CN102115756B - 一种与水稻抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与水稻抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白编码序列，包括：编码具有水稻OsRINGzf1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQIDNO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQIDNO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列杂交。本发明的水稻基因在植物抗旱方面具有明显的作用，具有很大的应用价值，能够明显减少农作物在干旱半干旱、条件下生物产量的损失。

Description

一种与水稻抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白编码序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白编码序列，具体地说，涉及一种与水稻抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白编码序列，属于基因工程领域。 

背景技术

水稻是农业生产中用水最多的作物，其节水抗旱性对我国的粮食、水和生态安全具有重要意义。利用基因工程这一分子育种技术，将抗旱基因转入当前广泛应用的优良水稻品种中，从而改良其抗旱性，培育即抗旱又高产优质的农作物新品种是抗旱育种的有效途径之一。 

发掘抗旱基因是抗旱分子育种的基础。已发表的抗旱相关基因及其蛋白的研究越来越多。E3连接酶是参与泛素蛋白酶体途径降解蛋白质的主要成员之一，主要参与细胞周期调控、信号转导、细胞凋亡等过程，调控植物的生长发育。 

近年来，在拟南芥中发现E3参与了逆境下的激素（ABA，烯，JA，SA等）信号传导，调节植株的抗逆性。E3是一个大家族，可以分为单亚基E3和多亚基E3两类，主要包含HECT，RING，U-BOX和PHD四种结构域。 

单亚基RING（Really Interesting New Gene）E3是一类含有RING-finger结构域的蛋白。RING finger结构域是70个氨基酸中的8个氨基酸（胱氨酸和组氨酸）与锌离子螯合作用形成C₃H₂C₃（RING-H2）或C₃H₁C₄（RING-HC）构型。E3的多样性保证了靶蛋白识别的专一性。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种与水稻抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白编码序列、其核酸序列、含该蛋白编码序列的载体及其宿主细胞。 

本发明的另一目的是提供含有水稻OsRINGzf1蛋白编码序列在利用转基因技术改良植物抗旱中的应用。 

为了实现本发明目的，本发明提供了一种与水稻抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白编码序列，包括：编码具有水稻OsRINGzf1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而 且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列杂交。 

较佳地，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。 

更佳地，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列。 

本发明提供一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有水稻OsRINGzf1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列杂交。 

本发明还提供了一种分离出的包含C₃H₂C₃型RING区域的E3连接酶相关蛋白质多肽OsRINGzf1，它包括：具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽。 

较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽，该多肽能够在盐、旱、活性氧以及茉莉酸甲酯处理下均能发挥作用。 

本发明还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。 

一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。 

本发明还提供了一种用上述DNA分子转化的宿主细胞，是真核细胞。 

本发明在实例中所述宿主细胞是水稻。 

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。 

在本发明中，术语“水稻抗旱蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有水稻OsRINGzf1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第227-790位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的编码框第227-790位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.6中第227-790位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.6所述的序列。 

该术语还包括能在中度严紧条件（70-85%一致性）下，更佳的在高度严紧条 件（85%上一致性）下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。 

该术语还包括能编码具有与天然的水稻OsRINGzf1相同功能的蛋白的SEQ IDNO.6中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个）核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个（通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内）核苷酸。 

在本发明中，术语“水稻抗旱蛋白或多肽”指具有水稻OsRINGzf1蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。该术语还包括具有与天然水稻OsRINGzf1相关相同功能的、SEQ ID NO.7序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻OsRINGzf1蛋白的活性片段和活性衍生物。 

本发明的水稻OsRINGzf1多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与水稻OsRINGzf1相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用水稻OsRINGzf1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。 

在本发明中，“水稻OsRINGzf1保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。 

表1 

最初的残基

代表性的取代

优选的取代

[0027] 

Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
			Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
			Asp(D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser	Ser
			Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro;Ala	Ala
His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
			Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
			Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
			Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
			Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

本发明还包括水稻OsRINGzf1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然水稻OsRINGzf1相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如 乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。 

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的水稻OsRINGzf1多肽时，可以将水稻OsRINGzf1编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成水稻OsRINGzf1蛋白表达载体。 

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽（分泌前导序列）DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。 

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。 

还可用Northern印迹法技术分析水稻OsRINGzf1基因产物的表达，即分析水稻OsRINGzf1的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。 

此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有水稻OsRINGzf1核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码水稻OsRINGzf1相关的核酸分子。 

此外，根据本发明的水稻OsRINGzf1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选水稻OsRINGzf1相关同源基因或同源蛋白。 

