坏死病斑。
实施例2
一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法，用稻瘟病菌菌株Mg2013-1在水稻品种特优838稻苗上诱发稻瘟病，按实施例1的步骤1至步骤7操作，只是步骤3所用的水稻品种是特优838，结果在接种5天后，也同图4所示一样，在特优838幼小的植株上出现清晰的稻瘟病坏死病斑。
实施例3
一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法，用稻瘟病菌菌株Mg2013-1在水稻品种Y两优696稻苗上诱发稻瘟病，按实施例1的步骤1至步骤7操作，只是步骤3所用的水稻品种是Y两优696，结果在接种5天后，也同图4所示一样，在Y两优696幼小的植株上出现清晰的稻瘟病坏死病斑。

Claims (1)

1.一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法，其特征在于，利用琼脂作育苗基质，在水稻幼芽期接种稻瘟病菌而快速获得发病结果，实施操作步骤如下：
1)准备配套营养液：按比例配备配套营养液，该营养液组分为：硝酸钾0.5g、磷酸二氢钾0.5g、尿素0.5g、水1000.0ml；
2)配备育苗琼脂基质：用琼脂与步骤1)配备的营养液组配成育苗基质，组配比例为：琼脂4g、营养液1000ml；加热至琼脂充分熔化后，分别倒入洁净的培养皿内，冷却后凝固形成的平板，即为育苗琼脂基质；
3)播种：按常规条件将水稻种子浸种和催芽，获得露白萌发种子，用小镊子夹取已露白萌发的水稻种子，分别播埋在步骤2)备好的培养皿育苗琼脂基质内；
4)在封闭的小生境内培育水稻幼芽：步骤3)播种完毕后，将培养皿及其盛载的材料一起置于小方盘内，取保湿罩将培养皿全部罩在小方盘内，往小方盘内注入薄层清水，使保湿罩内处于封闭状态，然后将该全套育苗器具转到普通实验室内近窗口的桌面上，在室温为28℃条件下培育水稻，直至第一完全叶生长露出，形成针状幼芽；
5)准备接种体孢子液：按常规方法培养制备稻瘟病菌的分生孢子，用清水将孢子洗脱悬浮，配成孢子浓度为1×106个/ml的孢子液，作为接种体孢子液；
6)接种病菌：将步骤5)准备的孢子液装入喷雾器，取出步骤4)准备的水稻幼芽材料，打开罩在幼芽外面的保湿罩，把接种体孢子液对着幼芽均匀喷雾，直至针状幼芽表面布满一层雾滴为止，然后重新罩回保湿罩；
7)接种后培育管理：将步骤6)接种后的幼芽，重新转回原来育苗之处，保持原来育苗的温度条件继续培育；接种5天后，在幼小的植株上呈现清晰的稻瘟病坏死病斑。
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