CN111139245A - 基因cda1在调控叶绿体发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因CDA1在调控叶绿体发育中的应用，属于植物基因工程和细胞生物学技术领域。本发明通过构建拟南芥CDA1基因的干涉载体，然后转染野生型拟南芥，获得干涉株系，研究发现干涉株系的子叶呈现不同程度的失绿，且叶绿体无类囊体膜结构，空泡化严重；本发明还通过T‑DNA插入拟南芥CDA1基因，获得突变体cda1，突变体cda1的光合蛋白的积累量与野生型相比大幅下降。实验证明，CDA1基因参与了对叶绿体发育的调控，影响植物光合蛋白的积累，可以用于针对植物叶绿体发育及光合作用的研究，为植物叶绿体发育及其调控植物光合性能的研究提供理论指导。

Description

基因CDA1在调控叶绿体发育中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和细胞生物学技术领域，具体涉及一种基因CDA1在调控叶绿体发育中的应用。

背景技术

光合作用为植物的生长提供了物质来源和能量来源，在可见光的照射下，利用光合色素，将二氧化碳(或硫化氢)和水转化为有机物，并释放出氧气(或氢气)的生化过程.光合作用是一系列复杂的代谢反应的总和，是生物界赖以生存的基础，也是地球碳氧循环的重要媒介。

叶绿体是进行光合作用的重要场所，同时也是光合色素的载体，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。叶绿体的形成是核-质基因复杂的调控过程，任何相关的基因的突变就可能无法形成正常的叶绿体。如拟南芥白化突变体的slp，pac，dcl，cla1和clb1-6，叶绿体中都缺乏内膜系统，只有单层内囊体膜或空泡化，且叶绿素含量和类胡萝卜含量均很低(Apuya et al.2001；Gutierrez-Nava Mde et al.2004)；对clb1-4和clb1-6突变体研究发现均是编码类异戊二烯(MEP)生物合成中1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(HDS)和异戊烯焦磷酸合成酶(IDS)，HDS蛋白在N端有叶绿体的靶向序列，这些基因的突变使类异戊二烯生物合成合成受阻影响叶绿体的正常形成(Gutierrez-Nava Mde etal.2004)。另一类编码叶绿体PPR蛋白的基因突变也易形成叶色突变体，如拟南芥的白化突变体atecb(Cao et al.2011b)，转绿突变体dg1(Chi et al.2008)，ys1(Zhou etal.2009)，svr3(Liu et al.2010)，svr7(Liu et al.2010b)等，这一类PPR蛋白主要作用参与一些叶绿体和线粒体编码基因的RNA编辑，剪切，稳定和翻译。水稻中也发现这一类蛋白，它的干涉能导致叶绿体发育受阻，水稻苗白化致死(Gothandam et al.2005)。叶绿体是普遍存在于陆地植物、藻类和部分原生生物中的半自主性细胞器，是光合作用的场所。植物光合作用几乎是所有生物赖以生存和发展的物质基础。因此对叶绿体发育及调控机制的研究，有助于更好地了解光合作用的调控机理。叶绿体作为植物重要的细胞器，尽管其发育及调控机制一直受到广泛研究学者的关注，但基于其复杂性，目前还有许多调控分子机制尚不清楚。

发明内容

针对上述现有技术，本发明经长期研究和探索，发现了能够调控叶绿体发育的基因CDA1。本发明通过构建拟南芥CDA1基因的干涉载体，然后转染野生型拟南芥，获得干涉株系，研究发现干涉株系的子叶呈现不同程度的失绿，且叶绿体无类囊体膜结构，空泡化严重；本发明还通过T-DNA插入拟南芥CDA1基因，获得突变体cda1，突变体cda1的光合蛋白的积累量与野生型相比大幅下降。实验证明，CDA1基因参与了对叶绿体发育的调控，影响植物光合蛋白的积累，可以用于针对植物叶绿体发育及光合作用的研究，为植物叶绿体发育及其调控植物光合性能的研究提供理论指导。

基于上述基因，本发明的第一方面，提供CDA1基因在调控植物叶绿体发育中的应用；所述CDA1基因为如下a)-c)中任一项所述的DNA片段；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)除a)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2所示的蛋白等价。

