CN102603877A

CN102603877A - 一种植物耐硒蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN102603877A
Application number: CN2012100448451A
Authority: CN
Inventors: 江力; 慈凌坤; 曹树青; 卢云峰
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-02-24
Also published as: CN102603877B

Abstract

本发明公开了一种植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白及其编码基因与应用。植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白是序列表中SEQ ID No：2，其编码基因是序列表中SEQ ID No：1 DNA序列。本发明所提供的增强植物耐硒及增加植物中硒含量的方法，是抑制植物中的上述植物耐硒及增加植物中硒含量相关蛋白编码基因的表达。为农作物耐硒育种提供基因与技术支持。

Description

一种植物耐硒蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域中一个植物耐硒相关基因及其编码蛋白与应用和利用该基因增强植物耐硒的方法。

背景技术

硒是环境中一种重要的生命元素，是人体必需的微量元素，对机体发挥着极其重要的作用。然而一方面硒在地壳中的含量相当稀少和分散，硒缺乏在全世界是一种很普遍的现象，另一方面硒污染在某些地区也同时存在着。硒污染的产生主要与人类的生产活动有关，它可以从一些矿业、农业、石化产品和工业制造业所产生的废弃原料中释放出来，从而在土壤、水体中富集形成污染。植物、动物吸收了土壤或水体中过量的硒就会产生毒害作用，在植物、动物体内形成富集，并最终通过食物链对人体产生毒害作用。因此，硒的缺乏和过剩都与人的生命活动休戚相关，深入探讨植物对硒耐受性机制具有重要理论意义和实践价值。利用先进的分子生物学手段分离耐硒的抗性基因，再利用转基因技术培育出更多的耐硒植物是未来的发展趋势。其潜在的应用价值一方面是通过在农作物中表达硒代谢关键基因来调节农产品含硒水平，满足人类健康摄硒的需要；另一方面利用转基因技术实现通过植物治理环境硒污染的目标。

拟南芥是一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，对拟南芥耐硒的分子生物学机制的研究对提高植物的耐硒能力具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南芥测序数据库寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一。利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法，通过对突变体的研究，发现了一些耐硒基因的功能，如AtGPX，AtHMT，APS等，这些基因在突变体和野生型中的转录水平不一样。

目前定位出的耐硒基因还非常有限，我们从化学诱导型激活标签子系统构建的拟南芥突变体库中筛选到功能获得性耐硒及增加硒吸收的突变体vse1，克隆获得具有耐硒功能的基因VSE1，基因转录水平分析显示，在硒盐胁迫条件下，其转录水平提高。为此，我们研究了该基因功能，并在分子生物学水平上阐明了该基因耐硒胁迫的机理。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白及其编码基因，本发明所提供的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因VSE1，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥(Col-0)，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质，氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No：2所示或是将SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No：2限定的蛋白质具有相同活性的由SEQ ID No：2衍生的氨基酸残基序列。

序列表中的序列2由250个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

VSE1的编码基因也属于本发明的保护范围。

VSE1的cDNA基因，选自下述核甘酸序列之一；

(1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

(3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；

(4)与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列1由1269个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5’端第446位至1876位碱基，编码序列SEQ ID No：2的蛋白质。

含有本发明VSE1的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增VSE1中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法。

本发明所提供的增强植物对硒耐受性及增加硒含量的方法，是抑制植物耐硒及增加植物硒含量相关蛋白编码基因的表达，该表达可通过多种方法实现。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制VSE1表达即可。

利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除后，植物表现为耐硒性状；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的VSE1转入野生型植物中，植物就表现出对硒非耐受。

本发明利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的突变体库中筛选并通过表型和生理生化鉴定得到功能获得型耐硒突变体vse1，用经典的CTAB法提取vse1基因组DNA，再通过Tail-PCR获得耐硒基因VSE1，后经上海生工生物工程有限公司测序鉴定并在TAIR数据库中进行序列比对，最后进行基因定位，获得一个新的耐硒基因。构建了VSE1基因的过量表达载体，并导入根癌农杆菌C58菌株中，用花絮浸渍法进行拟南芥植株的遗传转化，并用抗生素筛选转化株，以期观察该转基因植株在硒胁迫下的表型，并研究其功能。

本发明的VSE1基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物耐硒症状来筛选转化植株。携带有本发明VSE1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的植物耐硒相关基因为农作物耐硒育种提供基因与技术的支持。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

