CN110452913A

CN110452913A - 一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其在提高植物耐热性中的应用

Info

Publication number: CN110452913A
Application number: CN201910823498.4A
Authority: CN
Inventors: 曹必好; 颜爽爽; 余炳伟; 周火燕; 邱正坤; 雷建军; 陈长明
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2039-09-02
Also published as: CN110452913B

Abstract

本发明属于植物抗逆性技术领域，具体涉及一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其在提高植物耐热性中的应用，本发明根据植物的多桥连蛋白的基因序列，通过设计特异引物，从黄瓜中克隆出黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c，对该基因进行了生物信息学分析表明、超表达重组载体和亚细胞定位重组载体构建，并将其遗传转化黄瓜，实验结果表明，该基因可以通过提高植物的抗氧化防御系统、提高植物光合系统在高温逆境下的稳健性来应对热胁迫，从而使转基因植株的耐热性得到提高。本发明为创制黄瓜耐热品种创新了基因资源，为耐热黄瓜品种的培育创造条件和务实理论基础，同时也给其他作物品种的耐热性应用研究提供了新的方法和思路。

Description

一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其在提高植物耐热性中的应用

技术领域

本发明属于植物抗逆性技术领域，具体涉及一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其在提高植物耐热性中的应用。

背景技术

黄瓜（Cucumis sativus L.）是葫芦科（Cucurbitaceae）黄瓜属（Cuaumis）一年蔓生草本植物，中国是目前世界上黄瓜生产面积、产量和消费量最大的国家，据农业部统计，黄瓜栽培面积占全国蔬菜栽培总面积的5%左右，且设施栽培面积逐年增加，是我国最重要的蔬菜作物之一。黄瓜既可以加工又可以鲜食，富含碳水化合物、矿物盐和维生素C，具备食用、美容、药用等多种功效，以其果实清脆爽口，风味独特，而深受大众消费者的喜爱，具有巨大的消费潜力和市场。黄瓜发源于喜马拉雅山麓、尼泊尔及锡金一带温暖湿润的亚热带地区，是一种性喜温，不耐热的作物，生长适温在25-30℃，高于35℃的外界持续高温易使其出现高温障碍，导致黄瓜生长发育不正常，易诱发大规模病害发生，并伴随有早衰，败育，畸形瓜等一系列减产现象。

随着全球极端气候事件的增加，作物的抗逆性能力越来越受到重点关注。在我国南方地区高温天气出现得早，持续得久，夏季气温常持续出现35℃以上的高温天气，尤其是保护地栽培，棚内温度可达40-50℃，是限制南方地区黄瓜栽培的主要逆境因素，而在北方地区，夏天极端高温天气也时有发生，严重地影响了黄瓜的生产和供应，故而提高黄瓜对高温天气的抵御能力，培育耐热黄瓜品种便显得尤为重要。

目前，针对作物抵御高温的抗逆性机制研究相对落后，尤其是在黄瓜的耐热性研究方面，不仅没有在解决黄瓜耐高温问题的措施和手段上取得较明显的突破，而且也没有发现能抵御高温的黄瓜品种，给黄瓜的生产带来了较大的麻烦，因此，挖掘黄瓜等作物的耐热关键基因，解析抵御高温的机理，培育抗高温作物显得尤为重要。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其在提高植物耐热性中的应用，根据植物的多桥连蛋白基因特征序列，通过分析设计特异引物，从黄瓜中克隆出黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c，并转化黄瓜中，转基因株系的耐热性得到了显著提高，研究结果为创制黄瓜耐热材料提供了有益的方法和思路。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c，所述基因具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。所述基因的长度为438 bp，编码145个氨基酸，与陆地棉GhMBF1c的同源性最高。

所述CsMBF1c的获取方法为：以黄瓜自交系“02-8”的cDNA为模板，利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 3中所示的引物对进行PCR扩增，经克隆、测序后获得。

本发明还提供由所述基因编码的黄瓜多桥连蛋白，所述黄瓜多桥连蛋白具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。该蛋白相对分子量为15869.46 kDa，等电点pI为10.22，蛋白偏碱性。

本发明提供的黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其编码蛋白均可应用于提高植物抗逆性中，具体而言，所述黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其编码蛋白可提高植物抵抗高温、低温、脱落酸和高盐等不利环境的能力。