优选的，所述CDA1基因通过调控植物光合蛋白的积累量来调控叶绿体发育。

进一步的，所述植物光合蛋白包括：PsaA、PsaH、PsaL、PsbA、PsbD、PsbS、LHCII、和LHCA2。

优选的，所述植物为拟南芥。

本发明的第二方面，提供携带上述CDA1基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在调控叶绿体发育中的应用。

本发明的第三方面，提供如下1)-3)中任一项所述的蛋白在调控植物叶绿体发育中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在SEQ ID NO.2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

本发明的第四方面，提供一种培育叶绿体发育正常的转基因植株的方法，包括如下步骤：

将CDA1基因导入叶绿体发育异常的植物中，得到叶绿体发育正常的转基因植物；所述叶绿体发育异常的植物为缺失CDA1基因引起的叶绿体不发育或者发育迟滞，叶绿体无类囊体膜结构导致植物整体或叶片褪绿的植物。

在科学研究中，有时需要构建叶绿体发育异常的模式作物。基于此，本发明的第五方面，提供一种构建叶绿体发育异常的模式作物的方法，包括在含有如下a)-c)任一项所述的多核苷酸的植物中使所述多核苷酸表达降低或不表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)除a)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2所示的蛋白等价；

或者包括在含有由如下1)-2)中任一项所述的蛋白的植物中使所述蛋白质活性降低或丧失的步骤；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白。

优选的，使所述多核苷酸表达降低或不表达的方法包括：突变或敲除所述多核苷酸的全部或部分序列；或者构建干涉载体干扰所述多核苷酸的表达；或者使用基因沉默系统使所述多核苷酸的表达沉默。

优选的，所构建叶绿体发育异常的模式作物，其子叶呈现不同程度的失绿，且叶绿体无类囊体膜结构，空泡化严重；光合蛋白积累量下降。

本发明的有益效果：

本发明首次发现CDA1基因参与了对叶绿体发育的调控，CDA1基因定位于叶绿体中，在叶片中的表达量较高，在其他组织器官中也均有表达；CDA1基因的突变会影响光合蛋白的积累。本发明为植物叶绿体发育及其调控植物光合性能的研究提供了理论指导。

附图说明

图1：CDA1基因突变体和干涉株系在培养基中7天的表型；其中，WT：野生型拟南芥Col-0；cda1：CDA1基因突变体；2i-27，2i-20，2i-19，2i-40分别为CDA1的干涉株系。

图2：野生型拟南芥WT和CDA1干涉株系的基因表达量分析。

图3：CDA1干涉株系2i-27的子叶、真叶和黄色部分类囊体的电镜分析。

图4：CDA1-GFP转基因株系的亚细胞定位图。

图5：CDA1-GUS转基因株系中的GUS活性检测图。

图6：突变体cda1不同部位的基因表达量分析。

图7：突变体cda1的光合蛋白表达量的分析。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，叶绿体作为植物重要的细胞器，尽管其发育及调控机制一直受到广泛研究学者的关注，但基于其复杂性，目前还有许多调控分子机制尚不清楚。现有报道的调控叶绿体发育的关键基因并不多。未来的主要挑战是进一步挖掘能够对叶绿体发育起到调控作用的关键基因。

本发明人通过长期的研究和探索，发现了一种用于调控叶绿体发育的基因，该基因为拟南芥基因CDA1，该基因扩增自拟南芥基因组，其核苷酸序列如SED ID NO.1所示；所编码的氨基酸序列如SED ID NO.2所示。

本发明通过构建拟南芥CDA1基因的干涉载体，然后转染野生型拟南芥，获得干涉株系，研究发现干涉株系的子叶呈现不同程度的失绿，且叶绿体无类囊体膜结构，空泡化严重。

本发明还通过T-DNA插入拟南芥CDA1基因，获得突变体cda1，突变体cda1的基因组与野生型拟南芥的基因组相比，仅CDA1基因突变，其余基因不变。突变体cda1的光合蛋白的积累量与野生型相比大幅下降。

