CN107466859A - 红花银桦小苗的快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红花银桦小苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：1)将红花银桦的侧芽或顶芽进行愈伤组织的诱导培养；2)将愈伤组织切成小块，接种到愈伤组织不定芽分化培养基中进行不定芽分化培养；3)把得到的不定芽转接入生根培养基上进行生根培养；4)将步骤3)中得到的红花银桦小苗移至室外阴棚炼苗，移栽到苗床上，培养30‑40天后栽到自然条件下的土壤中。本发明利用组织培养方法快速繁殖红花银桦小苗，培养周期短，方法易操作，成本低，繁殖得到的红花银桦小苗具有很高的成活率，可以获得大量的商品苗木，从而满足都市园林绿化的需要，对加快红花银桦的快速栽培、美化城市环境和净化城市空气具有重要的意义。

Description

红花银桦小苗的快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物栽培技术领域，具体涉及红花银桦小苗的快速繁殖方法。

背景技术

红花银桦又称昆士兰银桦，是山龙眼科常绿乔木，原产于澳大利亚。在澳大利亚被广泛应用为行道树、庭园树。1967年引进中国台湾，深受群众喜爱。目前，香港、广州、昆明均有少量引种，均可正常生长及开花，园林景观特性好。红花银桦树冠修长，叶簇轮廓清晰可见，对栽培土质选择不严，十分适宜华南地区作行道树或庭园观赏树种植。目前，园林上常用开花树种多数为落叶树种，如木棉、大叶紫薇、红花羊蹄甲、凤凰木等，到冬季就一片萧条的景象。凡是开花(特别是红花)常绿的苗木十分受苗木生产者和园林绿化部门欢迎，而红花银桦为常绿乔木，开红花，花期长，花量大，抗污染能力强，这些特点使得它将来有着广阔的市场空间。广州市城市绿地系统规划己将红花银桦列入广州市中期推荐发展行道树种。但由于其在澳大利亚才有种子，引进国内只好采取圈枝繁殖方式，不仅繁殖数量少、时间长，而且培育出来的苗木主干不明显，分枝过多，影响树形。

红花银桦作为外来引入的树种，目前国内外很少关于红花银桦类树种愈伤组织再生研究的报道。

木本植物植株再生的研究起步晚，经近几十年的研究，无论在技术上还是在方法上都取得了很大进展，但仍然面临着一些问题。第一，研究对象、研究内容发展不平衡，研究对象主要集中在重要的用材和经济果树。第二，研究范围、研究深度达不到实际生产需求。多数木本植物外植体无菌系建立困难，诱导率低下，生根成活率不高，远远不能满足发展无性系林业的需要。许多的植物类型或基因型还不能按照人们的目的用现有的技术培养成功。据统计全世界诱导出小苗的植物约4000余种，木本植物仅有近300种，其中形成大批量商品苗生产的只有10余种，我国目前只有按树和杨树实现了工厂化育苗。第三，对木本植物植株再生的模式体系的研究较少。建立木本植物植株再生体系，可以为研究植株再生的发生及其调控机理机制，开展再生植株遗传变异性的研究提供一个平台。

因此，需要研究一种能够实现繁殖数量多，繁殖周期短，繁殖得到的红花银桦主干明显，树形美观的红花银桦快速繁殖方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红花银桦小苗的快速繁殖方法，利用组织培养方法快速繁殖红花银桦小苗，培养周期短，方法易操作，成本低，繁殖得到的红花银桦小苗具有很高的成活率，获得大量的商品苗木，从而满足都市园林绿化的需要。

本发明采取的技术方案是:一种红花银桦小苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)将红花银桦的侧芽或顶芽接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养，在温度为22-26℃，光照时间为8-15h/天下，诱导培养18-25天，侧芽部位长出绿色的致密愈伤组织；

2)将愈伤组织切成小块，接种到愈伤组织不定芽分化培养基中，在光照下进行不定芽分化培养；

3)当分化培养的不定芽长到2.5-3.0cm高时，把不定芽分开转接入生根培养基上进行生根培养，在光照下生根培养28-32天，红花银桦小苗的株高为2.8-3.5cm；

