CN104845984A

CN104845984A - 苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因

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Publication number: CN104845984A
Application number: CN201510305141.9A
Authority: CN
Inventors: 刘荣梅; 高继国; 李海涛; 张金波; 张�杰; 束长龙; 赫福霞
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2035-06-05
Also published as: CN104845984B

Abstract

苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因，属于生物化学技术领域，其表达蛋白对甜菜夜蛾生物活性试验进行初筛和复筛，7d后分别调查死、活虫数，计算校正死亡率和LC₅₀；结果可知，苏云金芽胞杆菌的vip3A-1基因表达蛋白在复筛时对甜菜夜蛾半致死浓度为7.755μg/g(5.683-9.979μg/g)，当表达蛋白浓度达到81μg/g时，所有甜菜夜蛾均死亡，可见苏云金芽胞杆菌的vip3A-1基因表达蛋白对甜菜夜蛾具有高毒力，其特征在于苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。

Description

苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因

技术领域

本发明涉及一种苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因，属于生物化学技术领域。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)在《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版中归属于第二类第十八群，革兰氏阳性，芽胞杆菌属的一个种。它形成芽胞的过程中，在菌体内的一端或两端形成一个或多个形状一致或不同的伴胞晶体(parasporal crystal)。这种伴胞晶体的主要成分是具有杀虫活性的蛋白质，故又称为杀虫晶体蛋白(ICPs)或δ-内毒素(δ-endotoxin)。该杀虫晶体蛋白由cry基因和cyt基因编码，现在已经发现苏云金芽胞杆菌大多数菌株都能产生多种类型的晶体蛋白，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀虫活性(G.M.Faust等1983；D.L.Edwards等1988；F.Baroy等1998)。据估计，已分离的Bt菌株超过了5万株，Bt的杀虫范围已经扩大到包括大量农林及卫生害虫在内的无脊椎的4个门和节肢动物门中9个目的生物(郑大胜等2002)。Bt对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。近年来，人们发现Bt在营养期分泌的一类新型杀虫毒蛋白即营养期杀虫蛋白(VIPs)，它不同于Bt的杀虫晶体蛋白，是一种在Bt营养生长中期和产胞期分泌到细胞外的毒素蛋白，直至稳定前期达到最高峰(J J Estruch等1996；G.W.Warren等1998；J.J.Estruch等2000)，它一般不形成伴胞晶体。具有热不稳定性(E.Schnepf等1998)；对鳞翅目、鞘翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性，甚至是一些对Bt杀虫晶体蛋白有很强抗性的昆虫如小地老虎都有较强活性，而且对草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、烟蚜夜蛾、棉铃虫等一系列害虫都有活性(L.L.Loguercio等2002)，毒效都在纳克(ng)水平上。该蛋白的发现使得Bt杀虫剂在杀虫活性、杀虫范围方面得到很大突破，在一定程度上克服了许多害虫对Bt内毒素低敏感或不敏感的弊端。可见，VIPs是一个极为丰富而且是具有巨大潜力的资源。该领域已成为Bt研究的热点。PCR鉴定体系的建立和应用，极大地加快了Bt菌株筛选、生物活性测定、新基因的分离克隆等项研究的速度。研究表明，通过PCR和生物活性测定相结合是收集Bt中营养期杀虫蛋白活性的首选策略(L.L.Loguercio等2002)。vip基因的发现与鉴定对于研究Bt资源的多样性、预测其杀虫活性、快速筛选优良菌株、分离克隆新的vip基因有十分重要的意义。甜菜夜蛾，学名：Laphygma exigua Hubner，英文名：Beet army worm，别名：贪夜蛾。形态：幼虫体色变化很大，有绿色、暗绿色、黄褐色、黑褐色等，腹部体侧气门下线为明显的黄白色纵带，有时呈粉红色。成虫昼伏夜出，有强趋光性和弱趋化性，大龄幼虫有假死性，老熟幼虫入土吐丝化蛹。主要食物:甜菜夜蛾为害多种蔬菜，如甘蓝、花椰菜、白菜、萝卜、莴苣、番茄、青椒、茄子、马铃薯、黄瓜、西葫芦、豆类、茴香、韭菜、菠菜、芹菜、胡萝卜等。虫态：虫态有成虫、卵、幼虫、蛹，以幼虫为害植株。初孵幼虫群集叶背，吐丝结网，在叶内取食叶肉，留下表皮，成透明的小孔；3龄后可将叶片吃成孔洞或缺刻；大龄幼虫还可钻蛀青椒、番茄果实。发生规律和危害特点:初龄幼虫在叶背群集吐丝结网，食量小，3龄后，分散为害，食量大增，昼伏夜出，危害叶片成孔缺刻，严重时，可吃光叶肉，仅留叶脉，甚至剥食茎杆皮层。幼虫可成群迁飞，稍受震扰吐丝落地，有假死性。3-4龄后，白天潜于植株下部或土缝，傍晚移出取食为害。一年发生6-98代，7-8月发生多，高温、干旱年份更多，常和斜纹夜蛾混发，对叶菜类威胁甚大。甜菜夜蛾这种间隙性大发生的杂食性害虫，自上世纪90年代开始在棉区发生危害以来，近些年的发生危害呈现逐渐加重的趋势，已经扩展到甘蓝、白菜、番茄、青椒、马铃薯、芹菜等多种蔬菜及大豆等170余种植物。近年来甜菜夜蛾为害猖獗，暴发成灾，许多农民频繁用药仍防效不佳，只得每天早晚到田里捕捉，望田兴叹。比如一般棉田为害株率60％左右，严重地块达100％，一旦发生，棉农往往束手无措，直接影响到棉农种棉的经济效益，对棉花生产构成严重威胁。如何寻找到苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的基因成为急需解决的一大难题？所以，发明苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因，寻找到一个表达蛋白对甜菜夜蛾具有高毒力以应用于害虫生物防治的苏云金芽胞杆菌vip3A-1基因是必要的。