综合以上研究发现，CDA1基因参与了对叶绿体发育的调控，影响植物光合蛋白的积累，可以用于针对植物叶绿体发育及光合作用的研究。

基于上述发现的CDA1基因，本发明的保护范围还包括与上述基因同源的DNA片段，只要它们编码的蛋白与SEQ ID NO.2所示的蛋白功能等价。本文所指的“与SEQ ID NO.2所示的蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中SEQ ID NO.2所示的蛋白相同或相近。SEQ ID NO.2所示的蛋白典型的生物学功能是调控叶绿体发育。通过上调SEQ ID NO.2所示的蛋白的表达量和/或活性，可以提高光合蛋白的积累量，从而促进叶绿体的发育；相反，下调SEQ ID NO.2所示的蛋白的表达量和/或活性，可以降低光合蛋白的积累量，从而抑制叶绿体的发育。

这些与CDA1基因同源的DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ ID NO.1)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明SEQ ID NO.2所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的CDA1基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明CDA1基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，例如80％、85％、90％、95％、97％、98％或者99％，只要编码的蛋白与SEQ ID NO.2所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlin andAltschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：CDA1基因干涉株系、CDA1基因突变体以及标签载体的构建

1.CDA1基因干涉株系的构建：

1.1干涉载体的构建：

通过改造pCAMBIA2300上获得骨架干涉载体pCAMBIA2300RNAi-CDA1。根据CDA1基因的CDS序列设计引物(CDA1IF和CDA1IR)扩增出CDA1基因上256bp的特异性片段(SEQ IDNO.5)。采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，设计引物CDA1-PstL，CDA1-KpnR扩增特异性片段后用KpnI和PstI双酶切PCR片段及pCAMBIA2300RNAi-CDA1载体，酶切连接构建好含有第一条链外源片段的pCAMBIA2300RNAi-CDA1。取1μL连接产物，用冻融法转化到大肠杆菌DH5α中，转化产物涂布卡那霉素抗性(50μg/mL)的LB培养基。37℃培养过夜，挑单克隆进行提取质粒。再设计引物CDA1-SacL和CDA1-XbaR扩增特异性片段后用ScaI和XbaI双酶切PCR片段及含有第一条链外源片段pCAMBIA2300-CDA1，酶切后分别回收目标片段和载体片段。再一次作连接反应构建好含有两条尾尾相对的外源片段的pCAMBIA2300-CDA1载体。取1μL连接产物，用冻融法转化到大肠杆菌DH5α中，转化产物涂布卡那霉素抗性的LB固体培养基。37℃培养过夜，挑单克隆进行提取质粒。构建好的载体经测序验证后保存备用。

其中：

连接体系均为：

T4连接酶(Thermo Scientific))1μL，T4buffer 1μL，PCR片段7μL，pCAMBIA2300-CDA1载体2μL。37℃连接1.5h。

PCR反应条件均为：

95℃、5min；95℃、30sec，58℃、30sec，72℃、1min，32个循环；72℃、5min。

PCR反应所用的引物序列为：

CDA1IF：AGCAACAGCGTTCTCTCCTG；(SEQ ID NO.3)

CDA1IR：CTTCTTCGTGTTTCCATCAGC。(SEQ ID NO.4)

CDA1-PstL:cactgcagAGCAACAGCGTTCTCTCCTG；(SEQ ID NO.6)

CDA1-KpnR:ggggtaccCTTCTTCGTGTTTCCATCAGC。(SEQ ID NO.7)

CDA1-SacL：cgagctcAGCAACAGCGTTCTCTCCTG；(SEQ ID NO.8)

CDA1-XbaR：gctctagaCTTCTTCGTGTTTCCATCAGC。(SEQ ID NO.9)

1.2农杆菌转化

取-80℃保存的GV3101农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化，无菌条件下，向感受态细胞加入5μL提取的目标质粒，轻轻混匀，冰水浴中静置5分钟。将离心管置于液氮中速冻5min，然后将离心管置于37℃水浴中保持5min，不要晃动水面，将离心管放回冰水浴中，冰浴5min。无菌条件下加入800μL无抗LB液体培养基，于28℃震荡培养2-3小时，菌体复苏。5000rpm离心1min収菌留100μL左右上清，轻轻吹打重悬菌体，取适量菌液涂布于相应抗生素的LB培养基[利福平(50μg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)]上。于28℃培养箱倒置培养48小时。挑斑至500μL液体LB[利福平(50μg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)]中，28℃摇过夜，吸取菌液进行阳性检测后保存备用。

