CN104509439A - 一种适于美国红枫组织快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种美国红枫组织快繁的方法，包括以下步骤：（1）以美国红枫的幼嫩茎段为外植体，进行表面消毒；（2）在初代培养基上进行培养，培养时间为25-30天；（3）在增殖培养基上进行培养，培养时间20-40天；（4）在生根培养基进行上生根培养，培养至长合适的根为止。通过本发明方法可快速、持续获得优良美国红枫无菌苗，且幼苗成活率高，为美国红枫工厂化育苗生产提供技术保证和奠定坚实基础，有助于我国美国红枫栽培的产业化发展。

Description

一种适于美国红枫组织快繁方法

技术领域

本发明涉及一种适于美国红枫组织快繁方法。

背景技术

美国红枫为槭树科槭树属，红鸡爪槭的栽培变种，原产美国东海岸，适应范围广，在酸性土、中性土和石灰质土均能适应；抗性强，耐寒、耐旱、耐湿，耐薄瘠，但是喜湿润温暖的气候，在土壤肥沃、排水良好的环境中生长良好。美国红枫属于落叶大乔木，叶掌状3～5裂,叶长5～10cm,春季嫩叶呈鲜红色或紫红色，夏季略转青，整株姿形优美，秋季树叶常出现鲜红的色彩，风姿极佳，为城市绿化和营造景林的著名观赏树种，目前广泛应用于公园、庭院、小区绿化。美国红枫枝叶可药用，具有清热解毒、行气止痛的作用，可治疗关节酸痛、腹胀等症。美国红枫木材还可作细木加工。因此，美国红枫是一种值得大力推广的珍贵苗木。

美国红枫既可以进行有性繁殖，也可以进行无性繁殖。有性繁殖虽然方法简单，繁殖系数大，但是美国红枫的色彩性状是由于基因变异引起的，而非正常的生理表现，其色彩性状通过有性繁殖很难稳定遗传。无性繁殖包括扦插、嫁接和组织培养。扦插生根成活率低，嫁接繁殖速度太慢，这些缺陷严重影响了美国红枫的规模发展与推广。植物组织培养技术具有效率高、生长快、周期短、重复性强、可周年生产等优点，在现代农业生产和园林育种中得到了广泛的应用。因此，繁殖美国红枫园艺品种的最佳方式是组织培养。到目前为止，已有研究者对红枫的组织培养技术进行了初步研究，但是尚未建立美国红枫组织快繁体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种适宜于美国红枫组织快繁的方法，通过该方法可快速、持续获得优良美国红枫无菌苗，且幼苗成活率高，为美国红枫工厂化育苗生产提供技术保证和奠定坚实基础，有助于我国美国红枫栽培的产业化发展。

本发明提供的技术方案是：一种美国红枫组织快繁的方法，包括以下步骤：

(1)以美国红枫的幼嫩茎段为外植体，进行表面消毒；

(2)在初代培养基上进行培养，培养时间为25-30天，其中初代培养基为WPM+1.0～1.5mg/L BA+1.0-2.0mg/L ZT+3-3.5％白糖；

(3)在增殖培养基上进行培养，培养时间20-40天，其中增殖培养基为WPM+1.0～1.5mg/L BA+2-3mg/L ZT+0.5-1mg/L GA3+3-3.5％白糖；

(4)在生根培养基上进行生根培养，培养至长合适的根为止，其中生根培养基为1/2WPM+0.5-1mg/L IBA+0.3～0.5mg/L NAA+3～3.5％白糖。