发明内容

为了克服寻找苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力基因的难题，本发明提供了一个苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因，该苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾生物活性试验进行初筛和复筛，7d后分别调查死、活虫数，计算校正死亡率和LC₅₀，结果可知，苏云金芽胞杆菌的vip3A-1基因表达蛋白在复筛时对甜菜夜蛾半致死浓度为7.755μg/g(5.683-9.979μg/g)，当表达蛋白浓度达到81μg/g时，所有甜菜夜蛾均死亡，可见vip3A-1基因表达蛋白对甜菜夜蛾具有高毒力。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因的核酸序列为Seq IDNo:1，具体构建及验证过程如下：

1.基因的PCR扩增：将提取的Bt菌基因组DNA使用vip-5/vip-3引物对进行PCR扩增，引物序列见表1。参照GenBank中公布的vip3A基因编码区的N端和C端序列同源性，设计合成一对特异性引物vip-5/vip-3，分别在5’端引入NdeI和SalI酶切位点(箭头所示)，用于扩增全长基因。

2. 2.PCR反应体系：KOD聚合酶反应体系50μL；KOD酶1μL；引物对(10mmol/L)1μL；模板1μL；10x PCR Buffer 5μL；MgSO43μL；dNTP 5μL；ddH2O补足至50μL；

3.PCR反应条件(表2)

4.DNA回收：(1)使用灭菌解剖刀切下含目的DNA片段的凝胶，置于1.5mL离心中；(2)加入3倍体积溶胶的溶胶缓冲液A，置于50℃水浴锅中10min左右；(3)待胶完全溶解后加入0.5个A溶胶缓冲液体积的B溶液；(4)混匀后转入回收柱，12000r/min离心1min；(5)去除残留液体，加入洗脱缓冲液W1500μL，12000r/min离心1min；(6)去除残留液体，洗脱缓冲液W2700μL，洗脱两次；(7)将30μL的TE溶液加入回收柱中，室温静置2min；(8)将上步回收柱12000r/min离心1min，备用。如需要可以重复7-8步骤一次。

5.连接反应：将DNA胶回收产物与pEB载体按照连接体系(目的片段DNA 4μL，载体DNA 1μL，连接试剂盒SolutionⅠ5μL)进行连接反应。充分混匀后，16℃连接4h或4℃条件下连接过夜。