1.3转基因阳性苗的获取和筛选

1).转化农杆菌GV3101后，采用浸花法转到拟南芥。将含有目的基因的农杆菌单菌落接种到500μL含目的基因载体抗性的液体LB培养基，28℃，220rpm培养12h；将菌液液按1：100接种至300mL含利福平(50μg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)抗性的液体LB中，28℃，220rpm培养12h；离心收集菌体；

用5％蔗糖溶液将菌体重悬，调节至OD600＝0.8～1.0；将拟南芥花在溶液中浸泡1min；材料处理完后黑暗环境培养24h。

2).筛选：转化植株的种子为T1代，将T1代种子播种在卡那霉素(50μg/mL)抗性MS培养基(购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，在正常光照下培养约1周，观察并筛选阳性苗。将抗性苗移栽到营养土中，待种子成熟后，单株收种，即得T2代。将T2代继续用含卡那霉素抗性的MS培养基中继续筛选，直至得到纯合的转基因株系。

最后通过筛选获得多个CDA1基因干涉株系，分别命名为：2i-27、2i-20、2i-19和2i-40。

本实施例构建的CDA1基因干涉株系和野生型拟南芥的CDA1基因的表达量进行分析，结果见图2，由图2可以看出，CDA1基因干涉株系中，CDA1基因的表达量大幅降低。

2.CDA1基因突变体的构建：

CDA1基因突变体通过T-DNA插入拟南芥CDA1基因，获得突变体cda1，突变体cda1的基因组与野生型拟南芥的基因组相比，仅CDA1基因突变，其余基因不变。

CDA1基因突变体也可以购买得到，例如可以从网站https://abrc.osu.edu/上进行购买。

将本实施例构建的CDA1基因干涉株系和CDA1基因突变体在培养基中培养7天后，观察其表型，结果见图1(图中“SUC”表示蔗糖，“％”表示在培养基中加入的蔗糖的质量百分比)。

3.标签载体的构建：

CDA1-GUS CDA1-GFP载体构建关键部分在以下补充。详细方法皆为分子领域人员普遍常用的方法。

3.1CDA1-GUS标签载体的构建

载体构建具体步骤为将载体PC2300改造后接入带GUS标签的基因构成：设计引物CDA1-GUSL、CDA1-GUSR扩增CDA1基因片段。利用重组连接的方法将扩增片段连接到酶切载体(PstI BamHI)上得到CDA1-GUS标签载体。构建好的载体经测序验证后保存备用。

引物序列：

CSA1-GUSL：gccaagcttgcatgcctgcagCACTGCCTGCACCAAGCTTT；(SEQ ID NO.10)

CDA1-GUSR：ggactgaccacccggggatccTTTTTCTCCCTCACAAAGTTCGT。(SEQ ID NO.11)

3.2CDA1-GFP标签载体的构建

载体构建具体步骤为将载体PC2300改造后接入带GFP标签的基因构成：设计引物CDA1-GFPL、CDA1-GFPR扩增CDA1基因片段。利用重组连接的方法将扩增片段连接到酶切载体(PstI XbaI)上得到CDA1-GFP标签载体。构建好的载体经测序验证后保存备用。

引物序列：

CSA1-GFPL：ATGGCGAATTTACTGGAAACATC；(SEQ ID NO.12)

CDA1-GFPR：TCAGTTCAAAAAATCTTCAATAG。(SEQ ID NO.13)