所述的方法，所述美国红枫是美国红点红枫。

所述的方法，进一步包括炼苗培养，以体积比草炭∶蛭石＝1∶1为炼苗基质。

上述的方法，所述表面消毒是先用75％酒精消毒50s后，再用0.1％升汞进行两次处理，处理时间共12min。

所述的方法，优选地，所述初代培养基为WPM+1.5mg/L BA+2.0mg/L ZT+3％白糖。

所述的方法，优选地，所述增殖培养基为WPM+1.5mg/L BA+2.0mg/L ZT+0.5mg/LGA3+3％白糖。

所述的方法，优选地，所述生根培养基为1/2WPM+0.5mg/L IBA+0.3mg/LNAA+3.5％白糖。

所述的方法，优选地，所述初代培养时间为28天。

所述的方法，优选地，所述增殖培养时间为30天。

所述的方法，优选地，所述生根培养时间为50-70天，更为优选地，所述生根培养时间为60天。

本发明具有以下有益效果：

本发明以美国红点红枫的幼嫩茎段为外植体，对外植体的表面消毒、初代培养基、增殖培养基、生根培养基、炼苗基质等无菌苗生产的几个关键因素进行了优化，建立一种适宜于美国红枫组织快繁的方法。结果表明，外植体表面先用75％酒精消毒50s后，再用0.1％升汞进行两次处理，处理时间共12min，成活率高达84％；以WPM为基本培养基，适宜的初代培养基为1.0～1.5mg/L BA+1.0-2.0mg/L ZT+3％白糖，外植体茎段的叶腋芽萌发率达85％以上；适宜的增殖培养基为1.0～1.5mg/L BA+2-3mg/L ZT+0.5-1mg/L GA3+3-3.5％白糖，增殖系数高达4.7以上，苗长势好；适宜于生根的培养基为1/2WPM+0.5-1.0mg/L IBA+0.3～0.5mg/L NAA+3～3.5％白糖，生根率达90％以上，主根粗壮且长，侧根细密；以体积比草炭∶蛭石＝1∶1为炼苗基质，幼苗成活率高达100％。本发明建立了可快速、持续获得优良美国红枫无菌苗的关键技术方法，有助于我国美国红枫栽培的产业化发展。

附图说明

图1为外源生长调节剂对增殖生长的影响，其中，A在添加1.0mg/L ZT的增殖培养基中培养10d后的茎段，增殖系数较低；B在添加2.0mg/L ZT的增殖培养基中培养10d后的茎段，增殖系数高；C在1/2WPM的生根培养基中培养50d后的小苗，根系发达呈乳白色，小苗健壮，叶色碧绿。

图2为不同基质配比对移栽成活率的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

植物材料来自湖南农业大学校园内的美国红枫品种红点红枫，外植体选用生长健壮无病害的当年生的幼嫩枝条。

实施例1：初代培养

1.不同灭菌时间组合对外植体生长的影响

初始外植体选取当年生幼嫩枝条，摘除叶片，将枝条切成1～2cm长的单对芽茎段，用饱和洗衣粉水溶液浸泡约20min后流水下冲洗约30min，转入超净工作台上。先用75％酒精分别消毒35、50、65s，然后用0.1％升汞分别消毒8、10、12min(分1～2次消毒)，接着用无菌水冲洗4次，2min/次,最后用无菌滤纸吸干外植体表面水分，各处理消毒的具体时间和次数见表1。在无菌条件下接种于培养基上，每个处理接种10个外植体，1个外植体/瓶，重复3次，培养10d后，统计外植体污染率、褐化死亡率、存活率。

污染率(％)＝污染个数/接种个数×100

褐化死亡率(％)＝褐化死亡个数/接种个数×100

存活率(％)＝存活个数/接种个数×100

对外植体茎段以75％酒精和0.1％升汞不同时间组合双重灭菌的影响见表1。从表1可以看出，75％的酒精用于表面灭菌的时间过短，茎段易污染，时间超过60s，茎段易褐化，因此，75％的酒精的最佳灭菌时间为50s。升汞的渗透力相对酒精较弱，前者用于表面灭菌的时间较长，随着升汞处理的时间延长，茎段染菌率相对降低，而茎段褐化率相对升高。另外，在相同灭菌时间条件下，将升汞分两次进行灭菌的茎段染菌率均比一次灭菌的染菌率有所下降。因此，75％的酒精50s和0.1％汞灭菌12min分两次进行组合灭菌的效果最佳，其染菌率和褐化率均为8％，存活率高达84％，显著优于其它的组合。

