JP2019528084A - テバインが増加したポピーおよびおよびその生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「ケシ(opium poppy)植物」または「ポピー(poppy)植物」は本明細書で使用されるとき、種Papaver Somniferumの植物を指す。
図1はテバインからのモルヒネの生合成の2つの経路を描いている模式図である。6位(環C)でのテバインのO−脱メチル化はテバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)によって触媒されるのに対して、3位(環A)でのO−脱メチル化はコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)によって触媒される。従って、テバインは6位または3位で脱メチル化を受けてそれぞれ、ネオピノンまたはオリパビンを生じる。ネオピノンは自然にコデイノンに変換し、それは次いでコデイノン還元酵素(COR)によってコデインに還元される。コデインはCODMによって3位で脱メチル化されてモルヒネを生じる。T6ODMによる6位でのオリパビンの脱メチル化はモルフィノンを生じ、それは次いでCORによってモルヒネに還元される。
本発明の遺伝子改変した植物におけるCODMおよびT6ODMの発現および/または活性は、植物にてこれら酵素の活性の低下を生じる方法によって低下させてもよい。これは、たとえば、DNA、RNAおよび/またはタンパク質のレベルでCODMおよびT6ODMの活性を変化させることによって達成されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「活性」は酵素のその同族の基質との生化学的な反応を指す。本発明の文脈では、低下したT6ODM(またはCODM)の活性はT6ODM(またはCODM)酵素のタンパク質レベルの低下および/またはT6ODM(またはCODM)酵素がテバインとの反応を触媒する速度の低下から生じてもよい。
態様の1つでは、本発明は、CODMおよびT6ODMをコードする内在性遺伝子を標的としてCODMおよびT6ODMの発現および/または活性を変える遺伝子改変に関する。内在性のCODMおよびT6ODMの遺伝子は、限定しないで、CODMおよびT6ODMの遺伝子をノックアウトすること;またはCODMおよびT6ODMの遺伝子を崩壊させる異種DNAをノックインすることによって変化させてもよい。当業者は、これらのアプローチがコーディング配列、プロモーター、または遺伝子の転写に必要な他の調節要素に適用されてもよいことを理解する。たとえば、CRISPR/Cas9およびTALENSのような技術を使用して、CODMおよびT6ODMをコードする内在性遺伝子双方に機能喪失突然変異を導入することができる。次いで、そのような機能喪失突然変異を含む各遺伝子の少なくとも一方の対立遺伝子を有する植物を自家受粉させて、CODMおよびT6ODMをコードする遺伝子における機能喪失対立遺伝子についてホモ接合型の子孫を作り出すことができる。一部の実施形態では、CODM(またはT6ODM)をコードする内在性遺伝子の遺伝子改変は、1以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって配列が異なり、かつ低下したCODM(またはT6ODM)活性を有するまたはCODM(またはT6ODM)活性を有さないポリペプチドを生じる。
別の態様では、本開示はそれらの各mRNA転写物を標的とすることによってCODMおよびT6ODMの発現および/または活性を低下させることに関する。この点で、同時抑制、アンチセンスの発現、小型ヘアピン(shRNA)の発現、干渉RNA(RNAi)の発現、二本鎖(dsRNA)の発現、逆向き反復dsRNAの発現、マイクロ干渉RNA(miRNA)、センス配列およびアンチセンス配列の同時発現、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない当該技術で既知の方法によってCODMおよびT6ODMのT mRNA転写物のレベルを低下させてもよい。
配列番号4に記述されている核酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも90%または100%の配列同一性を持っている核酸配列の少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも300、または少なくとも400の連続するヌクレオチド;
配列番号2に記述されている核酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも90%または100%の配列同一性を持っている核酸配列の少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも300、または少なくとも400の連続するヌクレオチド