研究表明，黄瓜在高温（37℃）、低温（4℃）、脱落酸（200 µM ABA）和高盐（200 mMNacl）等胁迫处理下都能够诱导CsMBF1c的显著性上调表达。

进一步的，上述黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c可以应用在提高植物的耐热性中。

研究表明，黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c可以通过提高植物的抗氧化防御系统、提高植物光合系统在高温逆境下的稳健性来应对热胁迫。

进一步的，上述黄瓜多桥连蛋白可以应用在提高植物的耐热性中。

生物信息学分析表明，黄瓜多桥连蛋白具有核酸结合功能，特定序列的DNA结合转录因子活性等生物学功能，参与胁迫响应，热响应等多个生物功能的调控。

进一步的，上述黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c可以应用在培育植物耐热品种中。

研究表明，多桥连蛋白基因CsMBF1c过表达重组载体遗传转化热敏型黄瓜自交系后，热害症状不明显。

进一步的，包含上述黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c的重组载体可以应用在提高植物的耐热性中。所述重组载体包括超表达重组载体和亚细胞定位重组载体。

优选的，在上述的各种应用方案中，所述的植物为黄瓜。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提出了一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其在提高植物耐热性中的应用，本发明根据植物的多桥连蛋白的基因序列，通过设计特异引物，从黄瓜中克隆出黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c，该基因的长度为438 bp，编码145个氨基酸，生物信息学分析表明，与陆地棉GhMBF1c的同源性最高，可能参与调控多个与逆境胁迫相关的代谢通路，参与胁迫响应、热响应等多个生物功能的调控；超表达重组载体和亚细胞定位重组载体的构建表明，该基因在黄瓜受高温、低温、脱落酸和盐等胁迫下表达量呈先升高后降低的趋势，其编码的蛋白在细胞核区域发挥功能；遗传转化黄瓜实验表明，该基因可以通过提高植物的抗氧化防御系统、提高植物光合系统在高温逆境下的稳健性来应对热胁迫，从而使转基因植株的耐热性得到提高。本发明为创制黄瓜耐热品种创新了基因资源，为耐热黄瓜品种的培育创造条件和务实理论基础，同时也给其他作物品种的耐热性应用研究提供了新的方法和思路。

附图说明

图1为CSMBFlc编码的氨基酸序列同源性比较；

图2为CsMBFIc氨基酸序列同源性比较及进化树分析；

图3为CSMBFlc氨基酸的蛋白结构预测（a:CSMBFlc氨基酸组成成分和比例；b:CsMBFlc氨基酸序列的疏水性；c:CsMBFlc蛋自二级结构组成和溶剂可接触性分析；d:CsMBFlc跨膜结构分析；SmNAC结构域分析；CsMBFIc蛋白结合位点分析，其中红色点表示蛋白结合位点，数字表示结合位点位置）；

图4为CsMBF1C亚细胞定位分析；

图5为CsMBF1c的表达特性分析（图中分别为25℃正常环境中，CsMBFlc在黄瓜各组织部位的表达量；高温37℃处理黄瓜后CsMBFlc的表达量；低温4℃处理黄瓜后CsMBFlc的表达量；外源激素200uMABA处理黄瓜后CsMBFlc的表达量；200mMNaCl处理黄瓜后CsMBFlc的表达量）；

图6为CsMBF1c的过表达株系分析（a:T0代转化黄瓜植株的PCR检测；b：转基因植株的qRT-PCR表达分析；c：黄瓜热处理后的表型；d：高温下转化植株和野生型的相对电导率比较分析，高温下转化植株和野生型的MDA含量比较分析，高温下转化植株和野生型的SOD活性比较分析，高温下转化植株和野生型的POD活性比较分析，高温下转化植株和野生型的AsA比较分析）；

图7为CsMBF1c在黄瓜中超表达提高黄瓜耐热性的鉴定（a中左图是25℃时黄瓜转基因株系和野生型的叶绿素荧光图，a中右图是42℃时黄瓜转基因株系和野生型的叶绿素荧光图；b：转基因T1-14-1株系与野生型的各种荧光参数比较分析；c：转基因T1-14-1、T1-14-2株系与野生型的各种荧光参数比较分析）。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实验材料：

黄瓜自交系“2-8”，大肠杆菌（E.coli）菌株DH5α，农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101和EHA105，由本实验室（华南农业大学园艺学院）保存；植物RNA小量提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司）；反转试剂盒Genstar（北京康润生物科技有限公司），胶回收试剂盒Genstar（北京康润生物科技有限公司），pMD19-T Ligation Kit（TaKaRa）。

