CN110313403A

CN110313403A - 一种白桦胚性愈伤组织诱导培养基、诱导胚性愈伤组织的方法及组培苗的培育方法

Info

Publication number: CN110313403A
Application number: CN201910720648.9A
Authority: CN
Inventors: 李成浩; 杨静莉; 王瀚增; 李丹丹; 李文龙
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2019-08-06
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2039-08-06
Also published as: CN110313403B

Abstract

本发明提供了一种白桦胚性愈伤组织诱导培养基、诱导胚性愈伤组织的方法及组培苗的培育方法，属于植物组织培养技术领域。本发明提供的白桦胚性愈伤组织诱导培养基，以MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4‑D 2mg/L、NAA 0.2mg/L、琼脂5.5g/L和蔗糖40g/L；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。利用本发明的培养基愈伤诱导率高达90％以上，胚性愈伤诱导率达19％以上。

Description

一种白桦胚性愈伤组织诱导培养基、诱导胚性愈伤组织的方法及组培苗的培育方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种白桦胚性愈伤组织诱导培养基、诱导胚性愈伤组织的方法及组培苗的培育方法。

背景技术

白桦(Betula platyphalla)属于桦木科，桦木属，高15-20m，胸径达50cm。主要分布在东北地区的背部，产于大小兴安岭、完达山等林区。在东北的张广才岭、老爷岭等山区则以东北白桦为主。白桦与东北白桦是东北的乡土树种，姿态优美，树皮光滑洁白，小枝红褐色，具有很高的观赏价值。白桦属于强阳性树种，喜光、耐寒、耐水湿，生长迅速。由于它分布范围比较广，并有耐寒、生长快及材质优良等特点，所以是一个重要的工业用材树种。另外，白桦是单板、胶合板生产加工原料的首选材料，也是航空胶合板面板不可替代的树种；同时又可作工艺材、家具材、纸浆材等，在餐饮业和医药业中也广为利用。为了扩大繁殖白桦优良品种和类型，保持其优良性状，急需解决白桦无性繁殖技术。随着组织培养技术在林业上的不断应用，利用组织培养技术获得再生植株称为快速繁殖白桦优良无性系的首选手段。

现有技术多利用器官发生再生植株，但其需要经过脱分化和再分化过程，而且芽和根要分别在不同条件下诱导，因而时间长，而细胞变异的频率又是随着继代次数和培养时间的延长而增加。现有技术中还未有有关白桦体细胞胚诱导的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种白桦胚性愈伤组织诱导培养基、诱导胚性愈伤组织的方法及组培苗的培育方法。使用本发明诱导方法愈伤诱导率高达90％以上，胚性愈伤诱导率达19％以上。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

白桦胚性愈伤组织诱导培养基，以MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 2mg/L、NAA 0.2mg/L、琼脂5.5g/L和蔗糖40g/L；

所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。

本发明提供了一种基于白桦未成熟胚诱导胚性愈伤组织的方法，包括：

选取白桦未成熟胚进行消毒，将消毒的白桦未成熟胚接种于上述技术方案所述的胚性愈伤组织诱导培养基上，在24～26℃下进行光暗交替培养，继代培养4周，得到胚性愈伤组织；所述光暗交替培养过程中，光培养的时间为16h，所述暗培养的时间为8h。

优选地，所述未成熟胚为授粉15～25d的球型至心型期的未成熟胚。

优选地，所述消毒的方法包括：将未成熟的胚依次用酒精溶液浸泡，用水冲洗后，再与次氯酸钠溶液混合消毒后，用水冲洗；所述酒精溶液的体积浓度为70％，浸泡时间为30s；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为3％，消毒时间为10min。

优选地，在用次氯酸钠溶液混合消毒时，还包括加入占次氯酸钠溶液总体积0.02％的吐温-20。

优选地，所述光暗交替培养过程中，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。

本发明提供了一种组培苗的培育方法，包括如下步骤：

a.将上述技术方案所述方法制备得到的胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基上在25℃培养2个月，得到白桦体细胞胚；

b.将所述步骤a得到的白桦体细胞胚接种至生根培养基上在25℃培养1～2个月，得到白桦再生组培苗。

优选地，所述步骤a中体细胞胚诱导培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L。

优选地，所述步骤b中生根培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：琼脂5.5g/L和蔗糖40g/L。