表1不同消毒时间组合对外植体茎段生长的影响

注：同一列不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异

2.外源生长调节剂对外植体生长的影响

以WPM为基本培养基，添加3％白糖和0.65％琼脂粉，将经过消毒处理的外植体分别接种于添加不同浓度生长调节剂的培养基(pH＝5.8)上进行光照培养。各生长调节剂浓度组合见表2，每个处理接种10个外植体，1个外植体/瓶，重复3次，培养30d后，计算萌芽率和观察腋芽生长情况，确定初代培养基适宜的生长调节剂添加量。光照培养条件为：温度25±2℃，光强2500Lx，光周期14h光照/10h黑暗，下同。

腋芽萌芽率(％)＝萌芽个数/接种个数×100

以WPM为基本培养基，添加不同浓度组合的外源生长调节剂对外植体茎段叶腋芽萌发的影响见表2。表2的实验结果表明，无外源生长调节剂时，茎段切口无愈伤组织形成，叶腋芽不萌发，茎段枯死。不同生长调节剂含量配比的培养基对叶腋芽萌发的影响不同。ZT对启动茎段叶腋芽萌发的影响明显，当无ZT时，叶腋芽的萌发率为0，0.5mg/LZT时茎段叶腋芽萌发率为42％，随着ZT浓度升高至1.0mg/L，茎段叶腋芽萌发率显著升高，高达83％，ZT浓度为2.0mg/L时的茎段叶腋芽萌发率稍高于1.0mg/L，但两者之间的差异不显著，ZT浓度升高至3.0mg/L时茎段腋芽萌发率明显下降。6-BA主要影响茎段切口处愈伤组织的形成，在0.5～1.5mg/L 6-BA中，随着浓度升高，茎段切口处形成的愈伤组织越多；当6-BA浓度等于或高于2.0mg/L时，茎段切口处却不能形成愈伤组织。6-BA通过影响茎段切口处愈伤组织的形成，继而影响叶腋芽的长势。将ZT和6-BA组合使用，既影响叶腋芽的萌发，又影响它的长势。当1.0～2.0mg/L ZT与0.5～1.5mg/L 6－BA组合的叶腋芽萌发率高达85％以上，且不同浓度之间的叶腋芽萌发率差异不显著，在茎段切口处均形成很多愈伤组织，萌发的叶腋芽长势快。因此，0.5～1.5mg/L 6-BA+1.0～2.0mg/L ZT为适宜的初代培养基外源生长调节剂配比。

表2.不同浓度外源生长调节剂对茎段叶腋芽萌发生长的影响

注：同一列不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异

实施例2：增殖培养

待茎段腋芽伸长具有约3对叶后,从基部切下，去除叶片并切成1～2cm长的茎段后转接到增殖培养基上。以WPM为基本培养基，添加0.65％琼脂粉，将无菌的茎段分别接种于添加不同浓度生长调节剂和不同浓度白糖的培养基(pH＝5.8)上进行光照培养。各生长调节剂浓度组合见表3，白糖浓度组合见表4，每个处理接种15个茎段，3个茎段/瓶，重复3次，培养30d后，观察腋芽的萌发及生长情况，并计算增殖系数、平均株高度，确定增殖培养基最佳的生长调节剂和白糖的添加量。