实施例1 黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c的获取及分析

1、黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c的获取

（1）模板准备，使用植物RNA小量提取试剂盒提取黄瓜自交系“02-8”的RNA（具体操作方法参照试剂盒的说明书），提取所使用的实验器材均经过彻底去除RNase处理，然后采用反转录试剂盒合成cDNA（具体操作方法参照试剂盒的说明书）。

（2）以黄瓜自交系“02-8”的cDNA为模板，利用分别如SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:3所示的上下游引物（5'-3'）进行PCR扩增。

PCR扩增体系：Mix (25 µL)、Primer F (2 µL)、Primer R (2 µL)、cDNA模板2 µL，加ddH₂O补充至50 µL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s(34个循环)；72 ℃ 5 min，产物4 ℃保存。

（3）采用pMD19-T Ligation Kit将PCR扩增得到的特异基因片段连接到pMD19-T表达载体上，转入感受态大肠杆菌DH5α，得到阳性重组菌（具体操作方法参照试剂盒的说明书），最后经测序得到核苷酸序列。

结果显示，扩增得到的特异基因的阅读框为438 bp，编码145个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，通过生物信息学分析网站（Protparam：http://expasy.org/tools）对基因序列作ORF的翻译，得到蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。通过生物信息学分析网站（NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov）对核酸序列和氨基酸序列进行检索、查询和比对（图1），发现该基因及其蛋白与黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c的基因序列（LOC101207723）和蛋白序列相似度达到100%，命名为CsMBF1c。

通过CsMBF1c与AtMBF1a（AT2G42680.1）, AtMBF1b（AT3G58680.1 ）, AtMBF1c（AT3G24500.1）, AtMBF1c2（OAP04487.1）, AtMBF1c3（AEE76906.1）; DcMBF1c（PKU68487.1）, HaMBF1c（OTG30205.1）, SlMBF1c（NP_001307152.1）, NaMBF1c（OIT05459.1）, GhMBF1c（AFN70435.1）, TaMBF1c（ACU43593.1）, AtTPS5（O23617.2）,hypothetical CUMW_193420（GAY59292.1）, hypothetical CUMW2_193410（GAY59291.1）,ZAT8（Q9LX85.1）, TuMBF1c（EMS68393.1）, MnMBF1c（XP_010088841.1）, MnMBF1c2(EXB37036.1), BocMBF1c（1011145.1）构建系统进化树，显示与陆地棉GhMBF1c的同源性最高，结果见图2。

2、黄瓜多桥连蛋白氨基酸序列的生物信息学分析

通过以下生物信息学分析网站对黄瓜多桥连蛋白氨基酸序列进行蛋白结构预测和功能预测：

（1）COILS-：http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.htm，主流的预测蛋白质螺旋卷曲工具；

（2）InterPro：http://www.ebi.ac.uk/interpro/，蛋白质家族、结构域和功能位点的联合资源数据库，整合了多个数据库和工具的结果，并提供相应的链接。

如图3-4的结果所示，黄瓜多桥连蛋白CsMBF1c具有核酸结合功能，特定序列的DNA结合转录因子活性等生物学功能，可能参与调控多个与逆境胁迫相关的代谢通路，参与胁迫响应，热响应等多个生物功能的调控。

3、亚细胞定位分析

（1）将黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c克隆到pBE-GFP载体上，并将重组质粒转化到农杆菌GV3101中，侵染本氏烟草（Nicotiana benthamiana）的叶片，培养三天后，于荧光显微镜下进行观察。具体操作方法参照以下参考文献：

Chen Na, Wu Shuanghua, Fu Jinglong, Cao Bihao, Lei Jianjun, ChenChangming & Jiang Jin. Overexpression of the Eggplant (Solanum melongena) NACFamily Transcription Factor SmNAC Suppresses Resistance to Bacterial Wilt,science reports, 2016, 6:31568.

Yu B, Yan S , Zhou H, Dong R, Lei J , Chen C and Cao B, Overexpression ofCsCaM3 Improves High Temperature Tolerance in Cucumber, Frontiers in PlantScience,2018,6:9.