附图说明

图1是本发明以40mg/LNa₂SeO₃作为筛选的临界浓度，获得耐硒突变体vse1

图2是本发明突变体vse1和野生型植株在土培条件下生长状况比较

图3是本发明突变vse1在不同Na₂SeO₃浓度下发芽率比较

图4是本发明突变体vse1和野生型植株对硒盐耐受性比较

图5是本发明vse1和野生型主根长、鲜重、蛋白质、GSH-Px、APX、硒含量等比较

图6是本发明vse1突变体在硒盐胁迫下相关基因的表达

图7是本发明T-DNA插入位点图谱分析

图8是本发明VSE1基因基因表达模式分析

具体实施方式

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、VSE1基因的获得

利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的突变体库中通过对野生型和突变体拟南芥在20mg/L、30mg/L和40mg/L三个Na₂SeO₃浓度梯度选择培养基中进行培养，在40mg/L Na₂SeO₃浓度下，WT完全不能存活而突变体有三株能够生长，得到疑似耐硒突变体，并通过表型和生理生化鉴定得到功能获得型耐硒突变体vse1，用经典的CTAB法提取vse1基因组DNA，以提取出来的DNA为模板，进行如下Tail-PCR反应：20μl反应体系，内含10×PCR缓冲液、dNTPs(2.5mM)混合物、巢式引物(2μM)和随机引物(50μM)、Taq酶(5U/μl)，其余加双蒸水至20μl。其中，巢式引物1：LexA2、LexA3、LexA4、LexA5、LexA6以及随机引物2：AD1、AD2、AD3、AD4见表一。

Tail-PCR所用的引物序列

将获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。将PCR得到的DNA片段连接于pGEM-T载体，得到含有目的片段的载体pT-VSE1，进行测序鉴定，结果表明PCR得到的DNA片段具有序列表中序列SEQ ID No：1的DNA序列，为VSE1的DNA基因，由2106个碱基组成，其编码序列为自5’端第446位碱基到第1876位碱基，编码具有序列表中序列SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例2、培育对硒耐受性增强的拟南芥

1、耐硒突变体vse1的获得

设定20mg/L、30mg/L和40mg/L三个Na₂SeO₃浓度梯度进行耐硒突变体筛选实验，发现在40mg/L Na₂SeO₃浓度下野生型全部不能生长，而突变体有三株长势很好(图1)，将其土培移栽后只有一株存活，命名为耐硒突变体vse1。

2、vse1和野生型植株在土培条件下生长状况比较

正常光照条件下突变体vse1和WT(野生型植株，下同)生长发育，如图2所示，发现在正常土培培养条件下突变体vse1与WT的形态没有显著差别，表明VSE1基因功能缺失突变对植株生长发育没有产生显著影响。

2、vse1在不同Na₂SeO₃浓度下发芽率比较

将野生型与突变体vse1同时播种于直径为90mm的平皿中(平皿中分别加有MS和Na₂SeO₃半固体培养基)，4℃春化3天后，置于22℃恒温光照下(光周期为16小时光照，8小时黑暗)培养，14天后观察结果。从图3中我们可以看出在30mg/L Na₂SeO₃和40mg/LNa₂SeO₃条件下突变体vse1的发芽率和野生型无明显差异，而在50mg/L Na₂SeO₃胁迫条件下突变体vse1的发芽率明显高于野生型。

3、突变体vse1与野生型植株对硒耐受性比较

将野生型与突变体vse1同时播种于直径为90mm的平皿中(平皿中分别加有MS和Na₂SeO₃半固体培养基)，4℃春化3天后，置于22℃恒温光照下(光周期为16小时光照，8小时黑暗)培养，21天后观察结果。从图4的结果我们可以看出，相对于野生型来说，突变体vse1表现出了对硒耐受性的性状。硒胁迫条件下突变体vse1的根长明显高于野生型，如图5-A所示。鲜重测定结果也显示，在Na₂SeO₃培养条件下，突变体vse1的鲜重明显高于野生型，如图5-B所示。上述结果表明了vse1耐硒能力比野生型强。

4、vse1和野生型蛋白质含量比较

蛋白质的积累是植物对硒胁迫响应的一个重要指标。为进一步从生理上说明上述现象，测定了在正常和硒盐胁迫条件下vse1和WT植株体内蛋白质含量，如图5-C所示。在正常生长条件下，vse1和WT植株体内蛋白质积累没有显著差异。相比之下，在硒胁迫条件下，vse1和WT植株体内蛋白质积累显著增加，但突变体vse1比WT积累得更多，进一步说明vse1突变体较WT对硒胁迫更加耐受。这些结果表明，VSE1基因参与拟南芥对硒胁迫响应的调控。