增殖系数＝增殖后的芽苗总数/接种数

平均株高(cm)＝增殖芽苗总高度/接种数

1.外源生长调节剂对增殖生长的影响

表3的实验结果表明，ZT、6-BA、GA3对增殖生长的影响不同。ZT主要影响增殖系数，且具有浓度效应。增殖培养基中无ZT时的增殖系数为0；添加1.0mg/L ZT时的增殖系数在2.42～2.56之间，2.0mg/L ZT时的增殖系数在3.43～4.05之间，前者显著低于后者(图1A，B)，2.0mg/L ZT与3.0mg/L ZT的增殖系数之间的差异不显著。6-BA和GA3主要影响芽的伸长生长。在0.5～1.5mg/L 6-BA中，随着浓度的升高，对芽的伸长生长具有促进作用。GA3对促进芽的伸长生长有较明显的作用。当不添加GA3时，芽的伸长量少；添加GA3时，伸长量显著增加，但其浓度不宜过高，否则容易引起玻璃化，适宜的GA3浓度为0.5～1.0mg/L。因此，综合芽的增殖系数和芽的长势，将ZT、6-BA和GA3配合使用，适宜的增殖培养生长调节剂配比为2.0～3.0mg/L ZT+1.0～1.5mg/L6-BA+0.5～1.0mg/L GA3。

表3.不同浓度外源生长调节剂对增殖生长的影响

注：同一列不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异

2.糖浓度对增殖生长的影响

美国红枫增殖培养可以用食用的白糖来代替分析纯的蔗糖，降低生产成本。不同白糖浓度对美国红枫增殖生长的影响见表4。从表4可以看出，白糖在增殖培养过程中主要影响芽的伸长生长，对芽的增殖系数的影响不明显。白糖浓度为30g/L和35g/L时的平均苗高分别为5.13cm和4.86cm，显著高于白糖浓度分别为20g/L和40g/L时的苗高。因此，增殖培养适宜的白糖浓度为30～35g/L。

表4.不同浓度白糖对增殖生长的影响

注：同一列不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异

实施例3：生根培养

选取经过3代以上继代培养的生长健壮高度达2cm以上的芽苗切下,转接至生根培养基上。以WPM为基本培养基，添加0.65％琼脂粉和0.1％活性炭，将无菌的芽苗分别接种于添加不同盐浓度、不同生长调节剂浓度、不同白糖浓度的培养基(pH＝5.8)上进行光照培养。各盐浓度组合见表5，各生长调节剂浓度组合见表6，各白糖浓度组合见表7，每个处理接种10个茎段，2个茎段/瓶，重复3次，培养60d后，观察根的萌发及生长情况，并计算生根率、平均生根数、平均根长和平均株高度，确定最佳的生根培养基。

生根率(％)＝生根的个数/接种个数×100

平均生根数＝根的总数/接种数

平均根长(cm)＝根长总长/根的总数

平均株高(cm)＝生根后的苗总高度/接种数

1.盐浓度对生根的影响

不同盐浓度对美国红枫试管苗生根的影响见表5。从表5可看出，在大量元素浓度不降低的WPM培养基中的试管苗生根率和生根系数均最低，分别为62.5％和1.23，长出的根黄色，须根较少，叶色绿，苗长势较好。降低盐浓度有利于试管苗的生根，在1/2WPM、1/4WPM和1/8WPM培养基中的生根率均达到92％以上，显著高于WPM培养基。但是，1/4WPM培养基中的根大部分呈黄色，其中小部分根褐色，叶色发黄，苗长势一般；1/8WPM培养基中的根褐色，无须根，根的活力低，叶色发黄，苗长势差。1/2WPM培养基中的生根率为92.6％，与1/4WPM和1/8WPM培养基中的生根率无显著差异，1/2WPM培养基生根系数高达3.46，显著高于其它处理，其根乳白色，须根多，根的活力强，叶色绿，苗长势最好(图1C)。