所用到的上下游引物序列（5'-3'）分别如SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示，上游引物是添加了Xbal I酶切位点，下游引物添加了BamH I酶切位点。

结果显示，黄瓜多桥连蛋白CsMBF1c在细胞核区域发挥功能，见图4。

4、黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c的表达特性分析

（1）为研究黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c的表达特性，以黄瓜自交系“02-8”为材料，分析该基因在黄瓜根、茎、叶、花、果实、种子中的表达特性，以及在37 ℃、4 ℃、200 µM ABA（脱落酸）和200 mM NaCl处理后的表达情况，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行定量分析，具体方法如下：

CsMBF1c的内参引物序列（5'-3'）分别如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示，CsMBF1c的荧光引物序列（5'-3'）分别如SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10所示。

qRT-PCR反应体系如下：2×SYBR Green Mix：10 µL ，cDNA模板：2.0 µL，引物各0.4 µL，加水7.2 µL，总体积是20 µL。反应程序：94 ℃ 6 min；94 ℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 35 s，40个循环。用BIO-RAD公司的IQ5软件来收集及处理数据，用CT值的2-△CT法来计算基因相对表达量。

结果显示，CsMBF1c在黄瓜各组织部位的表达量存在差异，在根组织中表达量最高， 37 ℃、4 ℃、200 µM ABA、200 mM Nacl等胁迫处理都能够诱导CsMBF1c的表达，表现为先升高后降低的趋势，如图5所示。

实施例2 黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c的过表达株系的获取

1、超表达载体的构建

根据已经得到的CsMBF1c基因序列及pBI121载体序列，上游引物加入BamHI限制性内切酶酶切位点，下游引物加入了SacI酶切位点，上下游引物序列（5'-3'）分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO: 12所示。

用BamHI和SacI对CsMBF1c基因的扩增产物和pBI121载体进行双酶切，通过T4连接

酶连接，转化大肠杆菌，筛选重组子pBI-CsMBF1c，将pBI-CsMBF1c转化农杆菌，用于遗传转化黄瓜（具体操作参照“Chen Na, Wu Shuanghua, Fu Jinglong, Cao Bihao, LeiJianjun, Chen Changming & Jiang Jin. Overexpression of the Eggplant (Solanummelongena) NAC Family Transcription Factor SmNAC Suppresses Resistance toBacterial Wilt, science reports, 2016, 6:31568”）。

2、遗传转化黄瓜

（1）黄瓜的遗传转化所用到的培养基

播种培养基（1/2MS培养基）：1/2MS+3%蔗糖+0.7%琼脂(pH5.8)；

分化培养基：MS+0.5mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA+1.0mg/L ZT+3%蔗糖+0.7%琼脂(pH5.8)；

抑菌培养基：MS+0.5mg/L 6-BA（6-苄基腺膘呤）+1.0 mg/L ABA（脱落酸）+1.0mg/L ZT（玉米素）+500mg/L Cef（头孢霉素）+3%蔗糖+0.7%琼脂(pH5.8)；

筛选培养基：MS+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L ABA+1.0mg/L ZT+500mg/L Cef+25mg/L Km（卡那霉素）+3%蔗糖+0.7%琼脂(pH5.8)；

生根培养基：1/2MS+0.2mg/L NAA（萘乙酸）+300mg/L Cef +3%蔗糖+0.7%琼脂(pH5.8)。

（2）遗传转化方法

无菌苗获得：

挑选饱满、没有出芽的黄瓜种子用无菌水冲洗，然后用75%酒精消毒90s，无菌水冲洗2~3遍，再用0.1%升汞溶液消毒5-7min，用无菌水洗3次，倒去无菌水，用灭菌滤纸吸干种子表面残留的水分，播种在1/2MS培养基中，置于人工培养室中培养（具体操作参照“Cao, B.,Lei, J., Chen, G., Cao, P., Liu, X., Chen, Q., Wei, X. . Testing of disease-resistance of pokeweed antiviral protein gene (PacPAP) in transgenic cucumber(Cucumis sativus)[J]. African Journal of Biotechnology, 2011, 10(36): 6883-6890. Liu LY, Duan LS, Zhang JC, Zhang ZX, Mi GQ, Ren HZ. Cucumber (Cucumissativus L.) over-expressing cold-induced transcriptome regulator ICE1exhibits changed morphological characters and enhances chilling tolerance.Sci Hortic (Amsterdam), 2010, 124: 29–33. Sui XL, Meng FZ, Wang HY, Wei YX,Li RF, Wang ZY, Hu LP, Wang SH, Zhang ZX. Molecular cloning, characteristicsand low temperature response of raffinose synthase gene in Cucumis sativus L.J Plant Physiol , 2012,169: 1883–1891. Wang H, Sui X, Guo J, Wang Z, Cheng J,Ma S, Li X, Zhang Z. Antisense suppression of cucumber (Cucumis sativus L.)sucrose synthase 3 (CsSUS3) reduces hypoxic stress tolerance. Plant CellEnviron ,2014,37: 795–810.”）。取苗龄为5-6d的无菌苗（子叶未展平），剔除已长出的芽及子叶的上半部分，留下子叶的其它部分，即得所需的外植体（无菌苗）。