5、vse1和野生型GSH-Px、APX活性比较

硒胁迫还会使植物体内产生大量活性氧自由基，ROS水平上升，对植物体造成严重的伤害，植物通过抗氧化系统的一系列的防御机制清除活性氧保护自身。抗氧化防御作用可通过GSH-Px、APX等抗氧化酶来清除活性氧，又硒是GSH-Px的活性中心，GSH-Px活性大小是植物对硒胁迫响应的一个重要指标。为进一步确定vse1耐硒胁迫是否与其体内GSH-Px、APX等抗氧化酶活性有关，测定了在正常生长和硒胁迫条件下vse1和WT植株体内GSH-Px、APX等抗氧化酶活性。在正常生长条件下，vse1和WT植株体内GSH-Px活性没有显著差异，然而在硒胁迫条件下，vse1体内GSH-Px活性明显比WT高，如图5-D所示，说明vse1对硒胁迫的耐受可能是由于相关抗氧化酶的活性升高所致。

6、vse1和野生型硒含量比较

为进一步确定vse1耐硒胁迫是否与其体内硒含量有关，测定了在正常生长和硒胁迫条件下vse1和WT植株叶和根部硒含量。在正常生长条件下，vse1和WT植株的根部和叶部积累的硒没有显著差异。然而在硒胁迫条件下，vse1的叶部积累的硒与WT相比差异不显著(图5-F)，而根部差异极显著(图5-G)，说明在硒胁迫时，突变体vse1较WT更好地在体内转化硒，以致突变体植株受到较小的伤害，这与表型上的结果一致。

7、vse1突变体在硒胁迫下相关基因的表达变化

植物对硒胁迫条件的适应会涉及很多种基因，其中有许多基因对植物有效地吸收和利用硒具有专一性，另外一些则涉及多种硒胁迫基因表达的调控。为进一步说明突变体vse1对硒胁迫耐受的可能分子机理，采用RT-PCR的方法检测了硒胁迫条件下硒诱导4个相关基因的表达(图6)。植物体内的AtGPX可能是多基因家族成员，它们可能在不同的胁迫环境下调控不同的发育途径和防御反应。研究结果表明，不同的环境胁迫下，表达AtGPX的mRNA水平稳步提高，因此AtGPX在植物氧化信号转导过程中可能起着重要作用。从图6可以看出，它在硒诱导下的WT中转录水平很低，而在突变体中转录水平非常高；AtHMT能够减少硒代高半胱氨酸在细胞内的浓度，这些氨基酸掺入到蛋白质后可以对植物蛋白的结构、肽键状态产生影响并导致蛋白功能的损害，如果硒被转化为非蛋白硒代氨基酸，就可以减少硒的掺入。从图6可以看出，它在硒诱导下的WT和vse1中转录水平无明显差异。这些结果进一步说明突变体vse1较WT更加对硒胁迫耐受。

8.T-DNA插入位点图谱分析

VSE1基因测序结果在NCBI数据库Blast后结果显示，T-DNA插入了AT1G07890基因的起始密码子ATG下游第二个内含子处(图7).

9.VSE1基因基因表达模式分析

为了证明VSE1基因在突变体中被敲除，采用RT-PCR的方法检测了硒胁迫条件下VSE1基因。从图8中可以看出VSE1基因在野生型中正常表达，而在突变体中几乎不表达，表明vse1为基因敲除型突变体。

Claims

1.一种植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白，其特征在于：氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No：2所示或是将SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No：2限定的蛋白质具有相同活性的由SEQ ID No：2衍生的氨基酸残基序列。

2.权利要求1所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因，其特征在于：选自下列核苷酸之一：

(1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

(3)在高严谨条件下与SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

(4)与SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3.根据权利要求2所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因，其特征在于，所述基因序列的开放阅读框架为SEQ ID No：2自5’端第446位至1876位碱基。

4.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的载体。

5.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的宿主菌。

7.一种增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法，其特征在于：是抑制植物中如权利要求2所述的耐硒及增加植物硒含量相关蛋白编码基因的表达。

8.根据权利要求7所述的一种增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法，其特征在于：抑制植物中耐硒相关蛋白编码基因表达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法，或者反义核酸技术沉默基因的方法，或者siRNA介导的基因沉默方法。

9.权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因在增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的应用。