4)将步骤3)中得到的株高为2.8-3.5cm的红花银桦小苗移至室外阴棚炼苗3-5天，洗去根部培养基，移栽到苗床上，培养30-40天后栽到自然条件下的土壤中；

其中，愈伤组织诱导培养基以MS作为基本培养基，再添加0.05-0.2mg/L的NAA和1-4 mg/L的6-BA，2.5-3.5％蔗糖和0.5-0.8％琼脂配制而成，pH5.8-6.2；

愈伤组织不定芽分化培养基以MS作为基本培养基，再添加0.1mg/L的NAA和1-3mg/L 的6-BA，2.5-3.5％蔗糖和0.5-0.8％琼脂配制而成，pH 5.8-6.2；

生根培养基以MS作为基本培养基，再添加0.2-0.8mg/L的NAA，2.5-3.5％蔗糖和0.5-0.8％琼脂配制而成，pH 5.8-6.2。

优选的，将红花银桦的侧芽或顶芽接种到愈伤组织诱导培养基前，需要将红花银桦的侧芽或顶芽进行清洗和消毒，具体操作如下：取长1.5cm左右的侧芽或顶芽，用自来水流水冲洗20min，沥干水后用75％的乙醇溶液浸泡20s，在超净工作台上再用0.1％升汞溶液浸泡 12-5min，用无菌水冲洗5-6次。

根据细胞全能性理论，植物体的任何一部分做外植体都能诱导成为完整的植株，但研究发现，植物的不同组织及部位的再生能力有很大差别。常作为外植体的有花药、花丝、花粉、合子胚、胚珠、叶片、茎尖、茎段等。成功的分子育种技术首先依赖于高效稳定的再生系统，只有再生频率高的再生系统，才有获得高频转化的可能。在木本植物的遗传转化中，对以侧芽或顶芽等为外植体再生不定芽的途径研究最多。

优选的，愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L，3％蔗糖和 0.65％琼脂；愈伤组织不定芽分化培养基的组分为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，3％蔗糖和0.65％琼脂；生根培养基的组分为:MS+NAA 0.4mg/L，3％蔗糖和0.65％琼脂。

用于木本植物愈伤组织诱导和再生常见的有MS、SH、B5、DKW、WPM、MSG、DCR 等基本培养基，其中MS为最基本的培养基，本发明将采用MS培养基。

在组织培养中，从愈伤组织的诱导到植株分化以及试管苗的生根培养，植物生长调节剂是必不可少的。NAA是生长素，用来促生根比较有效，BA属细胞分裂素，可以促芽的生长，但两种加起来有时会相互促进，增加效果，有时又会互相阻碍。细胞分裂素具有与生长素的正向协同与拮抗作用。生长素可促进根原基的形成，细胞分裂素可诱导芽的产生。进行植物细胞和组织培养时，培养基中必须有配合适当比例的生长素和细胞分裂素才能表现出细胞的全能性，即长根又长芽，成为完整植株。

在组织培养过程中，植物生长调节剂的种类及浓度对生根有重要影响。植物生根多数是用生长素单独作用的，NAA具有较好的促进生根的作用。试验发现，用幼年状态的材料在含有低浓度生长素的生根培养基中一步生根，生根效果明显优于含有高浓度生长素的生根培养基。当用不含生长素的培养基一步生根时，仍可观察到幼年状态的材料有一定的生根效果。这说明生长素完成诱导作用后，它们在培养基中存在对新根发生有抑制作用。因此在富含生长素的培养基上进行根的诱导，然后转接到无任何生长调节物质的培养基上进行根的伸长生长。这样不仅可以提高生根率和有效根的数目，而且可以限制苗基部愈伤组织的生成。

优选的，所述步骤4)中苗床的基质由砂和椰子壳组成，砂和椰子壳的质量比为1:0.25-3。

优选的，所述步骤4)中苗的基质中，床砂和椰子壳的质量比为1:3。

优选的，苗床培养过程条件控制为：温度为20-25℃，湿度保持在70％-85％。

优选的，步骤1)中，将侧芽或顶芽进行愈伤组织诱导培养时，愈伤组织诱导率为43.7-100％。

优选的，步骤2)中，不定芽分化培养的芽诱导率为37.5-62.5％。

优选的，步骤3)中，将不定芽转接入生根培养基上进行生根培养时，生根率为100％，根长为4-4.6cm。

优选的，将红花银桦小苗移栽到苗床上进行培养是，成活率为56-88％。

本发明的有益效果是：本发明利用组织培养方法快速繁殖红花银桦小苗，培养周期短，方法易操作，成本低，繁殖得到的红花银桦小苗具有很高的成活率，可以获得大量的商品苗木，从而满足都市园林绿化的需要，对加快红花银桦的快速栽培、美化城市环境和净化城市空气具有重要的意义。