为了得到与水稻OsRINGzf1相关基因相关的水稻cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选水稻cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对水稻OsRINGzf1相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自水稻的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech, Stratagene，Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与水稻OsRINGzf1相关相关的基因家族的核苷酸序列。 

本发明的水稻OsRINGzf1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。 

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产（Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,San Francisco;Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154）。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪（Foster City，CA）来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。 

利用本发明的水稻OsRINGzf1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与水稻OsRINGzf1相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。 

本发明在抗旱性具有明显的作用，能够明显降低在干旱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。干旱能够造成大部分农作物如水稻、棉花、甘蓝型油菜和小麦等生长缓慢甚至死亡，从而使其明显减产甚至颗粒无收。我国存在大面积的干旱半干旱地区，及世界范围内也存在干旱半干旱地区，因此，本发明具有很大的应用价值。 

具体实施方式

下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。 

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1 

水稻基因OsRINGzf1在水稻品种IRAT109中表达谱分析 

1.胁迫处理 

（1）旱处理：IRAT109种子催芽后，移栽到土中培养，在苗期（4叶一新）、分蘖盛期（6叶一新）、孕穗期（减数分裂时期）进行旱处理。在各个时期，当盆中土层无水时开始断水，同时作为旱处理的开始，在旱处理时期的每天同一时间剪取植株叶片，投入液氮中冷冻用于RNA提取。 

（2）苗期激素与化学试剂处理：IRAT109种子催芽后，在发芽盒内水培生长。三叶期后施加营养液（国际水稻所标准营养液），至幼苗长至30天开始处理。分别以ABA（50uM，150uM）、JA（50uM，150uM）、SA（0.5mM，1.5mM）、H₂O₂（100mM，200mM）、NaCl（100mM，250mM，500mM）、甘露醇（Mannitol）（100mM，250mM，500mM）处理，每一处理设1h和2h两个时间梯度。同时设有水对照。处理结束后，快速吸干根表面水分并分别剪取叶片和根，投入液氮冷冻后-80℃保存用于RNA提取。 

2．RNA的提取：取部分组织，在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有TRIzol试剂（天根生化科技有限公司）的1.5mL EP管，充分振荡后，室温放置5分钟，于4℃，12000r/min离心15min后，上清液移至新的1.5mL EP管中，氯仿去蛋白后，等体积异丙醇沉淀RNA，溶解后用Dnase消化降解残留DNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。 

3.定量PCR分析 

定量PCR体系与方法：PCR反应使用美国ABI 

7000定量PCR仪，使用Takara公司的定量PCR试剂盒。每一个PCR反应重复三次。反应体系包含SYBR Premix Ex Taq^TM（2×）12.5μl，正反向引物各0.5μl，各种处理的cDNA模板1μl，加水补足体积至20μl。反应条件如下：95℃10s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，设定在每个循环中60℃1s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他具体操作详见仪器使用说明书。 

目的基因与参照基因的扩增效率：任取一样品分别稀释10×、100×、1000 ×、10000×，取1×～10000×各样品1ul进行定量PCR，方法同上，重复三次，计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，通过cDNA浓度梯度的log值对△CT值作图，根据直线斜率绝对值判断扩增效率（Kenneth等，2001）。 

结果分析方法：每种处理样品重复三次，取平均CT值，利用2-^ΔΔCT法进行结果分析。 

定量RT-PCR结果显示，在不同发育时期的干旱胁迫处理样品中，OsRINGzf基因的表达量均随处理时间的延长而增加，在复水之后，OsRINGzf基因的表达迅速下降并恢复到处理前的水平。在各种激素、盐和渗透胁迫处理的样品中，OsRINGzf1基因在根、叶中都表达。ABA、SA、JA、NaCl、Mannitol和H₂O₂处理提高了OsRINGzf1基因在水稻叶片中的表达。OsRINGzf1基因在根中对各种处理的响应表达情况不一，JA不影响OsRINGzf1基因在根中的表达，而ABA、H₂O₂处理都会抑制OsRINGzf1的表达。SA处理可促进OsRINGzf1基因在根中的表达，其促进作用随浓度升高与处理时间延长而加强。NaCl和Mannitol对OsRINGzfd在根中的表达表现为先抑制再提高。 

实施例2 

水稻OsRINGzf1基因的克隆 

1．幼苗培育 

水稻（品种为“IRAT109”）为上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存，将水稻置于35℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。 