实施例2：叶绿体的电镜观察

在苗期和抽薹期选取新鲜的干涉株系(2i-27)和野生型(WT)相同部位的叶片。样品用2.5％的戊二醛固定(25％的戊二醛用PH7.2，0.2M的磷酸缓冲液稀释至2.5％)，抽真空直至叶片全部沉到管底，4℃过夜。0.2M的磷酸缓冲液(PH7.2)洗涤三次后，用1％的锇酸固定液(pH值7.0)固定2h。固定完成后，再次用磷酸缓冲液洗涤3次，每次10min。之后进入脱水环节，各级酒精梯度脱水，每次30min，酒精梯度依次为30％，50％，70％，80％，90％，100％乙醇(两次)。脱水完成后，倒掉酒精。材料用用酒精与SPI-812树脂混合液按梯度依次渗透，渗透液比例3:1；3:2；3:3，每次3h。之后用SPI-812包埋，包埋后的材料放入37℃烘箱12h后，移至60℃烘箱直到材料完全聚合硬化。超薄切片使用Leica UC6切片机制备，厚度50-70nm，切片捞至铜网，用2％(w/v)乙酸铀酰和2.6％(w/v)柠檬酸铅双染色。染色后样品在透射电镜下镜检照相。

实验结果见图3，由图3可以看出，干涉单株2i-27子叶中无类囊体结构，空泡化，油体增多。真叶的绿叶部分类囊体膜减少。黄色部分只有部分基质片层，油体增多。

实施例3：亚细胞定位实验

研究亚细胞定位实验的原理是将高纯度、转染级的目标基因-GFP融合表达质粒转入到分离的拟南芥叶肉细胞原生体中，转化采用PEG-Ca²⁺介导的方法，融合蛋白在原生质体中表达后，用Leica共聚焦显微镜观察绿色荧光在细胞内的定位，即可确定目标基因的定位。亚细胞定位载体质粒的抽提采用QIAGEN Plasmid Midi Kit(http://www.qiagen.com/)，制备转染级的质粒。原生质体的分离依照Yoo等(2007)报导的方法进行。用PEG-Ca²⁺介导的方法将表达载体转入拟南芥原生质体后，室温避光培养过夜。因本研究目标基因预测定位在叶绿体中，故在共聚焦显微镜下观察时，以叶绿素的自发荧光(红色荧光)作为叶绿体的标记，同时观察绿色荧光的定位。

亚细胞定位的实验结果见图4，由图4可以看出，CDA1基因主要定位于叶绿体中。

实施例4：GUS染色实验

GUS染色的方法参照Willemsen等(1998)的方法进行。试剂的准备：

1)50mM磷酸缓冲液(pH7.2)：A溶液：3.12克NaH₂PO₄·2H₂O溶于100mL ddH₂O；B溶液：7.17克Na₂HPO₄·12H₂O溶于100mLddH₂O；取39ml A溶液与61mlB溶液混匀；

2)清洗缓冲液50mM磷酸缓冲液(pH7.2)95ml EDTA0.3722g亚铁氰化钾0.2112g铁氰化钾0.1646g 3)染色液：100mg X-gluc溶于5mL DMSO中，全部加入到100ml清洗缓冲中即为染色液，染色液要避光保存。

通过PCR鉴定得到启动子分析的拟南芥转基因阳性苗后，在不同发育时期取样包括根、苗期、茎、花蕾、角果等组织，用GUS染液处理，处理过程如下所述：a.用镊子取下待分析的组织，放入装有丙酮的2ml离心管中，加入的丙酮要浸过样品，每管的组织不宜过多。随后将离心管置于冰上20-30min左右；

b.倒掉离心管中的丙酮，用清洗缓冲液润洗样品两次；

c.倒清洗缓冲液，然后将加入染色液，染色液的体积要浸过样品；抽真空10分钟，而后置于37℃恒温箱中染色过夜；

d.当组织染上色以后，倒掉染色液，加入70％乙醇脱色。过段时间更换70％乙醇。染色的样品可以放在装有有CCD相机的体式显微镜中照相。

GUS染色实验的结果见图5。

实施例5：实时荧光定量PCR检测分析目标基因的表达

用实时荧光定量PCR检测分析拟南芥转基因植株中目的基因(CDA1基因)的表达量，具体方法如下：

首先提取目标部位的RNA；然后根据反转录的实验方法将RNA反转录成cDNA，测定cDNA浓度并将其稀释到100ng/μL左右；各基因的qPCR引物使用Primier5软件设计。最后进行实时荧光定量PCR检测分析。

qPCR检测引物序列：

RT-CDA1 L:AAGGAGCTTGATTCCTCATTGA；(SEQ ID NO.14)