を含む。
配列番号4に記述されている核酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも90%または100%の配列同一性を持っている核酸配列のうち、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、または少なくとも50の連続するヌクレオチドの最短長さおよび1750未満、1500未満、1250未満、1000未満、750未満または500未満の連続するヌクレオチドの最長長さを持つ、またはそのような最短と最長の長さの組み合わせを持つ核酸分子および
配列番号2に記述されている核酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも90%または100%の配列同一性を持っている核酸配列のうち、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、または少なくとも50の連続するヌクレオチドの最短長さおよび1750未満、1500未満、1250未満、1000未満、750未満または500未満の連続するヌクレオチドの最長長さを持つ、またはそのような最短と最長の長さの組み合わせを持つ核酸分子
を含む。
さらなる態様では、本開示はタンパク質レベルでCODMおよびT6ODMを標的とすることによってCODMおよびT6ODMの活性を低下させることに関する。たとえば、CODM(またはT6ODM)の活性は酵素の翻訳後修飾に影響を及ぼすことによって、または異種タンパク質の導入によって低下させてもよい(たとえば、CODM(またはT6ODM)の変異させた形態は、それが野生型酵素と会合し、その活性を変えるように、または基質を変換できずに基質に対する野生型酵素を打ち負かすもしくはCODM(またはT6ODM)酵素に特異的に結合する抗体を打ち負かすように発現させてもよい)。
アグロバクテリウムが介在する導入による植物細胞へのDNAの導入は当業者に周知である。たとえば、植物細胞の形質転換にTiまたはRiプラスミドが使用されるのであれば、TiまたはRiプラスミドに含有されるT−DNAの左右の境界双方が使用されることが多いが、少なくとも右境界が隣接領域として挿入される遺伝子に連結されなければならない。アグロバクテリウムが形質転換に使用されるのであれば、統合されるDNAは特定のプラスミドおよび具体的には中間ベクターまたはバイナリーベクターにクローニングされなければならない。中間ベクターは、T−DNAにおける配列に相同性である配列による相同組換えによってアグロバクテリウムのTiまたはRiプラスミドに組み込まれてもよい。これはまたT−DNAの導入に必要とされるvir領域も含有する。中間ベクターはアグロバクテリウムにて複製することができない。中間ベクターはヘルパープラスミド(コンジュゲーション)によってAgrobacterium tumefaciensに移すことができる。バイナリーベクターはアグロバクテリウムと同様にE.coliにて複製することができる。それらは選択マーカー遺伝子と、左右のT−DNA境界配列によって囲まれたリンカーまたはポリリンカーとを含有する。それらはアグロバクテリウムで直接形質転換することができる。宿主細胞として作用するアグロバクテリウムはvir領域を運ぶプラスミドを含有すべきである。vir領域はT−DNAの植物細胞への導入に必要とされる。追加のT−DNAが存在してもよい。そのような形質転換されたアグロバクテリウムを植物細胞の形質転換に使用する。植物細胞の形質転換へのT−DNAの使用は広範に研究されており、植物の形質転換に関する標準の総説および説明書に適宜記載されている。この目的でAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenesと共に培養された植物外植片を植物細胞へのDNAの導入に使用することができる。
CODMおよびT6ODMをコードする内在性遺伝子の破壊、その発現、またはCODMおよびT6ODMの酵素活性は、分子生物学の当該技術で既知の方法によって確認されてもよい。たとえば、内在性遺伝子の破壊はPCRとその後のサザンブロット解析によって評価されてもよい。CODMおよびT6ODMのmRNAレベルは、たとえば、リアルタイムPCR、RT−PCR、ノーザンブロット解析、マイクロアレイ遺伝子解析、およびRNA分解酵素保護によって測定されてもよい。CODMおよびT6ODMのタンパク質レベルは、限定しないで、酵素活性アッセイ、ELISAおよびウエスタンブロット解析によって測定されてもよい。CODMおよびT6ODMの発現またはその欠如はテバインの増加した蓄積の予測因子として使用されてもよい。CODMおよびT6ODMの酵素活性は生化学的にまたは機能的に評価されてもよい。
