CN116004694A - 一种高稳定性的重组sod酶融合多肽及其表达纯化方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽及其表达纯化方法和应用，涉及基因工程技术领域；步骤包括：S1，在重组SOD酶融合多肽中接入几丁质结合域，并在所述几丁质结合域的C端加入HRV 3C蛋白酶，得到改性多肽，设计对应的cDNA序列；S2，将所述cDNA序列接入载体质粒中，得到重组质粒；S3，将所述重组质粒电转入感受态表达菌株中培养并诱导表达，通过几丁质树脂纯化，洗脱，得到高稳定性的重组SOD酶融合多肽。本发明的一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，采用耐热性强的SOD突变体和活性肽融合表达，以SOD突变体作为伴体使活性肽具有耐高温和延缓降解的性能，提高稳定性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽及其表达纯化方法和应用。
背景技术
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)可用于催化超氧阴离子与氢反应，产生氧气和过氧化氢，是一种重要抗氧化剂，在保护细胞免受氧自由基的毒性方面发挥着关键作用。SOD常以铜和锌、或锰、铁、或镍作为辅助因子的形式存在；几乎所有真核细胞的细胞内都含有带有铜和锌的超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD，SOD1)；几乎所有的线粒体和许多细菌(如大肠杆菌)均含有结合锰的超氧化物歧化酶(Mn-SOD，SOD2)，研究表明，SOD2可用来清除对皮肤造成损害的自由基，减少肌成纤维细胞的表型逆转来减少纤维化。
活性因子，包含三对二硫键(Cys6-Cys20,Cys14-Cys31,Cys33-Cys42)，二硫键形成产生三个结构环，通过与其受体结合，刺激细胞生长、增殖和分化。根据Hang-Cheol Shin等人对活性因子定点突变研究，把L8S，I38C，D46C突变增加活性因子其自身热稳定性，与野生型活性因子相比圆二色(CD)相变温度Tm值从76℃提高到约87℃，可能与其增加了一二硫键有关，该突变体60℃处理5天，80％以上的突变体分子维持结构稳定(CD分析)。但增加二硫键会增加EGF分子合成中正确折叠，形成活性高级结构的难度，在用大肠杆菌等表达过程中可能会引入包涵体。根据Mount C D及Song Yub Shin等人研究，活性因子的N端2-6位氨基酸或C端48-53位氨基酸删去对其与受体亲和力及促细胞生长活性无显著影响，在小鼠和人的尿液中也存在2-53,1-52，1-51.1-50氨基酸等结构。
无论是SOD还是活性因子，稳定性对其活性和应用都至关重要，故有必要研究其突变位点以期提高多肽的稳定性，同时在多肽表达纯化的过程中，酶与纯化材料之间缺乏特异性，需要对酶进行预处理，预处理不仅会造成酶的损失，减低产率，而且会对其活性造成影响。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特异性强，纯化效率高，得到的融合多肽的稳定性强，活性高。
本发明的目的之二在于提供一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽，具有稳定性高，耐热性强，不易降解的特点。
本发明的目的之三在于提供一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽在制备化妆品或功能性食品中的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，包括以下步骤：
S1，在氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重组SOD酶融合多肽中接入几丁质结合域，并在所述几丁质结合域的C端加入HRV 3C蛋白酶，得到改性多肽，设计对应的cDNA序列；
S2，将所述cDNA序列接入载体质粒中，得到重组质粒；
S3，将所述重组质粒电转入感受态表达菌株中培养并诱导表达，通过几丁质树脂纯化，洗脱，得到高稳定性的重组SOD酶融合多肽。
进一步地，所述重组SOD酶融合多肽包括SOD突变体和活性肽，SOD突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，所述SOD突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的SOD酶定点突变而成，所述定点突变包括：将所述SOD酶的第9位的天冬酰胺突变成丝氨酸，第15位的天冬酰胺突变成赖氨酸，第41位的脯氨酸突变成亮氨酸。
进一步地，所述重组SOD酶融合多肽的N端修饰有功能肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
进一步地，步骤S1中，所述改性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步地，步骤S1中，所述cDNA序列包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
