CN116965337A - 一种同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积的方法，属于生物技术领域。本发明提供了电刺激在同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积中的应用，所述电刺激的电流强度为100mA，处理时间为30min。具体包括对刺五加胚性愈伤组织依次进行电刺激和暗培养，所述暗培养的培养时间为28d；所述胚性愈伤组织为经过继代培养2个周期的胚性愈伤组织。本发明协调了诱导或调控下活性物质累积和细胞生长不能同时兼顾的问题，为利用植物细胞工程技术生产活性物质提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积的方法。
背景技术
刺五加（Acanthopanax senticosus）是五加科五加属的多年生落叶灌木，在我国主要分布于黑龙江、吉林和辽宁等地。《本草纲目》、《神农本草经》和《中华人民共和国药典》等将五加皮列为上品，具有益气健脾、补气安神之功效。现代药理学研究表明，刺五加根茎富含皂苷类、多糖和黄酮等活性成分，具有抗感染、抗病毒、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、增强机体免疫力、降低血糖血脂等多种药理学功能。
以细胞全能性为基础建立起来的植物细胞培养技术为刺五加中黄酮等有用活性物质的生产提供了一条新途径，它不仅不受土地资源和季节的限制，更不受其活性物质累积部位的影响。在应用植物细胞培养生产植物有用活性物质的研究中，国内外研究者通过优质细胞系的选育、培养条件的优化、诱导技术以及活性物质生物合成的途径工程等，促进有用活性物质的高产。但同时发现，诱导或调控细胞生长与活性物质的累积一般不同步，即有助于活性物质累积高的调控或诱导技术一般抑制细胞的生长。因此，探索一种新的调控技术，使得在诱导调控的过程中最大限度地增加细胞的生长和活性物质的累积，是目前有待解决的科学问题。
发明内容
发明人前期通过细胞工程手段获得了产黄酮和皂苷等的一株刺五加胚性愈伤组织细胞系，该细胞系可以通过体细胞胚途径发育形成完整植株，但该细胞系生长速率相对较慢。然而，寻找促进其生长和活性物质累积的绿色环保方法是该细胞系能够被高效利用以及用于工业化生产的前提保障。因此，本发明致力于探索促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮等活性物质累积的方法，以促进刺五加胚性愈伤组织的工业化利用。
本发明的目的是提供一种同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积的方法，以解决上述现有技术存在的问题。本发明的方法协调了诱导或调控下活性物质累积和细胞生长不能同时兼顾的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供电刺激在同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积中的应用，所述电刺激的电流强度为100 mA，处理时间为30 min。
本发明还提供一种利用电刺激同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积的方法，包括对刺五加胚性愈伤组织依次进行电刺激和暗培养；所述电刺激的电流强度为100mA，处理时间为30min。
进一步地，所述暗培养的培养时间为28d。
进一步地，所述胚性愈伤组织为经过继代培养2个周期的胚性愈伤组织。
进一步地，所述刺五加胚性愈伤组织由刺五加的茎段接种在含有1.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的MS培养基上培养获得。
进一步地，所述刺五加的茎段为刺五加无菌苗的茎段。
进一步地，所述刺五加无菌苗由刺五加完整的胚经过组织培养获得，所述组织培养的培养基为不含激素的MS培养基。
进一步地，所述刺五加完整的胚由成熟的刺五加种子先用乙醇溶液浸泡，再用次氯酸钠溶液浸泡后，灭菌蒸馏水冲洗后获得。
本发明公开了以下技术效果：
本发明首次提出了电刺激能够同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积，调整电流强度和处理时间能够在促进刺五加胚性愈伤组织生长的同时，满足其活性物质积累不受抑制。
本发明提供了一种同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积的电刺激调控方法，该方法协调了诱导或调控下活性物质累积和细胞生长不能同时兼顾的问题，为利用植物细胞工程技术生产活性物质提供了技术支撑，促进了刺五加胚性愈伤组织的工业化生产和利用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为刺五加胚性愈伤组织电镜图；
图2为不同电刺激处理后暗培养28d的胚性愈伤组织的鲜重图；
图3为不同电刺激处理后暗培养28d的胚性愈伤组织的干重图；
图4为不同电刺激处理后暗培养28d的胚性愈伤组织的中累积的总黄酮含量图；