本发明提供了一种白桦胚性愈伤组织诱导培养基，利用本发明的胚性愈伤组织诱导培养基使得愈伤诱导率达到90％以上，胚性愈伤诱导率达到19％以上。

本发明提供了一种基于白桦未成熟胚诱导胚性愈伤组织的方法，本发明利用未成熟胚体细胞胚培育诱导胚性愈伤具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点。具有以下优势：(1)具有两极性，在体细胞胚发育的早期阶段从方向相反的两端分化出胚根和胚芽，在形态上具有明显的极性，其发育过程与合子胚相似，结构完整，就像一颗种子，而不定芽和不定根都是单向极性；(2)存在生理隔离，体细胞胚形成后与母体植物或外植体的维管束系统联系较少，即出现所谓生理上的隔离现象，表明体细胞胚与合子胚相似，从一开始便是一个完整的植物体的雏形；(3)遗传性相对稳定，因为只有那些未经畸变的细胞或变异很小的细胞才能形成体细胞胚，而且体细胞胚是从单细胞或小细胞团直接分化成小植株，但器官发生再生植株一般要经过脱分化和再分化过程，而且芽和根要分别在不同条件下诱导，因而时间长，而细胞变异的频率又是随着继代次数和培养时间的延长而增加，所以通过体细胞胚形成的再生植株的变异性小于器官发生途径形成的再生植株，遗传性状相对稳定；(4)重演受精卵形态发生的特性，体细胞胚发生途径是细胞全能性表达最完全的一种方式，它不仅表明植物体细胞具有全套遗传信息，而且体细胞胚发生途径重演了合子胚形态发生的进程。

本发明提供了一种组培苗的培育方法，通过对胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基上培养，得到的植株接种至生根培养基上得到组培苗，植株的再生率高。

附图说明

图1为白桦休眠芽、叶片及茎段诱导愈伤组织图，其中A为白桦休眠芽，B为白桦叶片，C为白桦茎段；

图2为白桦成熟种子诱导的愈伤组织图，其中A为整体胚性愈伤图，B为非胚性愈伤，C为胚性愈伤；

图3为白桦球果及未成熟胚图，其中A为白桦球果，B为未成熟种子；

图4为白桦未成熟胚诱导的胚性愈伤切片图，其中A为授粉10d的未成熟胚诱导的非胚性愈伤，B为授粉15d的未成熟胚诱导的胚性愈伤；

图5为白桦未成熟胚诱导的体细胞胚发生及植株再生过程图，其中A为鱼雷型体细胞胚，B为萌发早期的体细胞胚，C为萌发后期的体细胞胚，D为生根的再生植株。

具体实施方式

本发明提供了一种白桦胚性愈伤组织诱导培养基，以MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 2mg/L、NAA 0.2mg/L、琼脂5.5g/L和蔗糖40g/L；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。

在本发明中，所述MS培养基为传统的MS培养基，采用常规市售产品即可。

本发明提供的白桦胚性愈伤组织诱导培养基包括2,4-D(二氯苯氧乙酸)。所述白桦胚性愈伤组织诱导培养基中2,4-D的浓度为2mg/L。在本发明中，所述2,4-D是一种生长素类似物能促进愈伤组织增殖。本发明对所述2,4-D的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。

本发明提供的白桦胚性愈伤组织诱导培养基包括NAA(萘乙酸)。所述白桦胚性愈伤组织诱导培养基中NAA的浓度为0.2mg/L。在本发明中，所述NAA是一种生长素能诱导愈伤组织的形成。本发明对所述NAA的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。

本发明提供的白桦胚性愈伤组织诱导培养基包括蔗糖。所述白桦胚性愈伤组织诱导培养基中蔗糖的浓度为40g/L。在本发明中，所述蔗糖可作为培养基中的碳源，同时还能有效调节培养基内的渗透压，调控体细胞胚的生长与发育。本发明对所述蔗糖的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

本发明提供的白桦胚性愈伤组织诱导培养基包括琼脂。所述白桦胚性愈伤组织诱导培养基中琼脂的浓度为5.5g/L。在本发明中，所述琼脂用来凝固培养基。本发明对所述琼脂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