进一步地，步骤S3中，表达菌株为短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酵母菌中的任一种。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽，由所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法所得。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的应用，所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽在制备化妆品或功能性食品中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明的一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，采用耐热性强的SOD突变体和活性肽融合表达，以SOD突变体作为伴体使活性肽具有耐高温和延缓降解的性能，提高稳定性；同时利用几丁质结合域，提高特异性强，纯化效率高，几丁质结合域的C端加入HRV 3C蛋白酶，以便于纯化后切除几丁质结合域纯化标签部分，得到的融合多肽的稳定性强，活性高，具有抗氧化、促愈合、抗衰老功效。
本发明的一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽，具有稳定性高，耐热性强，不易降解的特点。
本发明的一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽应用，其抗氧化、抗衰老性能优异，在制备化妆品或功能性食品中具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明的实施例5中CBD-PmPeSOD融合多肽的表达纯化分析图；图1A中，M:蛋白质分子量标准(上海碧云天生物技术有限公司，P0075)；泳道1-9：依次是12h、24h、36h、48h、60h、3天、4天、5天、6天处理后的SDS-PAGE凝胶电泳图；图1B中，泳道b1：含1M NaCl的TE洗脱液；泳道b2：40％硫酸铵沉淀后上清穿流液；泳道b3：含50mM NaCl的TE洗脱液；泳道b4：含50mM NaCl的TE洗脱后继续用纯水洗脱；图1C中，Cb1-Cb4与图1B中泳道b1-b4的对应。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
在NCBI数据库中搜索SOD相关基因组测序，clastalX的对比结果显示：XP_011023491.1和XP_011023492.1多肽序列完全相同，来源于同一基因座(LOC105124956)；XP_011032547.1和XP_011032548.1多肽序列也完全相同，来自于同一基因座(LOC105131320)；而XP_011034389.1和XP_011021470.1两条[CuZn]SOD2-like与其他两条序列并不属于一类，差异较大。通过对比分析，挑选假定的PeSOD2转录变异体1(XP_011032547.1)的多肽序列为蓝本(命名为PeSOD2-1)，以其为模板，氨基酸如SEQ ID NO:1所示，研究SOD高级结构和保守残基及其他植物耐热[CuZn]SOD序列，对其进行定点突变(N9S,N15K,P41L)；所述定点突变具体为：将所述超氧化物歧化酶的第9位的天冬酰胺(Asn)突变成丝氨酸(Ser)，第15位的天冬酰胺(Asn)突变成赖氨酸(Lys)，第41位的脯氨酸(Pro)突变成亮氨酸(Leu)，命名为mPeSOD2-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
用SOPMA分析显示mPeSOD2-1含有3.95％α螺旋(h)，32.89％的β片层(extendedstrand,e)，6.58％的β-turn(t)，56.58％随机卷曲(c)。
实施例2
将活性因子进行定点突变，得到高稳定性的活性肽(2-52，L8S，I38C，D46C)，
将实施例1的胡杨[CuZn]SOD突变体mPeSOD2-1与活性肽连接，同时在杨[CuZn]SOD突变体mPeSOD2-1与活性肽之间引入Xa因子识别位点(序列IEGR)，得到包含SOD突变体和活性肽的融合多肽，命名为SE多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例3
将实施例2的SE多肽的N端去掉3个氨基酸后连接PTD4功能肽，得到PTD4修饰的SE多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本实施例SE多肽加入功能肽PTD4，其渗透能力增强，容易被吸收。
实施例4
在实施例3的PTD4-SE多肽中接入几丁质结合域(CBD，序列源自NEB IMPACTVector)，并在所述几丁质结合域的C端加入HRV 3C蛋白酶识别序列，从而得到改性多肽，记为CBD-SE多肽，简称CSE，其序列如SEQ ID NO:5所示。
实施例5