表5.不同盐浓度对生根生长的影响

注：同一列不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异

2.外源生长调节剂对生根的影响

外源生长调节剂对生根的影响见表6。从表6可看出，无外源生长调节剂的培养基的生根率为零，IBA和NAA对生根培养均有促进作用，且具有浓度效应。在培养基中单独添加NAA时，0.5mg/LNAA时的生根率为75.4％，显著高于其它浓度。在培养基中单独添加IBA时，0.5～1.0mg/L IBA时生根率均达90％以上。从生长调节剂效应看，同浓度的IBA对生根培养的影响显著高于NAA。在培养基中同时添加IBA和NAA对生根具有协同作用，其中0.5mg/L IBA+0.3mg/L NAA的生根率最大，高达94.5％，0.5～1.0mg/LIBA+0.3～0.5mg/L NAA对生根率的影响之间的差异不显著。0.5mg/L IBA+0.3～0.5mg/LNAA的平均根长达9.0cm以上，显著高于其它组合，其生根系数在3.18～4.27。因此，适宜的生根培养外源生长调节剂配比为0.5～1.0mg/L IBA+0.3～0.5mg/L NAA。

表6.不同浓度外源生长调节剂对生根的影响

注：同一列不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异

3.糖浓度对生根的影响

美国红枫生根培养可以用食用的白糖来代替分析纯的蔗糖。不同糖浓度对美国红枫生根的影响见表7。从表7可以看出，低浓度的糖(20g/L)和高浓度的糖(40g/L)均不利于诱导生根和促进根的生长，苗的生长慢，苗矮小。30～35g/L白糖对生根的影响最佳，诱导生根率高达92％以上，根乳白色，根系活力强，主根粗壮，侧根细密，苗生长快，显著优于糖浓度分别为20g/L和40g/L。

表7.不同浓度白糖对美国红枫生根的影响

注：同一列不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异

实施例4：炼苗

将已生根的试管苗在温室环境下打开瓶盖炼苗3d，然后用清水洗净基部培养基，移栽在几种不同基质上，用塑料小拱棚保湿约3d后，逐渐揭膜，各炼苗基质组合见图2，每个处理设10株小苗，重复3次，移栽30d后统计成活率。

成活率(％)＝成活的苗数/炼苗数×100

1个月后统计成活率和生长量。从图2可看出，体积比为1∶1的草炭与蛭石组合的效果最好，成活率高达100％，苗木的生长量达3cm以上，新增叶片2～3对。效果其次的是体积比为1∶1∶1的草炭、蛭石和园土组合，其成活率为92％，苗木的生长量较高。纯蛭石的成活率达83％，但是苗木生长较慢。纯草炭和体积比为1∶1的草炭与园土的成活率为70％左右。纯园土的成活率和苗木生长量最低。因此，适宜的移栽基质选用体积比为草炭∶蛭石＝1∶1。

木本植物组织培养中的困难之一是建立无菌培养体系。为了保证组织培养成功,在接种前外植体的表面消毒尤为重要。一般来说，材料的消毒措施力度(消毒剂的杀菌力、使用浓度、消毒时间等)越强，灭菌就越彻底，污染率就越低，但是消毒剂对植物组织细胞具有一定的毒性，消毒力度过强会使细胞机能受损，从而降低成活率。判断某种消毒方法适合与否，要同时考察污染率和死亡率，以存活率为主要依据。因此，用于外植体表面消毒的消毒剂及消毒时间依不同植物种类、外植体类型、甚至外植体生理活性状态而不同。本发明中，以美国红枫当年生幼嫩枝条为外植体，采用75％酒精消毒50s后，再用0.1％升汞进行两次处理，处理时间共12min，外植体的污染率和褐化死亡率较低，成活率高达84％。外植体茎段接种后,茎节上潜伏的叶腋芽萌动膨大,芽不断伸展,逐渐成主芽。不同外源激素配比对新芽的形成起着非常关键的作用，确定激素的含量配比是组织培养技术成功的关键。曹受金等(2010)采用1/2MS+0.3mg/L IAA+0.6mg/L 6－BA诱导美国红枫茎段形成愈伤组织；胡雪雁等(2012)采用1/2MS+2.0mg/L 6－BA+0.5mg/L 2，4－D+0.1mg/L NAA+0.1mg/L GA3诱导加拿大红枫也仅仅形成愈伤组织。愈伤组织是未分化的细胞团，在其分化过程中易发生变异。因此，在红枫培养过程中，诱导叶腋芽萌发是本发明人期望得到的结果。本发明以WPM为基本培养基，1.0～1.5mg/L 6－BA+1.0～2.0mg/L ZT为初代培养基激素配比，成功诱导茎段叶腋芽萌发，萌发率高达85％以上,且叶腋芽长势快。