本发明中，所述诱导培养基的pH值为5.8。

本发明对所述诱导培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域所熟知的培养基的常规制备方法即可。

选取白桦未成熟胚进行消毒，将消毒的白桦未成熟胚接种于上述技术方案所述的胚性愈伤组织诱导培养基上，在24～26℃下进行光暗周期培养16h/8h，继代培养4周，得到胚性愈伤组织。

在本发明中，所述消毒方法优选将未成熟的种子用水冲洗后，用体积浓度为70％的酒精溶液浸泡30s后，用水冲洗后，再与质量浓度为3％的次氯酸钠溶液混合消毒10min后，用水冲洗。

在本发明中，用酒精溶液消毒后优选采用蒸馏水冲洗2次。将用蒸馏水冲洗后的未成熟的种子转入质量浓度为3％的次氯酸钠溶液进行消毒，消毒10min。用次氯酸钠溶液消毒后优选用无菌蒸馏水冲洗5次。

在本发明中，在用次氯酸钠溶液消毒时，优选在其中加入占次氯酸钠溶液总体积0.02％的吐温-20共同消毒。在本发明中，所述吐温-20作为去污剂，具有去污的作用。

在本发明中，将所述消毒的白桦未成熟胚接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，在24～26℃下进行光暗周期培养16h/8h，继代培养4周，得到胚性愈伤组织。本发明对所述胚性愈伤组织诱导培养基的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基配制方法即可。本发明对所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的接种方法即可。

在本发明中，所述光暗培养的培养温度优选为25℃。在本发明中，当采用光培养时，所述光培养的光照强度优选为为36μmol·m^-2·s^-1。本发明采用继代培养，所述继代培养的周期为4周。

本发明还提供了一种组培苗的培育方法，包括如下步骤：

在本发明中，所述体细胞胚诱导培养基优选以1/2MS培养基为基本培养基，包括：BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L。在本发明中，所述BA为细胞分裂素，具有促进细胞分裂的作用。在本发明中，所述1/2MS培养基为传统MS培养基含量减半的培养基。本发明对所述1/2MS培养基的配制方法没有特殊限定，采用本领域常规配制方法即可。

在本发明中，所述生根培养基优选以WPM培养基为基本培养基，包括：琼脂5.5g/L和蔗糖40g/L。在本发明中，所述WPM培养基为本领域常规WPM培养基。本发明对所述WPM培养基的配制方法没有特殊限定，采用本领域常规配制方法即可。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

白桦胚性愈伤组织诱导培养基：以MS培养基为基本培养基，含有2,4-D2mg/L、NAA0.2mg/L、琼脂5.5g/L和蔗糖40g/L；其中，胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。将上述培养基分装到100ml容积的三角瓶中，121℃下高压灭菌15min。

实施例2

1白桦未成熟胚诱导胚性愈伤

1.1取材

从白桦良种成年树上采集自5月4日授粉开始到6月4日授粉约1个月后的未成熟种子进行消毒，球果及未成熟种子如图3。

1.2胚性愈伤的诱导

将消毒(消毒方法同对比例1)后的外植体接种到含有4％蔗糖、5.5g·L^-1琼脂和2.0mg·L^-12,4-D和0.2mg·L^-1NAA的MS培养基中暗培养，每4周继代一次，放置于温度调节为25±1℃，光暗周期16h/8h，光照强度36μmol·m^-2·s^-1的培养室里培养，继代培养周期为4周。

结果表明，外植体的污染率为0％，授粉一个月之内的未成熟种子的愈伤组织诱导率达到85％以上(表1)。早期的授粉10d之内的未成熟胚因未达到球形胚时期，诱导的愈伤为白色，愈伤块比较硬，胚性诱导率仅为1.6％。生长速度快，在显微镜下观察细胞大而空(见图4中的A)，水分含量高，这种愈伤不是胚性愈伤。随着时间的推移，慢慢生长到球形胚时期大约授粉15d至20d的种子诱导的愈伤为米白色，愈伤生长速度慢些，镜下观察细胞内含物比较致密，含有很多颗粒状的淀粉粒(见图4中的B)，基本上授粉15d左右的球型至心型期间的未成熟胚最终能成功地诱导出胚性愈伤并转化成再生植株，胚性愈伤诱导率为20％左右。而5月下旬至6月初，大约授粉一个月左右的未成熟胚诱导的大多数愈伤为非胚性愈伤，胚性愈伤诱导率仅为5.5％。授粉30d以上的种子就无法诱导胚性愈伤。