6.大肠杆菌热激转化：将连接产物全量加入到100μL大肠杆菌JM109的感受态细胞中，混匀，冰浴30min以上，取出离心管42℃准确热击90s，再冰浴3min，加入900μL LB液体培养基37℃培养1h左右，取200μL于LB固体平板涂布，加入相应的抗生素，X-gal溶液40μL，IPTG溶液4μL，37℃培养过夜，进行蓝白班筛选，筛选出方向连接正确的阳性克隆，以PEB载体的正向引物pEBF和所克隆基因的反向引物进行PCR鉴定。提取阳性克隆菌株的质粒，转入大肠杆菌Rosetta菌株感受态细胞中。经PCR、酶切等鉴定后再通过序列测定，鉴定出的正确重组转化子进行诱导和表达目的蛋白。

7.大肠杆菌质粒DNA提取：(1)挑取阳性转化子于LB液体培养基中培养过夜，取1-4ml菌液于12000r/min离心1min，弃去上清；(2)加入250μL含有50mg/ml RNANase的S1溶液悬浮沉淀；(3)加入250μL细菌裂解液S2并充分缓慢温和地上下翻转4-6次，直到溶液透明清亮为止，这一步骤不应该超过5分钟；(4)加入350μL S3中和液并充分温和地上下翻转6-8次,12000r/min下离心10分钟；(5)随后吸取上清，然后转移到制备管中，在12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；(6)随后加入500μL洗涤液W1，12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；(7)随后加入700μL,W2，洗去多余盐分,12000r/min条件下离心1分钟,之后重复一次；(8)将收集柱转移到新1.5ml离心管上，收集柱中央滴加60-80μL预热至65℃的TE缓冲液或灭菌水，静止5分钟，12000r/min条件下离心1分钟，风干并保存在-20℃备用。

8.基因的诱导表达：(1)将大肠杆菌的单菌落接种于LB液体培养基37℃条件下220rpm活化12-16h；(2)采用1％接种量接种阳性表达菌株于200mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃条件下，220rpm振荡培养大约2h至OD₆₀₀＝0.6左右；之后加入1M的IPTG 200μL；放置于摇床上150rpm低速培养，16-30℃低温条件下诱导大约4-16h，株不同条件也不同；(3)将诱导的培养液在6000rpm的条件下离心5min并收集菌体，用预冷的10mmol/L Tris·Cl(pH调至8.0左右)悬浮菌体2-3次；(4)在冰水混合物中超声波破碎菌体，超3s，停3s，50ml悬浮菌液大约超声10min；(5)在4℃和12000rpm条件下离心10min分别收集上清和沉淀，沉淀组分依然用10mmol/L Tris·Cl悬浮。之后分别进行蛋白电泳检测即SDS-PAGE。

9.蛋白电泳检测：电泳：将粗蛋白样品与3x上样Buffer按2:1混匀，沸水浴处理10min，取待测样品液10L上样，电泳仪设置120V预电泳10-15min，然后进行150V恒压电泳1h。染色：电泳结束后取出蛋白凝胶，放入50mLSI溶液中，置微波炉加热30s，60rpm振荡5min；将胶取出后放入SII和SIII的混合液中(每50mL SII加200L SIII)，再微波炉加热30s后取出摇床60rpm振荡至蛋白胶条带清晰可见，凝胶成像系统成像。

10.序列测定及分析:由北京六合通公司完成序列测定，用Clone Manager、Omiga、NCBI BLAST、DNAMAN等软件分析序列，结果为Seq ID No:1；用NCBI BLAST比对结果表明vip3A-1基因序列与已有所有vip基因序列均不相同，相似性最高达99％，vip3A-1基因确定为一新基因。

11.表达蛋白对甜菜夜蛾的生物毒力活性测定:称取30g人工饲料置灭菌培养皿中，加入3mL待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发。将全部饲料分装于3个已消毒的细胞培养板中。先将幼虫轻轻抖落在一张白纸上，再将白纸倒置，此时幼虫将从白纸上开始拉丝下滑，用毛笔轻轻挑丝将幼虫接于培养板中；接完后，在培养板上盖一层吹塑纸，再盖盖子，并用橡皮筋固定，严格密封，防止幼虫逃逸。放置于光照培养箱中25℃培养，光周期为12h光照，12h黑暗。从第2天起，湿度<30％时，需要额外添加水盆增加湿度。每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气凝结。对表达蛋白进行甜菜夜蛾毒力的初筛和复筛，7d后分别调查死、活虫数，计算校正死亡率和LC₅₀。结果可知，苏云金芽胞杆菌的vip3A-1基因表达蛋白在复筛时对甜菜夜蛾半致死浓度为7.755μg/g(5.683-9.979μg/g)，当表达蛋白浓度达到81μg/g时，所有甜菜夜蛾均死亡，可见vip3A-1基因表达蛋白对甜菜夜蛾具有高毒力。