具体实施方式

实施例1

此例研究不同浓度NAA对愈伤组织的诱导。

以MS培养基为基本培养基，附加不同浓度的6-BA(1.0-4.0mg/L)和NAA(0.05-0.2mg/L)，设计成双因子多水平的试验，研究在红花银桦的侧芽或顶芽愈伤组织诱导中6-BA和NAA的最佳浓度组合。在愈伤组织诱导培养基上培养20天，愈伤组织的发生情况如表1所示。

表1不同浓度6-BA对红花银桦愈伤组织诱导的影响

由表1可知，培养20天，当NAA为0.1mg/L，6-BA在2.0～3.0mg/L浓度范围内，对红花银桦的侧芽或顶芽愈伤组织的发生数量、结构都有明显作用。当NAA为0.2mg/L时即A41、A42、A43、A44培养基中发生的愈伤组织结构较紧密，很难分化再生。随着NAA浓度越接近0.1mg/L时，红花银桦的侧芽或顶芽愈伤组织的诱导率提高，当NAA浓度为0.1mg/L时，即A21、A22、A23、A24培养基愈伤组织诱导率较高，特别是当NAA浓度为0.1mg/L， 6-BA浓度为3.0mg/L时部分愈伤组织为淡黄色，米粒状，表面有许多颗粒状突起，是理想的愈伤组织类型。所以从保持愈伤组织良好的结构和提高植株再生率方面考虑，诱导红花银桦的侧芽或顶芽产生愈伤组织的适宜培养基为(A23)MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L。

实施例2

此例研究不同浓度BA对不定芽诱导的影响。

在红花银桦的侧芽或顶芽愈伤组织培养过程中发现，当愈伤组织生长到一定阶段的时候，愈伤组织表面逐渐变得油亮和凹凸不平，在许多突起下方出现绿色小点。随着培养时间的延长，这些绿色小点逐渐突破愈伤组织，发育成芽体。

以MS培养基为基本培养基，附加一定浓度的NAA不同浓度的6-BA，设计成单因子多水平的试验，比较不同浓度的6-BA对愈伤组织诱导不定芽的作用。试验结果如表2所示。

表2 6-BA对红花银桦的侧芽或顶芽愈伤组织诱导不定芽的影响

实验过程中发现，在培养基B1上培养7天左右，不定芽即开始萌动、生长，平均月增殖倍数可达4.0倍(30/7＝4.3)，15天后不定芽伸长，高约有2.5cm，叶片展开，长势良好，并在基部有少量愈伤组织分化；培养基B2平均月增殖倍数约达1.8倍(30/16＝1.87)。培养基B3～B5则产生大量愈伤组织，偶有较粗的不定芽长出，但较难长成良好的不定芽，再转接到培养基B1中，即可长出良好的不定芽。

由表2可知，当6-BA浓度范围在1.0-3.0mg/L时，随着6-BA浓度的降低，不定芽的诱导率升高，当6-BA浓度为1.0mg/L时，不定芽的诱导率最高，而且不定芽生长良好，较健壮，平均每块愈伤组织产生的不定芽也较多，为0.6个。当6-BA浓度为1.5mg/L时，不定芽的诱导率也较高，但是不定芽生长势较弱，叶片出现黄化现象。当6-BA浓度继续升高时，不定芽的诱导率下降。当6-BA浓度为2.0～3.0mg/L时，诱导出的不定芽出现较严重的玻璃化现象和畸形。

因此，诱导不定芽的最适宜培养基为(B1)MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。

实施例3

此例研究不同浓度NAA对不定芽生根培养的影响。

以MS培养基为基本培养基，附加不同浓度的NAA，设计成单因子多水平的试验，比较不同植物生长调节剂对红花银桦不定芽生根培养的作用。10-15天后根系长出，20天后生根率达80％以上。所得试验结果如表3所示。