图5为暗培养28d后不同电流强度电刺激90 min下胚性愈伤组织中的总黄酮含量图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所用实验材料为刺五加胚性愈伤组织，该愈伤组织由刺五加种子胚接苗的茎段在含有1.0mg·L-12,4-D的MS培养基上获得。具体方法如下：
将成熟的刺五加种子用体积浓度70%的乙醇溶液浸泡1.50 min，再用体积分数5%的次氯酸钠溶液浸泡10 min，灭菌蒸馏水冲洗3-5次，取出完整胚接种于无激素的MS培养基上获得无菌苗，再将无菌苗的茎段放入愈伤组织诱导培养基上，诱导生成愈伤组织，将诱导的愈伤组织继代2个周期，其中愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中添加1.0 mg·L-12,4-D。
实施例1 电刺激促进刺五加胚性愈伤组织的生长
愈伤组织继代2个周期后，选择生长一致的如图1所示的胚性愈伤组织进行电刺激试验，将刺五加胚性愈伤组织在超净工作台中使用电泳仪进行电刺激，每组1g刺五加胚性愈伤组织，本实施例中将电流强度和电刺激时间作为变量设计6组进行试验，同时以未进行电刺激处理的胚性愈伤组织作为对照，具体如表1所示。
表1 分组和电刺激处理
处理结束后将胚性愈伤组织放入具有新鲜的MS培养基的培养皿中暗培养28d，收获不同电刺激组合下暗培养28d的愈伤组织，去离子水洗净后用无菌滤纸吸干水分进行鲜重测量，鲜重结果如图2所示，与对照组相比，电流强度100mA，处理90min的愈伤组织鲜重增加最多，比对照增加了26.25%，效果最好。
将测量完鲜重的材料置于烘箱中干燥（105℃干燥15min后，在60℃下干燥至恒重），恒重后记录烘干材料的重量，该重量为干重，干重结果如图3所示，与对照组相比，电流强度100mA，处理90min和电流强度150mA处理30min的愈伤组织干重增加最多，比对照增加了15.31%，效果最佳。
实施例2 电刺激促进刺五加胚性愈伤组织中黄酮的累积
分别称取0.1g实施例1中获得的每组烘干样品，将其浸泡于5mL体积浓度为60%的乙醇溶液中，浸提24h后，超声提取30min，取上清液1 mL，采用硝酸铝比色法测定总黄酮含量，结果如图4所示，与对照组相比，电流强度50mA处理30 min后，愈伤组织中总黄酮含量增加最多，效果最佳。但此条件下愈伤组织的干鲜重与对照相比均受到抑制。整体分析图2-4，可以得出，在电流强度为100mA，处理时间为30min的条件下，处理组愈伤组织的生长和总黄酮的含量与对照组相比均显著提高，虽然在此条件下，电刺激对促进愈伤组织的生长和总黄酮的含量积累效果并不是最好的，但协调了诱导或调控下活性物质累积和细胞生长不能同时兼顾的问题。
为了比较电刺激在胚性愈伤组织的不同培养阶段的影响，取实施例1中未进行电刺激处理的对照组（暗培养28d后的胚性愈伤组织），分别采用50mA、100mA和150mA电流强度处理90min，得到3种处理完的胚性愈伤组织。以未处理的胚性愈伤组织为对照。
将3种处理完的胚性愈伤组织分别烘干后，分别将其浸泡于5mL体积浓度为60%的乙醇溶液中，浸提24h后，超声提取30min，取上清液1mL，采用硝酸铝比色法测定总黄酮含量，结果如图5所示，与对照组相比，电流强度50mA处理后，愈伤组织中总黄酮含量增加最多，比对照增加了33.68%，效果最佳。但总黄酮的含量在整体水平上不如图4。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.电刺激在同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积中的应用，其特征在于，所述电刺激的电流强度为100mA，处理时间为30min。
2.一种利用电刺激同步促进刺五加胚性愈伤组织生长和黄酮累积的方法，其特征在于，包括对刺五加胚性愈伤组织依次进行电刺激和暗培养；所述电刺激的电流强度为100mA，处理时间为30min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述暗培养的培养时间为28d。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织为经过继代培养2个周期的胚性愈伤组织。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述刺五加胚性愈伤组织由刺五加的茎段接种在含有1.0mg·L-1 2,4-D的MS培养基上培养获得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述刺五加的茎段为刺五加无菌苗的茎段。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述刺五加无菌苗由刺五加完整的胚经过组织培养获得，所述组织培养的培养基为不含激素的MS培养基。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述刺五加完整的胚由成熟的刺五加种子先用乙醇溶液浸泡，再用次氯酸钠溶液浸泡后，灭菌蒸馏水冲洗后获得。
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| Publication number | Publication date |
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