农杆菌侵染：

将转化超表达重组载体的农杆菌活化培养至OD600=0.8左右，收集菌体重悬于无菌MS培养液（PH=7.0）中，稀释至OD600=0.4左右，备用。外植体在超净工作台上用准备好的农杆菌菌液浸染15min，于无菌纸上吹至半干，再重新接种到新鲜的分化培养基中，于28℃恒温黑暗培养2d。

抑菌培养：

Cef是一种抑菌抗生素，可以有效抑制选择培养阶段的农杆菌污染。将共培养2d的外植体插入Cef浓度为300mg/L的抑菌培养基中，抑菌培养分别为下胚轴5-7d，带柄子叶4-5d，带下胚轴的子叶3-4d。

筛选培养：

将共培养的子叶平放在筛选培养基中，通过pBI121载体上卡那霉素抗性筛选标记基因nptII，用卡那霉素（Km）筛选两次，第一次筛选Km浓度为半致死浓度，蔗糖浓度为3%，第二次筛选Km浓度为致死浓度，蔗糖浓度为1%。筛选培养至少许外植体能在选择培养基上长出抗性芽，大部分外植体在含Km的选择培养基上褪绿，变黄为止。

不定芽的生根培养及再生植株的移栽：

当分化的不定芽伸长至1.5-2.5cm时，将其自基部切下，接种于生根培养基。当根生长完全，即可开瓶盖炼苗，移栽到基质中，覆膜保水，温室培养。

（3）转基因植株的鉴定

提取筛选得到的阳性苗的DNA进行PCR鉴定，鉴定引物（扩增片段包含载体序列和CsMBF1c序列）的序列（5'-3'）分别如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示。

使用野生型植株为对照（CK），从PCR鉴定的阳性苗及其自交后代中挑选植株进行荧光定量实验qRT-PCR分析基因的表达情况。

结果显示，侵染了大约7000个外植体，最后得到74株抗性苗，其中能扩增出目的条带的有9株，PCR阳性率为12.2%，如图6a所示，转基因植株T0代及T1代的qRT-PCR结果均显示CsMBF1c表达量较未转基因植株高，如图6b所示。

实例3 CsMBF1c在黄瓜中超表达提高黄瓜耐热性

1、转基因黄瓜的耐热性鉴定

（1）黄瓜幼苗在高温条件下的耐热性鉴定

选取三个转基因株系（T0-14-1,T10-14-2,T0-14-3）的T1代植株进行耐热性鉴定，分别与野生型（WT）一起进行42℃高温处理，之后对其叶片的相对电导率、丙二醛含量、SOD酶活性、POD酶活性、抗坏血酸含量等生理指标进行测定，丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法，SOD测定采用氮蓝四唑法，POD测定采用愈创木酚比色法，抗坏血酸含量测定采用三氯乙酸法。

结果显示，高温处理后，野生型黄瓜出现严重的热害症状，幼苗整株萎蔫，叶片焦黄，超表达株系（转基因株系）叶片耷拉，热害症状不明显，如图6c所示。黄瓜的各项生理指标测定，如图6d所示，正常环境下，超表达株系的叶片相对电导率和丙二醛含量整体低于野生型，SOD酶活性和POD酶活性整体与野生型差距不大，高温处理后，超表达株系的叶片相对电导率和丙二醛含量整体显著低于野生型，SOD酶活性和POD酶活性显著高于野生型，抗坏血酸含量两者均降低，可见CsMBF1c的超表达使得黄瓜的耐热相关的各项生理指标都有不同程度的提升。