本发明的有益效果为：本发明苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因生物活性试验进行初筛和复筛，7d后分别调查死、活虫数，计算校正死亡率和LC₅₀；结果可知，苏云金芽胞杆菌的vip3A-1基因表达蛋白在复筛时对甜菜夜蛾半致死浓度为7.755μg/g(5.683-9.979μg/g)，当表达蛋白浓度达到81μg/g时，所有甜菜夜蛾均死亡，可见vip3A-1基因表达蛋白对甜菜夜蛾具有高毒力；用NCBI BLAST比对结果表明vip3A-1基因序列与已有所有vip基因序列均不相同，相似性最高达99％，vip3A-1基因确定为一新基因。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因的核酸序列(Seq IDNo:1)。

图2为苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因的PCR扩增结果图。

图3为苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因的全长基因在大肠杆菌的蛋白表达结果图。

图4为苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因的序列比对结果图。

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例一

1.基因的PCR扩增：

将提取的Bt菌基因组DNA使用vip-5/vip-3引物对进行PCR扩增，引物序列见表1。参照GenBank中公布的vip3A基因编码区的N端和C端序列同源性，设计合成一对特异性引物vip-5/vip-3，分别在5’端引入NdeI和SalI酶切位点(箭头所示)，用于扩增全长基因。

表1：引物序列

2.PCR反应体系

3.PCR反应条件

表2：PCR反应条件

4.DNA回收

(1)使用灭菌解剖刀切下含目的DNA片段的凝胶，置于1.5mL离心中；

(2)加入3倍体积溶胶的溶胶缓冲液A，置于50℃水浴锅中10min左右；

(3)待胶完全溶解后加入0.5个A溶胶缓冲液体积的B溶液；

(4)混匀后转入回收柱，12000r/min离心1min；

(5)去除残留液体，加入洗脱缓冲液W1500μL，12000r/min离心1min；

(6)去除残留液体，洗脱缓冲液W2700μL，洗脱两次；

(7)将30μL的TE溶液加入回收柱中，室温静置2min；

(8)将上步回收柱12000r/min离心1min，备用。如需要可以重复7-8步骤一次。

5.连接反应

将DNA胶回收产物与pEB载体按照以下连接体系进行连接反应。充分混匀后，16℃连接4h或4℃条件下连接过夜。

目的片段DNA 4μL

载体DNA 1μL

连接试剂盒Solution Ⅰ5μL

6.大肠杆菌热激转化

将连接产物全量加入到100μL大肠杆菌JM109的感受态细胞中，混匀，冰浴30min以上，取出离心管42℃准确热击90s，再冰浴3min，加入900μL LB液体培养基37℃培养1h左右，取200μL于LB固体平板涂布，加入相应的抗生素，X-gal溶液40μL，IPTG溶液4μL，37℃培养过夜，进行蓝白班筛选，筛选出方向连接正确的阳性克隆，以PEB载体的正向引物pEBF和所克隆基因的反向引物进行PCR鉴定。提取阳性克隆菌株的质粒，转入大肠杆菌Rosetta菌株感受态细胞中。经PCR、酶切等鉴定后再通过序列测定，鉴定出的正确重组转化子进行诱导和表达目的蛋白。

7.大肠杆菌质粒DNA提取

(1)挑取阳性转化子于LB液体培养基中培养过夜，取1-4ml菌液于12000r/min离心1min，弃去上清；

(2)加入250μL含有50mg/ml RNANase的S1溶液悬浮沉淀；

(3)加入250μL细菌裂解液S2并充分缓慢温和地上下翻转4-6次，直到溶液透明清亮为止，这一步骤不应该超过5分钟；

(4)加入350μL S3中和液并充分温和地上下翻转6-8次,12000r/min下离心10分钟；

(5)随后吸取上清，然后转移到制备管中，在12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；

(6)随后加入500μL洗涤液W1，12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；

(7)随后加入700μL，W2，洗去多余盐分,12000r/min条件下离心1分钟,之后重复一次；

(8)将收集柱转移到新1.5ml离心管上，收集柱中央滴加60-80μL预热至65℃的TE缓冲液或灭菌水，静止5分钟，12000r/min条件下离心1分钟，风干并保存在-20℃备用。