本開示はさらに、CODMおよび/またはT6ODMをコードする内在性遺伝子における機能喪失突然変異についての標的化スクリーニングと、突然変異を組み合わせて双方の遺伝子座で機能喪失突然変異についてホモ接合型である植物を得るためのその後の植物の育種が関与する、テバインのレベルが増加したケシ植物を生成する方法に関する。ケシの育種家は改善された品種の育成のために種々の選択法を使用している。しかしながら、種々の異なる所望の特徴を持つ親のハイブリッド形成が関与する最も上手く行った育種法。そのようなアプローチを上手く用いて、さく果の数、種子やケシの収量、モルヒネ含量、および耐倒伏性を高めている。
ケシの栽培およびアヘンの回収には従来、種子鞘を手動で切開し、乳状液を回収する工程が関与した。しかしながら、モルヒネおよび関連化合物をケシ殻から抽出する方法は従来の技法を回避したが、高品質の種子および薬学上価値のある原料を同時に入手することを可能にする。ケシ植物のケシ殻または乳状液からテバインを回収することはWO2009109012に記載されているように当該技術で周知である。以下に記載されている特定の方法に加えて、ケシ殻または乳状液からのアルカロイド抽出物を分析する方法もWO2009109012にて議論されている。
ケシの胚軸/根の形質転換
必要な培地
LB
アグロバクテリウム浮遊培地
20g/Lのスクロースを含有するB5塩およびビタミン、pH5.6〜5.8±0.2
20g/Lのスクロース、8g/Lの寒天で補完された、半分に薄めたMurashigeおよびSkoogの基礎培地
30g/Lのスクロース、2.0mg/LのNAAおよび0.1mg/LのBAP、8g/Lの寒天を含有するB5培地
1.0mg/LのNAA、0.5mg/LのBAP、50mg/Lのパロモマイシン、300mg/Lのチメンチンおよび8g/Lの寒天を含有するB5培地
30g/Lのスクロース、0.25g/LのMES、0.2g/Lのミオ−イノシトール、1mg/Lの2,4−D、2.5mg/LのAgNO3、8g/Lの寒天で補完したMurashigeおよびSkoogの基礎培地。pHは5.6±0.2。(に加えて抗生剤−チメンチン300mg/L)
30g/Lのスクロース、0.25g/LのMES、0.2g/Lのミオ−イノシトール、1mg/Lのベンジルアデニン、1mg/Lのゼアチン、2.5mg/LのAgNO3、8g/Lの寒天で補完したMurashigeおよびSkoogの基礎培地。pHは5.6±0.2。(に加えて抗生剤−チメンチン300mg/L)
50mg/Lのパロモマイシン、300mg/Lのチメンチンおよび8g/Lの寒天を含有するB5培地
30g/Lのスクロース、0.25g/LのMES、0.2g/Lのミオ−イノシトール、0.5mg/Lのベンジルアデニン、2.5mg/LのAgNO3、8g/Lの寒天で補完したMurashigeおよびSkoogの基礎培地。pHは5.6±0.2。(に加えて抗生剤−チメンチン300mg/L)
30g/Lのスクロース、0.25g/LのMES、0.2g/Lのミオ−イノシトール、2.5mg/LのAgNO3、8g/Lの寒天で補完したMurashigeおよびSkoogの基礎培地。pHは5.6±0.2。(に加えて抗生剤−チメンチン300mg/L)
70%(vv−1)エタノールで30秒間および1%(vv−1)次亜塩素酸ナトリウム溶液で2分間をそれぞれ3回で種子の表面を滅菌し、次いで無菌水で5回すすいだ。およそ50個の種子を瓶における25mLの寒天固化培地に載せた。基礎培地は、30g/Lのスクロースで補完し(Gamborg,et al.1968)、0.8%(wv−1)の寒天で固化した1/2MurashigeおよびSkoogの基礎培地から成った。寒天を加える前に培地をpH5.6〜5.8に合わせ、次いでオートクレーブによって滅菌した。標準の白色蛍光灯および16時間の明期のもとで25℃での生長室にて種子を発芽させた。
バイナリーベクターpORE::ALM−MIRMACをエレクトロポレーションによってAgrobacterium tumefaciens株EHA105にて動員した。50mg/Lのカナマイシンおよび100mg/Lのリファムピシンを含有する液状Luria−Bertani培地[1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、および1%NaCl、pH7.0]にて180rpmでの旋回振盪器において28℃でA.tumefaciensの培養物をA600=0.8まで増殖させた。4000rpmでの10分間の遠心分離によって細菌細胞を回収し、液状植菌培地(20g/Lのスクロースを含有するB5塩およびビタミン)にてA600=0.5の細胞密度で再浮遊させた。