RT-CDA1 R:ATGTCTTTAGCCTCGTTCGTAA。(SEQ ID NO.15)

总RNA提取步骤依据天根总RNA提取试剂盒进行。然后根据北京全式金反转录试剂盒的实验方法将RNA反转录成cDNA。

qPCR检测利用CFX96^TM Real-time system(Bio-Rad)，参照SYBR Green Real-timePCR Master Mix(QPK-201,ToYoBo)的操作体系来配制qPCR反应，

每个样品设3次重复。利用BnaActin(AF111812.1)基因作为内参。

PCR反应体系如下：cDNA模板8.4μL，上游引物(10um)0.8μL，下游引物(10um)0.8μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10μL，总体积20μL。PCR扩增程序为：95℃2min(1cycle)；95℃10s,60℃10s,72℃30s(40cycles)；95℃10s(1cycle)；65℃to 95℃5s.最后，依照2^-ΔΔCt分析结果。

实验结果见图6，由图6可以看出，CDA1基因在叶片中表达量较高，其他组织器官均有表达。

实施例6：光合蛋白的免疫印迹分析

1.总蛋白抽提：

总蛋白抽提缓冲液：

配方
	50mM Tris-HCL(pH7.5)
150mM NaCl
	0.5％TritonX-100
Protease Inhibitor

操作步骤：液氮研磨叶片，取大约0.1g粉末，加入200μL蛋白抽提缓冲液，充分混匀。12000rpm 4℃离心10min。取上清，以3:1加入4x loading bufferSolarbio)，混匀后100℃变性10min，冰上冷却5min。室温离心取上清进行SDS-PAGE检测。

2.SDS-PAGE检测：

操作步骤：依照表格配制SDS-PAGE胶，待样品上到胶孔内，浓缩胶以100V电压分离胶以120V电压跑至蛋白条带分开。

3.转膜

溶液配制：10x转膜液：甘氨酸29g，Tris58g，SDS3.7g，定容到1000ml。

1x转膜液：100ml 10x转膜液，加入200ml甲醇，定容到1000ml。

TBS(10x)：24.22gTris，87.75NaCl，浓盐酸调PH7.4，定容到1000ml。

TBST：100mlTBS(10x)，0.5mlTween 20，定容到1000ml。

操作步骤：将PVDF膜(GE Healthcare Life Science)用甲醇活化，之后将转膜液倒入事先准备好的塑料盒中。取下电泳胶，按照阳极-滤纸-膜-胶-滤纸-阴极的顺序放好，并注意赶走气泡。之后将其转入电泳槽中，并倒入转膜液，4℃200mA转膜90min。

4.转膜完成后用TBST与脱脂奶粉配制5％牛奶进行封闭，室温1h。

5.封闭完成后倒掉封闭液加入抗体溶液，抗体溶液用TBST配制的1％牛奶进行稀释，稀释倍数依照说明书。后放入4℃冰箱过夜。

6.一抗孵育完成后用TBST洗膜三次，每次5min。洗膜完成后取二抗用TBST配制的1％牛奶稀释，倒掉洗膜液加入二抗溶液孵育，摇床室温40min。

7.二抗孵育结束用TBST漂洗三次，每次5min。倒掉TBST用发光液(MILLIPORE)(1:1混合)覆盖膜之后马上用化学发光成像仪(Tanon-5200)观察发光。

光合蛋白的免疫印迹分析结果见图7，由图7可以看出，CDA1基因的突变影响光合蛋白的积累。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> 基因CDA1在调控叶绿体发育中的应用