2．RNA的分离：按照实施例1中的方法提取RNA。 

3．基因的全长克隆 

根据水稻EST数据库信息中提供的序列信息，设计引物，采用RACE方法(Clontech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行： 

(1)RT-PCR 

PCR[Pf1(SEQ ID NO.1)+Pr1(SEQ ID NO.2)]得到片段F1（531bp），回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析，知其与水稻注释基因 LOC_Os04g48900及抗旱EST CA759752有较好的匹配度。同时其编码蛋白与已知十字花科植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的At1g12760和At4g11680基因的同源性达到75%，这两个基因已经实验证明具有E3连接酶活性。通过查询Gramene网站，发现OsRINGzf1基因位于抗旱QTL区间内。 

其中，SEQ ID NO.1的信息 

(i)序列特征： 

(A)长度：25bp 

(B)类型：核苷酸 

(C)链性：单链 

(D)拓扑结构：线性 

(ii).分子类型：寡核苷酸 

(iii).序列描述：SEQ ID NO.1 

TGGCACCAATCAACCTACTGAGAAA 

(2)SEQ ID NO.2的信息 

(i)序列特征： 

(A)长度：22bp 

(B)类型：核苷酸 

(C)链性：单链 

(D)拓扑结构：线性 

(ii).分子类型：寡核苷酸 

(iii).序列描述：SEQ ID NO.2 

CCGATAACCAAGGCAGGAGCAT' 

（2）3'-RACE 

PCR[UPM+Pf1(5’-TGGCACCAATCAACCTACTGAGAAA-3’)]获得OsRINGzf13’(770bp),回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye,Perkin-Elmer,USA）的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析，知其编码蛋白与知其与水稻注释基因LOC_Os04g48900的氨基酸序列同源性达到98%，与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的At1g12760和At4g11680基因的氨基酸序列同源 性达到75%，拟南芥的这两个基因已经实验证明具为E3连接酶活性。 

(3)5'-RACE 

第一轮PCR[UPM+Pr1(5’-CCGATAACCAAGGCAGGAGCAT-3’)] 

第二轮PCR[NUP+Pr2(5’-GTGAAGTTGAAATGGATCGGTGTTCTCG-3’)得到OsRINGzf15'（约860bp）（过程同(1)） 

将测序结果的重叠区拼接，后经BLAST分析，结果证明从水稻中新得到的基因与水稻注释基因LOC_Os04g48900有较好的相似性，与拟南芥At1g12760及At4g11680基因氨基酸序列相同性达75%。 

通过组合使用上述3种方法，获得了水稻OsRINGzf1蛋白的全长编码序列（SEQID NO.6）。 

实施例3 

水稻OsRINGzf1基因的序列信息与同源性分析 

本发明新的水稻OsRINGzf1全长cDNA的长度为1196bp，详细序列见SEQ IDNO.6，其中开放读框位于227-790位核苷酸（564个核苷酸）。根据全长cDNA推导出水稻OsRINGzf1的氨基酸序列，共187个氨基酸残基，分子量为20849.09道尔顿，等电点（pI）为4.57。详细序列见SEQ ID NO.7。 

将水稻OsRINGzf1的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现OsRINGzf1基因在核苷酸水平上没有已知的同源基因，与水稻注释基因LOC_Os04g48900有较好的匹配度。OsRINGzf1基因在核酸水平和氨基酸水平上与LOC_Os04g48900基因相比，缺少了5’端/N端的部分序列。OsRINGzf1基因与LOC_Os04g48900基因相匹配的序列在核酸水平和氨基酸水平上均有98%的相同性（表2，表3）。同时，OsRINGzf1基因在氨基酸水平上与拟南芥基因At1g12760及At4g11680有75%的相同性（表4）。At1g12760及At4g11680为同一类型的E3连接酶，其E3活性已为实验证明。OsRINGzf1基因与At1g12760及At4g11680具有相同的C3H2C3型RING结构域（表4）。水稻OsRINGzf1基因对应的ESTCA759752与水稻抗旱相关。OsRINGzf1基因位于水稻抗旱QTL区间内，同时实施例上表明在OsRINGzf1基因在干旱条件下明显增强表达，因此，可以认为水稻 OsRINGzf1基因与水稻抗旱相关。 

表2 

Quey:水稻OsRINGzf1的核酸序列 

Sbjct:水稻注释基因Os04g0568900的核酸序列(NM_001060128.1) 

表2为本发明的水稻OsRINGzf1蛋白与水稻注释基因Os04g0568900的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。 