8.基因的诱导表达

(1)将大肠杆菌的单菌落接种于LB液体培养基37℃条件下220rpm活化12-16h；

(2)采用1％接种量接种阳性表达菌株于200mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃条件下，220rpm振荡培养大约2h至OD₆₀₀＝0.6左右；之后加入1M的IPTG 200μL；放置于摇床上150rpm低速培养，16-30℃低温条件下诱导大约4-16h，株不同条件也不同；

(3)将诱导的培养液在6000rpm的条件下离心5min并收集菌体，用预冷的10mmol/LTris·Cl(pH调至8.0左右)悬浮菌体2-3次；

(4)在冰水混合物中超声波破碎菌体，超3s，停3s，50ml悬浮菌液大约超声10min；

(5)在4℃和12000rpm条件下离心10min分别收集上清和沉淀，沉淀组分依然用10mmol/L Tris·Cl悬浮。之后分别进行蛋白电泳检测即SDS-PAGE。

9.蛋白电泳检测

电泳：将粗蛋白样品与3x上样Buffer按2:1混匀，沸水浴处理10min，取待测样品液10L上样，电泳仪设置120V预电泳10-15min，然后进行150V恒压电泳1h。

染色：电泳结束后取出蛋白凝胶，放入50mL SI溶液中，置微波炉加热30s，60rpm振荡5min；将胶取出后放入SII和SIII的混合液中(每50mL SII加200L SIII)，再微波炉加热30s后取出摇床60rpm振荡至蛋白胶条带清晰可见，凝胶成像系统成像。

表3 SDS聚丙烯酰氨凝胶制备表

10.序列测定及分析

由北京六合通公司完成序列测定，用Clone Manager、Omiga、NCBI BLAST、DNAMAN等软件分析序列，结果为Seq ID No:1(图1)，用NCBI BLAST比对结果表明vip3A-1基因序列与已有所有vip基因序列均不相同，相似性最高达99％，vip3A-1基因确定为一新基因。

11.表达蛋白对甜菜夜蛾的生物毒力活性测定

称取30g人工饲料置灭菌培养皿中，加入3mL待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发。将全部饲料分装于3个已消毒的细胞培养板中。先将幼虫轻轻抖落在一张白纸上，再将白纸倒置，此时幼虫将从白纸上开始拉丝下滑，用毛笔轻轻挑丝将幼虫接于培养板中；接完后，在培养板上盖一层吹塑纸，再盖盖子，并用橡皮筋固定，严格密封，防止幼虫逃逸。放置于光照培养箱中25℃培养，光周期为12h光照，12h黑暗。从第2天起，湿度<30％时，需要额外添加水盆增加湿度。每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气凝结。表达蛋白对甜菜夜蛾生物活性试验进行初筛(表4)和复筛(表5)，7d后分别调查死、活虫数，计算校正死亡率和LC₅₀；计算校正死亡率和LC₅₀。

表4表达蛋白对甜菜夜蛾毒力的初筛

表5表达蛋白对甜菜夜蛾毒力的复筛

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

Claims

1.苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因，其表达蛋白对甜菜夜蛾生物活性试验进行初筛和复筛，7d后分别调查死、活虫数，计算校正死亡率和LC₅₀，结果可知苏云金芽胞杆菌的vip3A-1基因表达蛋白在复筛时对甜菜夜蛾半致死浓度为7.755μg/g(5.683-9.979μg/g)，当表达蛋白浓度达到81μg/g时，所有甜菜夜蛾均死亡，可见苏云金芽胞杆菌的vip3A-1表达蛋白对甜菜夜蛾具有高毒力；用NCBI BLAST比对结果表明vip3A-1基因序列与已有所有vip基因序列均不相同，相似性为99％，vip3A-1基因确定为一新基因，其特征在于苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。