取实施例4的CBD-SE多肽，按照短小芽孢杆菌HPD31-sp3(takara，HB116)优化密码子及mRNA高级结构后人工合成cDNA序列，核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示，然后BamHI和HindIII双酶切连入pNY326(takara，HB111)中，构建pNY326-PSE重组质粒。
制备电转感受态的短小芽孢杆菌HPD31-sp3：挑划线单菌落于T2M培养基中(1％多聚蛋白胨,0.5％牛肉浸膏,0.2％酵母提取物,1％葡萄糖,0.001％MnSO4·5H2O,0.001％FeSO4·7H2O,and 0.0001％ZnSO4·7H2O,pH 7.0)30℃，250rpm摇床培养过夜，取过夜菌液按1:100接种至50ml T2M培养基中，30℃，250rpm培养至OD600＝2.0。全部菌液冰水浴10min，然后7000rpm，5min，4℃收集菌体。用40ml预冷SHC溶液(10％蔗糖,16mM HEPES,1mM CaCl2,and15％甘油,pH 7.0)，4℃×7000rpm×8min，洗涤菌体1次。菌体用1-10ml PM溶液(含15％PEG 6000和0.1％ssDNA的1mM HEPS，pH＝7.0)洗涤，加1ml PM重悬，分装100μl/管，-80冻存。取一支HPD-sp3感受态加3μl重组质粒(～200ng)/100μl感受态，混均移入预冷2mm电转杯中，冰浴5min；1500V,25uF,1000Ω电击一次，立即加1ml T2MM(含20mM MgCl2的T2M)混合，30℃静置3h，涂在含新霉素(50μg/ml)T2平板上；倒扣30℃培养过夜。
挑取单克隆，接入1ml含50μg/ml新霉素T2M培养基中，放30℃摇床250rpm摇至OD600＝0.8，按1:100接入15ml 2SY培养基(40.0g/L蛋白胨，20.0g/L葡萄糖，5.0g/L酵母提取物，0.2g/L CaCl2·2H2O，pH＝7.2)中(含50μg/ml新霉素)，置于30℃，250rpm摇床中培养表达，分别在12h、24h、36h、48h、60h、3天、4天、5天和第6天各收菌500μl(60h时补加2％葡萄糖)。
发酵菌液在室温12000rpm离心2min，取上清40μl加入10ul 5×SDS-PAGE上样缓冲液，混均，100℃加热5min，置冰上，10000rpm离心2min，各取20μl上清上样用SDS-PAGE凝胶电泳分析表达情况(图1A)。
参照图1A，随培养时间延长，目的蛋白分泌的水平逐渐增加，尤其是在60h补加葡萄糖后，有较明显的目的蛋白分泌表达。
取发酵4天的上清首先用40％的硫酸铵沉淀以除去HPD-sp3芽孢杆菌细胞壁蛋白(HWP)，离心上清再用几丁质树脂(NEB，S6651)纯化，然后分别按照以下方式进行洗脱：含1MNaCl的TE(Tris-EDTA)洗脱液(pH＝8.0)进行洗脱；含50mM NaCl TE洗脱液(pH＝8.0)进行洗脱；含50mM NaCl TE洗脱液(pH＝8.0)洗脱后，再用纯水进一步洗脱用SDS-PAGE分析纯化(图1B)。
参照图1B，用40％硫酸铵可去除较大分子量的HWP，用1M NaCl的TE洗脱液溶液可以较好的洗涤杂带，采用50mM NaCl可很好的把目的蛋白CSE洗脱下来。
参照图1C，利用Western blot对图1B的各泳道进行鉴定，确定目的蛋白为CBD-SE多肽。
性能测试
1、抗氧化生物活性测试
取实施例5的表达CBD-SE多肽的短小芽孢杆菌，按1:100接种2SY培养基中(含50μg/ml新霉素)，置于30℃◇250rpm摇床中培养表达，分别在12h、24h、36h、48h、60h、3天、4天、5天和第6天各收菌500μl(60h时补加2％葡萄糖)离心取上清稀释后测活性，活性分析按照国标GB/T 5009.171-2003中所述第一法(邻苯三酚法)进行，具体参照国标。
结果测得上清中SOD活性很低，比如第5天的发酵上清中PSE多肽约11U/ml，原因可能是短小芽孢杆菌中缺少铜运输蛋白(CCS)或者2SY培养基中缺少Cu离子，导致表达的PSE中的PeSOD(属于[CuZn]SOD)肽几乎没有络合Cu离子，而Cu离子是[CuZn]SOD催化活性所必须的。当取第5天的发酵上清液，加入不同浓度的CuSO4和ZnSO4溶液，60℃孵育30min置冰上，分别测活性，其中1.8mM的CuSO4和0.4mM的ZnSO4有较好的活性，用1.8mMCuSO4和1.2mM的ZnSO4共同处理CSE后，其活性增加约37倍(410U/ml)。
2、耐热性测试
取Cu2+和Zn2+离子重构后的CBD-SE多肽母液，在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃处理1h后放冰上，12000rpm离心2min，检测各离心上清溶液中SOD和EGF活性。SOD的活性分析按照国标GB/T 5009.171-2003中所述第一法(邻苯三酚法)进行。