（2）黄瓜幼苗在高温条件下的叶绿素荧光测定

选取两个转基因株系（T1-14-1、T1-14-2）进行高温条件下的叶绿素荧光测定，以野生型为对照，该实验采用了叶绿素荧光成像仪机器进行测定，其型号为：IMAGING-PAM，WALZ，Germany。高温处理（昼温42℃/12h，夜温25℃/12h）5天左右的黄瓜幼苗，在叶绿素荧光成像仪下观察测定。测定Fm’（光下最大荧光值），Fo’（光下最小荧光值），Fv’/Fm’（PSII光化学的有效量子产量），Y(II)（PSII光合系统电子传递的实际量子效率），Y(NPQ)（光保护机制相关的所有热耗散），qN（非光化学猝灭系数），NPQ（能量猝灭系数），Y(NO)（热耗散外的荧光猝灭系数），qP和qL（光化学猝灭系数），各指标反映了植物以叶绿素为基础的光合系统进行各种光化学反应的能力，它与电子传递、光合等过程直接相关。

结果显示，正常情况下，对比野生型，超表达株系光合系统对过剩光能的耗散能力更强，光能转化能力相当，高温胁迫后，超表达株系电子传递效率增强，光合能力进一步增强，起到光保护的热耗散能力更强了，如图7所示。可见CsMBF1c的超表达使得黄瓜的光合系统在高温逆境下更加稳健，有助于提升黄瓜的耐热性。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c及其在提高植物耐热性中的应用

<141> 2019-09-02

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 438

<212> DNA

<213> 黄瓜(Cucumis sativus)

<400> 1

atgccgagcc gattccccgg agccctatct caagattggg agccagtagt tctccacaag 60

gcgaagccaa aagctcaggc ccttcgtgat ccgaaggcag tgaaccaagc gatccgatcc 120

ggcgcaccgg ttcagacagt gaagaaattc gacgctggct tgaacaagaa agtcacagcg 180

gcgccagtga acgcaaggaa gctggaggaa gggaccgaac cggcagcgct ggaccgggtg 240

gcggttgagg tgagacaggc gattcagaag gctcgattgg agaagaagat gagccaagca 300

gaactggcga aacagattaa cgaacggact caggttgtgc aagaatatga aaatgggaag 360

gcggtgccga atcaagcggt tttggccaag atggagaaag ttttgggcgt gaagcttcga 420

ggaagatcgg ggaaatga 438

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaattctcaa cgacaatgcc gag 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accacgtaga tccatacatt ctt 23

<210> 4

<211> 145

<212> PRT

<213> 黄瓜(Cucumis sativus)

<400> 4

Met Pro Ser Arg Phe Pro Gly Ala Leu Ser Gln Asp Trp Glu Pro Val

1 5 10 15

Val Leu His Lys Ala Lys Pro Lys Ala Gln Ala Leu Arg Asp Pro Lys

20 25 30

Ala Val Asn Gln Ala Ile Arg Ser Gly Ala Pro Val Gln Thr Val Lys

35 40 45

Lys Phe Asp Ala Gly Leu Asn Lys Lys Val Thr Ala Ala Pro Val Asn

50 55 60

Ala Arg Lys Leu Glu Glu Gly Thr Glu Pro Ala Ala Leu Asp Arg Val

65 70 75 80

Ala Val Glu Val Arg Gln Ala Ile Gln Lys Ala Arg Leu Glu Lys Lys

85 90 95

Met Ser Gln Ala Glu Leu Ala Lys Gln Ile Asn Glu Arg Thr Gln Val

100 105 110

Val Gln Glu Tyr Glu Asn Gly Lys Ala Val Pro Asn Gln Ala Val Leu

115 120 125

Ala Lys Met Glu Lys Val Leu Gly Val Lys Leu Arg Gly Arg Ser Gly

130 135 140

Lys

145

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctagaat gccgagccga ttccccg 27

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggatcctt tccccgatct tcctcgaag 29

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccctcatgcc attctccgtt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttcggcagt ggttgtgaac 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagcgttttc tcaaattgcg a 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgactctcat ttcttccact ca 22

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgggatccat gccgagccga ttccccgg 28

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgagctctca tttccccgat cttcctc 27

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc c 31

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 30

Claims

1.一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c在提高植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c在提高植物耐热性中的应用。

3.一种黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c，其特征在于，所述基因具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。

4.一种由权利要求3所述基因编码的黄瓜多桥连蛋白，其特征在于，所述黄瓜多桥连蛋白具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为黄瓜。

6.权利要求4所述的黄瓜多桥连蛋白在提高植物抗逆性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述黄瓜多桥连蛋白在提高植物耐热性中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为黄瓜。

9.包含权利要求3所述黄瓜多桥连蛋白基因CsMBF1c的重组载体在提高植物耐热性中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物为黄瓜。