细胞分裂素在组织快繁技术中芽的诱导和增殖中的作用至关重要。已有研究表明，不同细胞分裂素活力不同，在红枫增殖培养中的作用也存在差异：BA在红枫培养中诱导愈伤组织增殖和不定芽的增殖，TDZ和CPPU能诱导红枫单芽茎的腋芽增殖，但繁殖系数不高。ZT是一种天然的细胞分裂素，在蓝莓等植物组织快繁中具有高增殖系数。本发明添加ZT使美国红枫增殖系数高达4.85，该结果远远高于TDZ和CCPU用于美国红枫的增殖系数。此外，本发明也证实了BA在美国红枫增殖生长过程中主要通过诱导愈伤组织的形成促进营养的吸收，有利于芽的生长，GA促进芽的伸长生长。因此，将ZT与BA和GA组合有利于红枫增殖生长。

试管苗生根的好坏直接影响试管苗的质量和移栽成活率，从而决定整个组培技术能否真正应用到生产实际中。本发明的结果表明，影响美国红枫试管苗瓶内生根的因素包括外源生长调节剂、盐浓度、糖浓度等；IBA和NAA在美国红枫试管苗生根诱导中起协同作用，适当降低盐浓度和合适的糖浓度均有利于美国红枫试管苗生根和苗的生长。美国红枫适宜的生根培养基配比为1/2WPM+0.5～1.0mg/L IBA+0.3～0.5mg/L NAA+3～3.5％白糖，其生根率高达89％以上，根系呈乳白色，为主根系，其主根粗壮，侧根细密，苗生长快且健壮。因此，炼苗时主要考虑如何为美国红枫提供适宜的pH值和通透性好的移栽基质。蛭石和草炭的通透性和保湿性均很好，但是前者为中性至碱性，后者为强酸性，适宜于美国红枫生长pH值为5.8-6.3，因此，蛭石和泥炭不宜单独使用，将两者混合的pH值适宜于美国红枫的生长。本发明表明，适宜美国红枫的移栽基质选用体积比为草炭∶蛭石＝1∶1，幼苗成活率高达100％，幼苗生长快且健壮。

Claims (10)

1.一种美国红枫组织快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以美国红枫的幼嫩茎段为外植体，进行表面消毒；

（2）在初代培养基上进行培养，培养时间为25-30天，其中初代培养基为WPM＋1.0 ~1.5 mg/L BA＋1.0-2.0 mg/L ZT+3-3.5 %白糖；

（3）在增殖培养基上进行培养，培养时间20-40天，其中增殖培养基为WPM＋1.0~1.5 mg/L BA＋2-3 mg/L ZT＋0.5-1 mg/L GA3+2-4%白糖；

（4）在生根培养基进行上生根培养，培养至长合适的根为止，其中生根培养基为1/2 WPM＋0.25-1 mg/L IBA＋0.3~0.5 mg/L NAA＋3~3.5％白糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述美国红枫是美国红点红枫。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：进一步包括炼苗培养，以体积比草炭∶蛭石＝1∶1为炼苗基质。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表面消毒是先用75％酒精消毒50s后，再用0.1％升汞进行两次处理，处理时间共12 min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述初代培养基WPM+1.5 mg/L BA+2.0 mg/L ZT+3%白糖。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述增殖培养基WPM+1.5 mg/L BA+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L GA3+3%白糖。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生根培养基1/2WPM+0.5 mg/L IBA+0.3 mg/LNAA+3.5%白糖。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述初代时间为28天。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述增殖时间为培养30天。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生根时间为60天。