表3 

Quey:水稻OsRINGzf1的氨基酸序列 

Sbjct:水稻注释基因Os04g0568900的氨基酸序列(NP_001053593.1) 

表3为本发明的水稻OsRINGzf1蛋白与水稻注释基因Os04g0568900的氨基酸序列同源比较。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。 

表4 

1:水稻OsRINGzf1的氨基酸序列 

2:水稻注释基因LOC_Os04g48900的氨基酸序列 

3:拟南芥At1g12760的氨基酸序列 

4:拟南芥At4g11680的氨基酸序列 

表4为本发明的水稻OsRINGzf1蛋白与水稻注释基因Os04g0568900，拟南芥基因At1g12760，At4g11680的氨基酸序列同源比较。其中黑色阴影部分为C₃H₂C₃型RING结构域的保守位点。 

实施例4 

水稻基因OsRINGzf1蛋白或多肽在水稻中进行真核细胞表达及转基因植株的抗旱性鉴定 

1．含目的基因（水稻基因OsRINGzf1基因）的表达载体的构建： 

根据水稻基因OsRINGzf1的全长序列(SEQ ID NO.6)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定），以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将水稻基因OsRINGzf1基因cDNA克隆至中间载体（如pBI121），进一步克隆到双元表达载体（如pCAMBIA1300），在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，并转化模式植物水稻。 

2．愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70%的乙醇消毒1分钟，然后用次氯酸钠（1.5%有效浓度）溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。 

愈伤诱导培养基：采用表5的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。 

3.继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。 

继代培养基：采用表5的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2ml 2,4-D（浓度1mg/ml），配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。 

4.农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌挑，取阳性单菌落，在1ml农杆菌培养液（含抗生素）中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50ml农杆菌培养液（含抗生素）中，28℃培养至OD600=0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600=0.6-1.0。然后将愈伤 组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。 

悬浮培养液：采用表5的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2ml 2,4-D（浓度1mg/ml），配成100ml溶液，调pH至5.4，分成两瓶（每瓶50ml），高温高压灭菌。使用之前加入1ml 50%的葡萄糖和100μlAS（100mM）。 

共培养培养基：采用表5的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0ml 2,4-D（浓度1mg/ml），配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20ml 50%的葡萄糖和1ml AS（100mM）。 

5．筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。 

筛选培养基：采用表6的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml 2,4-D（浓度1mg/ml），配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1ml Hn和1ml Cn（100ppm）。 

6．分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽（4-6周）。 

分化培养基：采用表6的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mgL IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。 

7．生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。 

生根培养基：采用表6的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。 

8．转化植株培养；待根系发达后，打开试管口，加入无菌水练苗2-3天后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。 

表5基本培养基成分1 

表6基本培养基成分2 

实施例5 

含水稻基因OsRINGzf1的转基因水稻植株的抗旱性鉴定 

鉴于水稻基因OsRINGzf1位于抗旱QTL区段内，经过对IRAT109苗期干旱胁迫及成株期干旱胁迫下的基因进行了定量PCR分析，结果表明该基因在干旱条件下表达时明显增加。因此对含水稻OsRINGzf1基因的转基因水稻（中花11）进行了PEG处理的模拟干旱胁迫，分析水稻基因OsRINGzf1的抗旱作用。在植株生长25天后，选取株高相同的转基因植株和中花11进行模拟干旱胁迫实验。用20%的PEG6000进行干旱胁迫，在处理144个小时后复水。在处理过程中，转基因植株与中花11表现出相同的受害症状，叶片萎蔫枯黄。在复水24小时后，转基因植株叶片伸展复苏早于中花11，复水2天后，转基因植株叶片复原生长明显好于中花11。因此，推测水稻基因OsRINGzf1可能提高植株的复原抗旱性。 

尽管对本发明已作了详细的说明并引证了一些具体实例，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。 

序列表 

<110>上海农科院上海市农业生物基因中心 

<120>一种与水稻抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白编码序列及其应用 

<130>OsRINGzf1 

<160>7 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>25 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