12日齢の苗に由来する切り取られた子葉、ライン118を胚軸の長手二分によって単離した。液状植菌培地におけるA.tumefaciensの培養物に胚軸を15分間浸け、無菌の濾紙上で乾燥ブロットし、一次カルス誘導培地上で25℃にて暗所でインキュベートした。A.tumefaciensとの共培養の2日後、50mg/Lのパロモマイシンと300mg/Lのチメンチンを含有する新しい一次カルス誘導培地に胚軸を移した。インキュベートの4〜5週間後、体細胞胚誘導培地にて一次カルスを継代した。誘導培地での培養の3週間後、体細胞胚を植物ホルモンを含まない植物再生培地に移した。成熟胚を植物ホルモンを含まない培地に入れ、未成熟胚を胚成熟および発芽の培地に移した。次いで最初の子葉が出現したら、それを新芽伸長培地に移植した。最終的に、新芽が約0.5〜1cmであれば、それらを発根培地に入れた。再生された推定上のトランスジェニック小植物を標準の白色蛍光灯および16時間の明期のもとで25℃での生長室にて生長させた。次いで、発根した小植物を加熱滅菌した土壌を含有するポットに移し、ポリエチレン袋で1週間覆って高湿度を持続させ、25℃で1〜2週間、生長室で維持し、その後、植物を温室に移した。
(1)アグロバクテリウムにおける所望の構築物の単一コロニーを摘み取り、適当な抗生剤を含有する2mLのLB液体培地にそれを植菌し、28℃で一晩培養して始動培養物を調製する。
(2)始動培養物と共に適当な抗生剤を含有する100mLのLB液体培地を植菌し、28℃で一晩培養する。所望のOD600=0.5〜0.8が達成されるまで細胞をインキュベートする。
(3)4000rpmで10分間の遠心分離によって細胞をペレットにする。
(4)最終OD600=0.5までアグロバクテリウム浮遊培地にて細胞を再浮遊させる。
(5)アグロバクテリウム浮遊液に浸しながら、12日齢の苗に由来する根および胚軸のセグメントを約5mmのセグメントに切断する。
(6)時折回転させながら、アグロバクテリウム浮遊液にてペトリ皿で15分間、根および胚軸のセグメントをインキュベートする。
(7)無菌の濾紙上で根および胚軸のセグメントを乾燥ブロットし、一次カルス誘導培地を含有するプレートに移す。暗下(アルミホイルで覆った)での生長キャビネットにて22±2℃で2日間インキュベートする。
(8)共培養の2日後、無菌蒸留水で根および胚軸のセグメントを洗浄し、無菌の濾紙上で乾燥ブロットし、一次カルス誘導培地(抗生剤パロモマイシンを加えた)を含有するプレートに移す。
(9)暗所(アルミホイルで覆った)での標準の条件(16/8時間明期)の生長室にて植物をおよそ4〜5週間インキュベートする。
(10)インキュベートの4〜5週間後、一次カルスを体細胞胚誘導培地(抗生剤パロモマイシンを加えた)で継代した。
(11)誘導培地における培養の3週間後、成熟体細胞胚を植物ホルモンを含まない培地(抗生剤なし)に移した。未成熟の胚を胚成熟および発芽の培地(抗生剤なし)での別の回の選択に配置し、胚が成熟し、発芽し始めるまで16/8時間明期のもとでの生長キャビネットにて22±2℃でインキュベートした。
(12)発芽している胚を、新芽伸長培地を含有するプレートに新芽が出現するまで移し、その後、発根培地に移す。
(13)約0.5〜1.0cmの新芽を発根培地に移す。
(14)発根した小植物を水道水のもとで洗浄し、付着している寒天全体を取り除き、次いで小ポットにおける無菌土壌に移し、サランラップ(登録商標)で覆い、順化のために生長キャビネットにてインキュベートした。
(15)得られた推定上の形質転換体を導入遺伝子の存在および発現について分析する。
注:発根培地には抗生剤は含まれない。
(1)50mg/mLのパロモマイシン硫酸塩のストック:粉末を水に溶解することによって調製し、濾過によって滅菌し、等分し、−20℃で保存する。
(2)50mg/mLのカナマイシンのストック:粉末を水に溶解することによって調製し、濾過によって滅菌し、等分し、−20℃で保存する。
(3)100mg/mLのリファムピシンのストック:粉末をDMSOに溶解することによって調製し、等分し、−20℃で保存する。
(4)300mg/mLのチメンチンのストック:粉末を水に溶解することによって調製し、濾過によって滅菌し、等分し、−20℃で保存する。
(5)2.0mg/mLのNAAのストック:粉末を1NのNaOHに溶解することによって調製し、水で容量を調整し、濾過によって滅菌し、等分し、−20℃で保存する。
(6)2.0mg/mLのBAPのストック:粉末を1NのNaOHに溶解することによって調製し、水で容量を調整し、濾過によって滅菌し、等分し、−20℃で保存する。
(7)5mg/mLのAgNO3のストック:粉末を水に溶解することによって調製し、濾過によって滅菌し、+4℃で保存する。
(8)1.0mg/mLのゼアチンのストック:粉末を1NのNaOHに溶解することによって調製し、水で容量を調整し、濾過によって滅菌し、等分し、−20℃で保存する。