表3不同NAA浓度对生根培养的影响

从表3中可以看出，红花银桦不定芽在附加NAA的培养基中生根率非常高。而且当NAA 浓度为0.4mg/L时，生根数最多，平均为3条，生根质量最好，植株壮健。当NAA浓度为0.2mg/L时，生根数不及C2培养基中的多，平均为2条，而植株生长得较高。而培养基C3 中生根数是最少的，平均仅为1条。

因此，综合各方面的内容，培养基C2MS+NAA 0.4mg/L对红花银桦再生苗生根的作用最理想。

实施例4

此例研究不同栽培基质对红花银桦小苗移栽成活率的影响。

当株高达3cm左右的时候，挑选生根整齐、健壮的小苗移出培养室，将小苗在温室中不打开瓶盖放置3-5天，让小苗适应移栽后的温度变化，然后将小苗取出，在自来水下用镊子和毛笔洗净粘附在根上的培养基，将苗插入预先准备好的基质中，用塑料膜覆盖，适当遮荫，注意保持空气湿润，相对空气湿度保持在70％一85％之间，控制温度低于26℃，每天往叶面上喷3遍水，移栽10天后，统计小苗成活率及生长情况。所得试验结果如表4所示。

表4在不同的基质上红花银桦生根苗的生长状况

从表4的试验结果可以看出，红花银桦小苗的移栽成活率随移栽基质中椰子壳比例的增加而提高。在砂和椰子壳的比例为2:6的移栽基质上，10天后长出新根，红花银桦小苗的成活率最高，达到87.5％；在砂和椰子壳的比例为8：2的移栽基质上，红花银桦小苗的成活率最低，仅为56.2％。在观察中发现，提高移栽基质中椰子壳的比例，容易形成密集而大小合理的网孔结构，植物在网孔中生长，网孔能创造一个透气、保水、调温的环境，可以为植物的发芽、生长提供良好的条件，红花银桦小苗的根系能够较好的生长。

经过实验发现，35天后把成活的小苗移栽到土壤中，自然条件下能正常生长，成活率为 100％。

实施例5

一种红花银桦小苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)将红花银桦的侧芽或顶芽接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养，在温度为22-26℃，光照时间为8-15h/天下，诱导培养18-25天，侧芽部位长出绿色的致密愈伤组织；

2)将愈伤组织切成小块，接种到愈伤组织不定芽分化培养基中，在光照下进行不定芽分化培养；

3)当分化培养的不定芽长到2.5-3.0cm高时，把不定芽分开转接入生根培养基上进行生根培养，在光照下生根培养28-32天，红花银桦小苗的株高为2.8-3.5cm；

4)将步骤3)中得到的株高为2.8-3.5cm的红花银桦小苗移至室外阴棚炼苗3-5天，洗去根部培养基，移栽到苗床上，其中，温度控制为20-25℃，湿度保持在70％-85％，培养30-40 天后栽到自然条件下的土壤中，其中苗床的基质由质量比为1:1的砂和椰子壳组成；

其中，愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.1mg/L，3％蔗糖和0.65％琼脂，pH 5.8-6.2；

愈伤组织不定芽分化培养基的组分为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，3％蔗糖和 0.65％琼脂，pH 5.8-6.2；

生根培养基的组分为:MS+NAA 0.4mg/L，3％蔗糖和0.65％琼脂pH 5.8-6.2。

其中，将成活的小苗移栽到土壤后，红花银桦小苗在自然条件下能正常生长，成活率为 100％。

实施例6

一种红花银桦小苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)取长1.5cm左右的侧芽或顶芽，用自来水流水冲洗20min，沥干水后用75％的乙醇溶液浸泡20s，在超净工作台上再用0.1％升汞溶液浸泡12-5min，用无菌水冲洗5-6次

2)将红花银桦的侧芽或顶芽接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养，在温度为22-26℃，光照时间为8-15h/天，下诱导培养18-25天，侧芽部位长出绿色的致密愈伤组织；

3)将愈伤组织切成小块，接种到愈伤组织不定芽分化培养基中，在光照下进行不定芽分化培养；

4)当分化培养的不定芽长到2.5-3.0cm高时，把不定芽分开转接入生根培养基上进行生根培养，在光照下生根培养28-32天，红花银桦小苗的株高为2.8-3.5cm；