表1.不同授粉时间的白桦未成熟胚的胚性愈伤诱导率

对比例1

1外植体的选择和处理

1.1取材

2017年2月和2017年5月初，分别从东北林业大学白桦强化育种基地温室和院内的白桦和裂叶华的4年生以上植株上采集，取其冬芽、嫩叶、嫩茎；以及-20度冰箱保存的白桦良种成熟种子为外植体。

1.2外植体的消毒

外植体用自来水冲1d后，在超净工作台上用70％酒精浸泡30s，蒸馏水冲洗2遍，转入3％NaClO(内加一滴吐温-20)消毒10min，用无菌蒸馏水冲洗5遍。

1.3外植体的接种

将消毒后的四种外植体接种到含有4％蔗糖、5.5g·L^-1琼脂和2.0mg·L^-12,4-D和0.2mg·L^-1NAA的MS培养基上，放置于温度调节为25±1℃，光暗周期16h/8h，光照强度36μmol·m^-2·s^-1的培养室里培养，继代培养周期为4周。

结果各种外植体在愈伤组织诱导培养基中暗培养，每隔4周继代一次，培养一个月后，各种外植体都能诱导出愈伤组织，其中冬芽的污染率很高(90％)，愈伤组织诱导率也只有6.5％以外，叶片、茎段(图1)和成熟种子(见图2中的A)外植体的愈伤组织诱导率都达到100％。但是，大部分是坚硬的非胚性愈伤组织(见图2中的B)。其中只有2个成熟种子外植体直接诱导出半透明乳白色的胚性愈伤组织(见图2中的C)。刚开始胚性愈伤组织的增殖速度很慢，经过数次继代培养胚性愈伤组织的增殖速度开始加快了。

实施例3

将实施例2诱导培养得到的胚性愈伤接种到体细胞胚诱导培养基中进行体细胞胚的诱导(体细胞胚见图5中的A-C)；所用体细胞胚诱导培养基为固体培养基，成分为1/2MS培养基添加0.5mg·L^-1BA和0.1mg·L^-1NAA。

将上述诱导培养得到的植株分成单棵接种到增殖生根培养基上进行培养得到组培苗(见图5中的D)，所用生根培养基为固体培养基，其成分为WPM培养基添加4％蔗糖和5.5g·L^-1琼脂。

由以上实施例可知，本发明利用未成熟的胚诱导胚性愈伤，污染率为0％，愈伤组织诱导率达到90％以上，胚性愈伤诱导率达到19％以上，较利用器官冬芽、嫩叶、嫩枝和成熟种子为外植体，胚性愈伤诱导率高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种白桦胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，以MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 2mg/L、NAA 0.2mg/L、琼脂5.5g/L和蔗糖40g/L；

所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。

2.一种基于白桦未成熟胚诱导胚性愈伤组织的方法，包括：选取白桦未成熟胚进行消毒，将消毒的白桦未成熟胚接种于权利要求1所述的胚性愈伤组织诱导培养基上，在24～26℃下进行光暗交替培养，继代培养4周，得到胚性愈伤组织；所述光暗交替培养过程中，光培养的时间为16h，暗培养的时间为8h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述未成熟胚为授粉15～25d的球型至心型期的未成熟胚。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消毒的方法包括：将未成熟的胚依次用酒精溶液浸泡，用水冲洗后，再与次氯酸钠溶液混合消毒后，用水冲洗；所述酒精溶液的体积浓度为70％，浸泡时间为30s；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为3％，消毒时间为10min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在用次氯酸钠溶液混合消毒时，还包括加入占次氯酸钠溶液总体积0.02％的吐温-20。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光暗交替培养过程中，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。

7.一种组培苗的培育方法，包括如下步骤：

a.将权利要求2～6任一项所述方法制备得到的胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基上在25℃培养2个月，得到白桦体细胞胚；

8.根据权利要求7所述的培育方法，其特征在于，所述步骤a中体细胞胚诱导培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L。

9.根据权利要求7所述的培育方法，其特征在于，所述步骤b中生根培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：琼脂5.5g/L和蔗糖40g/L。