(9)培地に使用する化学薬品はすべて、約50℃に冷却した時点で加熱滅菌した培地に加える。90×25mmのペトリ皿に注ぐ前に回転して培地を十分に混合する。
発現構築物を含むT−DNAは、パロマイシンへの耐性を付与するnptII遺伝子を含んだ。6つの小植物(AM1〜AM6)がパロモマイシンに耐性として特定されたということは、これらの植物が発現構築物で形質転換されたことを示唆している。ヘアピン発現構築物に特異的なプライマー(配列番号9,TAACCGACTTGCTGCCCCGA;配列番号10,AAATAGAGATGCTTGCAGAAGATCCCG)を用いたこれらの小植物から単離されたゲノムDNAでのポリメラーゼ鎖反応は、植物AM1、AM2およびAM3がゲノムDNAに由来するアンプリコンを含有することを示した。アクチン用のプライマー(配列番号11,CGTTTGAATCTTGCTGGCCGTGAT;配列番号12,TAGACGAGCTGCCTTTGGAAGTGT)を陽性対照として用いて試料がPapaver somniferumに由来するゲノムDNAを含有することを確認した。
酸性抽出:0.100gの粉砕したさく果または茎(ポピーに由来する)を10%酢酸、10%水および80%メタノールの溶液5mLと混合し、その後30分間撹拌し、次いで濾過した。濾液を直接HPLCに注入した。
工程番号 時間(分) パーセントA パーセントB
1 0 95 5
2 0.25 85 15
3 2.00 60 40
4 2.01 95 5
5 3.00 20 80
6 4.00 10 90
7 5.00 0 100
報告された数字は乾燥出発物質の重量パーセントである。
本発明の特定の実施形態が記載され、説明されてきた一方で、そのような実施形態は本発明の説明のみと見なされるべきであり、添付のクレームに従って解釈されるような本発明を限定すると見なされるべきではない。
Claims (101)
- ケシ(opium poppy)植物にてテバインの蓄積を増やす方法であって、前記方法が、前記植物のゲノムを遺伝的に改変して、前記ポピー(poppy)植物にてテバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)およびコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)の活性を同時に低下させる1以上の安定な遺伝子改変を含むようにすることを含む、上記方法。
- T6ODMが、配列番号1のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- CODMが、配列番号3のアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の方法。
- T6ODMおよびCODMの前記活性を同時に低下させるように前記植物を遺伝的に改変することが、発現構築物を導入して、T6ODMをコードする内在性遺伝子からの転写物の蓄積を低下させることを含む、請求項1、2、または3に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子からの転写物の蓄積を低下させるための前記発現構築物の前記配列が、配列番号2または配列番号4の一部を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記植物を遺伝的に改変することが、T6ODMをコードする内在性遺伝子に機能喪失突然変異を導入することを含む、請求項1、2、または3に記載の方法。
- T6ODMおよびCODMの前記活性を同時に低下させるように前記植物を遺伝的に改変することが、CODMをコードする内在性遺伝子からの転写物の蓄積を低下させる発現構築物を導入することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子からの転写物の蓄積を低下させるための前記発現構築物の配列が、配列番号2または配列番号4の一部を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記植物を遺伝的に改変することが、CODMをコードする内在性遺伝子に機能喪失突然変異を導入することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 野生型植物細胞と比べてテバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)およびコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)の低下した活性を有する遺伝子改変したケシ植物細胞であって、前記遺伝子改変したケシ植物細胞が、T6ODM、CODMまたは双方の発現を低下させる1以上の安定な遺伝子改変を含む、前記ケシ植物細胞。