<130> 2020

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgaatt tactggaaac atcaatcttt ttctcctctg ctgataaatt actgtctttc 60

ccgcctaaga attctcaaac ccatcatctc cctttctctg ctttcatcaa tggaggaaga 120

aagatacgca aaagctcaac tatcaccttt gctaccgaca ctgtcactta caatggcact 180

acaagtgcgg aagtaaaaag ctctgttgag gatccaatgg aagttgaggt tgctgaaggt 240

tacactatgg ctcagttttg tgacaagatt attgatctct tcttgaatga gaaacctaaa 300

gttaaacaat ggaagacgta tttggtttta agagatgaat ggaacaagta cagtgttaat 360

ttctataagc gttgcagaat ccgagctgat accgaaactg atcctatatt gaagcagaaa 420

ctggtatctt tggaaagtaa agtcaagaag atagataagg aaatggagaa acacaatgac 480

cttttgaagg agattcaaga aaacccaaca gacataaacg caatcgctgc caagagacgc 540

agagacttta cgggagagtt tttccgctat gttactttgt tatcagaaac tcttgatggc 600

ttggaagacc gagatgctgt tgcgaggctt gcaactagat gtttatctgc tgtgagtgct 660

tatgacaaca cgttggagag tgttgagact ctagatactg ctcaagcaaa gtttgaagat 720

attttaaact ctccatccgt ggattctgct tgcgaaaaga tcagaagttt agccaaggca 780

aaggagcttg attcctcatt gatcttattg atcaacagtg catacgctgc tgcaaaagag 840

tctcaaactg ttacgaacga ggctaaagac ataatgtatc atttatacaa agctacaaag 900

agcagtctta gaagcatcac accgaaagag atcaaacttt taaagtactt actcaacata 960

acagaccccg aagaacgatt ctctgcccta gctacagcat tctctcctgg tgatgaccac 1020

gaagctaagg accctaaagc attatacacg acgccaaagg agctgcataa gtggataaag 1080

ataatgcttg atgcttacca tctcaacaaa gaagaaacag acattaaaga agctaaacag 1140

atgagccaac ctatcgttat tcagcggctt ttcattctca aggacactat cgaagacgag 1200

tatttagaca agaaaacaat cgtggctgat gaaactccaa agaaggaaga agaagatacg 1260

actattgaag attttttgaa ctga 1284

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Asn Leu Leu Glu Thr Ser Ile Phe Phe Ser Ser Ala Asp Lys