5)将步骤3)中得到的株高为2.8-3.5cm的红花银桦小苗移至室外阴棚炼苗3-5天，洗去根部培养基，移栽到苗床上，其中，温度控制为20-25℃，湿度保持在70％-85％，培养30-40 天后栽到自然条件下的土壤中，其中苗床的基质由质量比为1:3的砂和椰子壳组成；

其中，愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L，3％蔗糖和0.65％琼脂，pH 5.8-6.2；

愈伤组织不定芽分化培养基的组分为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，3％蔗糖和 0.65％琼脂，pH 5.8-6.2；

生根培养基的组分为:MS+NAA 0.4mg/L，3％蔗糖和0.65％琼脂pH 5.8-6.2。

其中，将成活的小苗移栽到土壤后，红花银桦小苗在自然条件下能正常生长，成活率为 100％。

Claims (10)

1.一种红花银桦小苗的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将红花银桦的侧芽或顶芽接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养，在温度为22-26℃，光照时间为8-15h/天下，诱导培养18-25天，侧芽部位长出绿色的致密愈伤组织；

2)将愈伤组织切成小块，接种到愈伤组织不定芽分化培养基中，在光照下进行不定芽分化培养；

3)当分化培养的不定芽长到2.5-3.0cm高时，把不定芽分开转接入生根培养基上进行生根培养，在光照下生根培养28-32天，红花银桦小苗的株高为2.8-3.5cm；

4)将步骤3)中得到的株高为2.8-3.5cm的红花银桦小苗移至室外阴棚炼苗3-5天，洗去根部培养基，移栽到苗床上，培养30-40天后栽到自然条件下的土壤中；

其中，愈伤组织诱导培养基以MS作为基本培养基，再添加0.05-0.2mg/L的NAA和1-4mg/L的6-BA，2.5-3.5％蔗糖和0.5-0.8％琼脂配制而成，pH5.8-6.2；

愈伤组织不定芽分化培养基以MS作为基本培养基，再添加0.1mg/L的NAA和1-3mg/L的6-BA，2.5-3.5％蔗糖和0.5-0.8％琼脂配制而成，pH 5.8-6.2；

生根培养基以MS作为基本培养基，再添加0.2-0.8mg/L的NAA，2.5-3.5％蔗糖和0.5-0.8％琼脂配制而成，pH 5.8-6.2。

2.根据权利要求1所述的红花银桦小苗的快速繁殖方法，其特征在于，将红花银桦的侧芽或顶芽接种到愈伤组织诱导培养基前，需要将红花银桦的侧芽或顶芽进行清洗和消毒，具体操作如下：取长1.5cm左右的侧芽或顶芽，用自来水流水冲洗20min，沥干水后用75％的乙醇溶液浸泡20s，在超净工作台上再用0.1％升汞溶液浸泡12-5min，用无菌水冲洗5-6次。

3.根据权利要求1所述的红花银桦小苗的快速繁殖方法，其特征在于，愈伤组织诱导培养基的组分为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L，3％蔗糖和0.65％琼脂；愈伤组织不定芽分化培养基的组分为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，3％蔗糖和0.65％琼脂；生根培养基的组分为:MS+NAA 0.4mg/L，3％蔗糖和0.65％琼脂。

4.根据权利要求1所述的红花银桦小苗的快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤4)中苗床的基质由砂和椰子壳组成，砂和椰子壳的质量比为1:0.25-3。

5.根据权利要求4所述的红花银桦小苗的快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤4)中苗床的基质中，砂和椰子壳的质量比为1:3。

6.根据权利要求1所述的红花银桦小苗的快速繁殖方法，其特征在于，苗床培养过程条件控制为：温度为20-25℃，湿度保持在70％-85％。

7.根据权利要求1所述的红花银桦小苗的快速繁殖方法，其特征在于，步骤1)中，将侧芽或顶芽进行愈伤组织诱导培养时，愈伤组织诱导率为43.7-100％。

8.根据权利要求1所述的红花银桦小苗的快速繁殖方法，其特征在于，步骤2)中，不定芽分化培养的芽诱导率为37.5-62.5％。

9.根据权利要求1所述的红花银桦小苗的快速繁殖方法，其特征在于，步骤3)中，将不定芽转接入生根培养基上进行生根培养时，生根率为100％，根长为4-4.6cm。

10.根据权利要求1所述的红花银桦小苗的快速繁殖方法，步骤3)中，将红花银桦小苗移栽到苗床上进行培养时，成活率为56-88％。