EGF促生长增殖活性用NIH3T3细胞分析，NIH3T3细胞用含10％新生牛血清的DMEM培养至密度80％时接入96孔板中，每孔4000个细胞，37℃，5％CO2培养过夜，换入200ul新鲜5％新生牛血清培养基，分别加60℃、70℃、80℃、90℃、100℃处理1h的CSE各2ul，每个温度处理样本做4个平行孔，处理24h后，各孔培养基换成100ul 1◇PBS，每孔加10ul MTT溶液(5mg/ml用PBS配)，继续孵育4h，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。在酶联免疫监测仪上测定各孔OD490(参考波长570nm)值，结果如表1所示。
表1 温度对抗氧化和细胞增殖活性的影响
如表1所示，90℃以内孵育1小时对SE多肽自身的抗氧化和促细胞增殖活性无显著影响。但90℃和100℃处理1h后对抗氧化和细胞生长增殖作用具有显著影响，尤其是100℃处理1h，其几乎失去抗氧化和促NIH3T3细胞增值效果，与室温对照无显著差异。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，在氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重组SOD酶融合多肽中接入几丁质结合域，并在所述几丁质结合域的C端加入HRV 3C蛋白酶，得到改性多肽，设计对应的cDNA序列；
S2，将所述cDNA序列接入载体质粒中，得到重组质粒；
S3，将所述重组质粒电转入感受态表达菌株中培养并诱导表达，通过几丁质树脂纯化，洗脱，得到高稳定性的重组SOD酶融合多肽。
2.如权利要求1所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于：所述重组SOD酶融合多肽包括SOD突变体和活性肽，SOD突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求2所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于：所述SOD突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的SOD酶定点突变而成，所述定点突变包括：将所述SOD酶的第9位的天冬酰胺突变成丝氨酸，第15位的天冬酰胺突变成赖氨酸，第41位的脯氨酸突变成亮氨酸。
4.如权利要求1所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于：所述重组SOD酶融合多肽的N端修饰有功能肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.如权利要求1所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于：步骤S1中，所述改性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
6.如权利要求1所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于：步骤S1中，所述cDNA序列包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法，其特征在于：步骤S3中，表达菌株为短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酵母菌中的任一种。
8.一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽，其特征在于：由权利要求1-7任一项所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽的表达纯化方法所得。
9.一种高稳定性的重组SOD酶融合多肽的应用，其特征在于：权利要求8所述的高稳定性的重组SOD酶融合多肽在制备化妆品、功能性食品或医疗产品中的应用。
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Citations (3)
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| CN106795520A (zh) * | 2015-06-08 | 2017-05-31 | 江南大学 | 一种催化活性和比酶活提高的脯氨酰内肽酶突变体 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN106795520A (zh) * | 2015-06-08 | 2017-05-31 | 江南大学 | 一种催化活性和比酶活提高的脯氨酰内肽酶突变体 |
| CN115161339A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-10-11 | 华中农业大学 | 一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 黎庶, 饶贤才, 胡金川, 金晓琳, 朱军民, 陈志瑾, 胡福泉: "肽抗生素hPAB-β基因串联体的构建及原核细胞表达初探", 医学研究生学报, no. 12 * |
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