1 5 10 15

Leu Leu Ser Phe Pro Pro Lys Asn Ser Gln Thr His His Leu Pro Phe

20 25 30

Ser Ala Phe Ile Asn Gly Gly Arg Lys Ile Arg Lys Ser Ser Thr Ile

35 40 45

Thr Phe Ala Thr Asp Thr Val Thr Tyr Asn Gly Thr Thr Ser Ala Glu

50 55 60

Val Lys Ser Ser Val Glu Asp Pro Met Glu Val Glu Val Ala Glu Gly

65 70 75 80

Tyr Thr Met Ala Gln Phe Cys Asp Lys Ile Ile Asp Leu Phe Leu Asn

85 90 95

Glu Lys Pro Lys Val Lys Gln Trp Lys Thr Tyr Leu Val Leu Arg Asp

100 105 110

Glu Trp Asn Lys Tyr Ser Val Asn Phe Tyr Lys Arg Cys Arg Ile Arg

115 120 125

Ala Asp Thr Glu Thr Asp Pro Ile Leu Lys Gln Lys Leu Val Ser Leu

130 135 140

Glu Ser Lys Val Lys Lys Ile Asp Lys Glu Met Glu Lys His Asn Asp

145 150 155 160

Leu Leu Lys Glu Ile Gln Glu Asn Pro Thr Asp Ile Asn Ala Ile Ala

165 170 175

Ala Lys Arg Arg Arg Asp Phe Thr Gly Glu Phe Phe Arg Tyr Val Thr

180 185 190

Leu Leu Ser Glu Thr Leu Asp Gly Leu Glu Asp Arg Asp Ala Val Ala

195 200 205

Arg Leu Ala Thr Arg Cys Leu Ser Ala Val Ser Ala Tyr Asp Asn Thr

210 215 220

Leu Glu Ser Val Glu Thr Leu Asp Thr Ala Gln Ala Lys Phe Glu Asp

225 230 235 240

Ile Leu Asn Ser Pro Ser Val Asp Ser Ala Cys Glu Lys Ile Arg Ser

245 250 255

Leu Ala Lys Ala Lys Glu Leu Asp Ser Ser Leu Ile Leu Leu Ile Asn

260 265 270

Ser Ala Tyr Ala Ala Ala Lys Glu Ser Gln Thr Val Thr Asn Glu Ala

275 280 285

Lys Asp Ile Met Tyr His Leu Tyr Lys Ala Thr Lys Ser Ser Leu Arg

290 295 300

Ser Ile Thr Pro Lys Glu Ile Lys Leu Leu Lys Tyr Leu Leu Asn Ile

305 310 315 320

Thr Asp Pro Glu Glu Arg Phe Ser Ala Leu Ala Thr Ala Phe Ser Pro

325 330 335

Gly Asp Asp His Glu Ala Lys Asp Pro Lys Ala Leu Tyr Thr Thr Pro

340 345 350

Lys Glu Leu His Lys Trp Ile Lys Ile Met Leu Asp Ala Tyr His Leu

355 360 365

Asn Lys Glu Glu Thr Asp Ile Lys Glu Ala Lys Gln Met Ser Gln Pro

370 375 380

Ile Val Ile Gln Arg Leu Phe Ile Leu Lys Asp Thr Ile Glu Asp Glu

385 390 395 400

Tyr Leu Asp Lys Lys Thr Ile Val Ala Asp Glu Thr Pro Lys Lys Glu

405 410 415

Glu Glu Asp Thr Thr Ile Glu Asp Phe Leu Asn

420 425

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcaacagcg ttctctcctg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttcttcgtg tttccatcag c 21

<210> 5

<211> 256

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcaacagcg ttctctcctg gggatgacca tgaagctaag gaccctaaag cattatacac 60

gacgccaaag gagctgcaca agtggataaa gataatgctc gacgcttacc atctcaacaa 120

agaagagact gacattagag aagctaaaca gatgagccaa cccatcgtca ttcagcggct 180

gttcgtcctc aaagacacca ttgaagagga gtatttggac aagaaaacgt ttgtagctga 240

tggaaacacg aagaag 256

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cactgcagag caacagcgtt ctctcctg 28

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggggtaccct tcttcgtgtt tccatcagc 29

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgagctcagc aacagcgttc tctcctg 27

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctctagact tcttcgtgtt tccatcagc 29

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gccaagcttg catgcctgca gcactgcctg caccaagctt t 41

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggactgacca cccggggatc ctttttctcc ctcacaaagt tcgt 44

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atggcgaatt tactggaaac atc 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcagttcaaa aaatcttcaa tag 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaggagcttg attcctcatt ga 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgtctttag cctcgttcgt aa 22

Claims (10)

1.CDA1基因在调控植物叶绿体发育中的应用；所述CDA1基因为如下a)-c)中任一项所述的DNA片段；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)除a)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2所示的蛋白等价。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CDA1基因通过调控植物光合蛋白的积累量来调控叶绿体发育。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物光合蛋白包括：PsaA、PsaH、PsaL、PsbA、PsbD、PsbS、LHCII、和LHCA2。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

5.携带权利要求1所述CDA1基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在调控叶绿体发育中的应用。

6.如下1)-3)中任一项所述的蛋白在调控植物叶绿体发育中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在SEQ ID NO.2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

7.一种培育叶绿体发育正常的转基因植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将CDA1基因导入叶绿体发育异常的植物中，得到叶绿体发育正常的转基因植物；所述叶绿体发育异常的植物为缺失CDA1基因引起的叶绿体不发育或者发育迟滞，叶绿体无类囊体膜结构导致植物整体或叶片褪绿的植物。

8.一种构建叶绿体发育异常的模式作物的方法，其特征在于，包括在含有如下a)-c)任一项所述的多核苷酸的植物中使所述多核苷酸表达降低或不表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)除a)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2所示的蛋白等价；

或者包括在含有由如下1)-2)中任一项所述的蛋白的植物中使所述蛋白质活性降低或丧失的步骤；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，使所述多核苷酸表达降低或不表达的方法包括：突变或敲除所述多核苷酸的全部或部分序列；或者构建干涉载体干扰所述多核苷酸的表达；或者使用基因沉默系统使所述多核苷酸的表达沉默。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所构建叶绿体发育异常的模式作物，其子叶呈现不同程度的失绿，且叶绿体无类囊体膜结构，空泡化严重；光合蛋白积累量下降。

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