tggcaccaat caacctactg agaaa                    25 

<210>2 

<211>22 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

ccgataacca aggcaggagc at                       22 

<210>3 

<211>25 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

tggcaccaat caacctactg agaaa                    25 

<210>4 

<211>22 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

ccgataacca aggcaggagc at                 22 

<210>5 

<211>28 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

gtgaagttga aatggatcgg tgttctcg            28 

<210>6 

<211>1196 

<212>DNA 

<213>水稻（Oryza sativa） 

<400>6 

ggggggaggg gggggggggc gatgcgggag ccgtcggtgc tggtgcggga ggcggccgcg     60 

gagcacctcg aggagcggca agcggactgg gcctactccc gccgacgagg aaaggggaag    120 

tgacgggtcg tcttcatcta gcgatgatga tgtcacggag gacgatcgcc gtggtagctg    180 

caccgattgc gtcagtattg caaagcacct ggagtcagct aatacaatgt tctccttcat    240 

atggtggata attggatttt attggatatc tgctgggggt gaggatgtta tccgtgatgc    300 

acctcagctt tactggcttt gcatagtctt tctggcattt gacgtgttcc ttgttgtatt    360 

ctgtgttgct ctggcttgca tcattggtat tgctgtatgt tgctgcctac cttgcattat    420 

agctattctc tatgcggttt ctgatcagga aggagcgtca gaagatgata ttcgccaaat    480 

tccaagatac aaatttcgga gaacagatga acctgaaaaa caaactgctg gtgagacagg    540 

accttttggt gaaataatga cagagtgtgg caccaatcaa cctattgaga aagtactcgc    600 

acctgaagat gcggagtgtt gcatttgcct ttcggcatat gatgatggtg cagagctgcg    660 

tgaacttcct tgtgggcacc atttccactg tgcctgcatt gataaatggc tgcatatcaa    720 

cgcaacatgc cccctgtgca agttcaatat ccggaaaagt ggcagtagca gtggaagtga    780 

agaagtatga ytgtgtgaat atcctccggt cgagaacacc gatccatttc aacttcacam    840 

mtcgaatctc cygctaakgc aacgcacatg gacctgrcca gtgtaaattt tgtatccaaa    900 

atgtgtgatt agcgtcatat atgtacttga agtgactcaa gactgctgtt catatccaca    960 

tacatggttg tccaatgtgt cttttactgt ccggaataca tgcttagttg ccccgtgagt    1020 

tgtaattctt cgagtgatcc tcacatttcc tgcttgtgtt agcatggttt gtgcttatgc    1080 

tcctgccttg gtcattggtt cagcacaaaa actgttgtaa atgggctatc ggtcctgttg    1140 

aattgtcagg tacaaatgaa atgcgtcctg cttatgattc aaaaaaaaaa aaaaaa        1196 

<210>7 

<211>187 

<212>PRT 

<213>水稻（Oryza sativa） 

<400>7 

Met Phe Ser Phe Ile Trp Trp Ile Ile Gly Phe Tyr Trp Ile Ser Ala 

1               5                   10                  15 

Gly Gly Glu Asp Val Ile Arg Asp Ala Pro Gln Leu Tyr Trp Leu Cys 

            20                  25                  30 

Ile Val Phe Leu Ala Phe Asp Val Phe Leu Val Val Phe Cys Val Ala 

        35                  40                  45 

Leu Ala Cys Ile Ile Gly Ile Ala Val Cys Cys Cys Leu Pro Cys Ile 

    50                  55                  60 

Ile Ala Ile Leu Tyr Ala Val Ser Asp Gln Glu Gly Ala Ser Glu Asp 

65                  70                  75                  80 

Asp Ile Arg Gln Ile Pro Arg Tyr Lys Phe Arg Arg Thr Asp Glu Pro 

                85                  90                  95 

Glu Lys Gln Thr Ala Gly Glu Thr Gly Pro Phe Gly Glu Ile Met Thr 

            100                 105                 110 

Glu Cys Gly Thr Asn Gln Pro Ile Glu Lys Val Leu Ala Pro Glu Asp 

        115                 120                 125 

Ala Glu Cys Cys Ile Cys Leu Ser Ala Tyr Asp Asp Gly Ala Glu Leu 

    130                 135                 140 

Arg Glu Leu Pro Cys Gly His His Phe His Cys Ala Cys Ile Asp Lys 

145                 150                 155                 160 

Trp Leu His Ile Asn Ala Thr Cys Pro Leu Cys Lys Phe Asn Ile Arg 

                165                 170                 175 

Lys Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Glu Glu Val 

            180                 185 

Claims (4)

1.一种与水稻复原抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白，其特征在于，该蛋白的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.6中从核苷酸第227-790位的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的与水稻复原抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

3.一种含有权利要求1所述水稻复原抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白的编码核苷酸序列的载体。

4.权利要求1所述水稻复原抗旱性相关的OsRINGzf1蛋白的编码核苷酸序列在提高水稻植株复原抗旱性中的应用。