- T6ODMの発現を低下させるための第1の発現構築物およびCODMの発現を低下させるための第2の発現構築物を含む、請求項10に記載の植物細胞。
- 前記第1の発現構築物が、T6ODMをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための第1のヘアピンRNAをコードする第1の核酸分子を含む、請求項11に記載の植物細胞。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号15の配列を含むmRNAをコードする、請求項12に記載の植物細胞。
- 前記第1のヘアピンRNAをコードする前記核酸分子が、配列番号2の一部を含む、請求項12または13に記載の植物細胞。
- 前記第2の発現構築物が、CODMをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための第2のヘアピンRNAをコードする第2の核酸分子を含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の植物細胞。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号16の配列を含むmRNAをコードする、請求項15に記載の植物細胞。
- 前記第2のヘアピンRNAをコードする前記核酸分子が、配列番号4の一部を含む、請求項15または16に記載の植物細胞。
- T6ODMおよびCODMの発現を低下させるための核酸分子を含む発現構築物を含む、請求項10に記載の植物細胞。
- 前記核酸分子が、CODMをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるためのヘアピンRNAをコードする、請求項18に記載の植物細胞。
- 前記核酸分子が、T6ODMをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるためのヘアピンRNAをコードする、請求項18または19に記載の植物細胞。
- 前記核酸分子が、T6ODMおよびCODMをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるのに十分な単一のヘアピンRNAをコードする、請求項18に記載の植物細胞。
- 前記核酸分子が、配列番号2、配列番号4、または双方の一部を含む、請求項19、20または21に記載の植物細胞。
- 前記発現構築物が、T6ODMをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための第1のヘアピンRNAをコードする第1の核酸分子およびCODMをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための第2のヘアピンRNAをコードする第2の核酸分子を含む、請求項18に記載の植物細胞。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号15の配列を含むmRNAをコードする、請求項23に記載の植物細胞。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号1の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項23または24に記載の植物細胞。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号16の配列を含むmRNAをコードする、請求項23、24または25に記載の植物細胞。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号3の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項23〜26のいずれか一項に記載の植物細胞。
- 前記第1の核酸分子および前記第2の核酸分子のそれぞれが、配列番号2、配列番号4、または双方の一部を含む、請求項23〜27のいずれか一項に記載の植物細胞。
- 前記ヘアピンRNAをコードする前記核酸分子が、配列番号8の一部を含む、請求項19〜22のいずれか一項に記載の植物細胞。
- 前記ヘアピンRNAをコードする前記核酸分子が、配列番号7の一部を含む、請求項19〜22のいずれか一項に記載の植物細胞。
- 前記第1の核酸分子が、配列番号8の一部を含む、請求項12〜17および23〜28のいずれか一項に記載の植物細胞。
- 前記第1の核酸分子が、配列番号7の一部を含む、請求項12〜17および23〜28のいずれか一項に記載の植物細胞。
- 前記第2の核酸分子が、配列番号8の一部を含む、請求項15〜17および23〜28のいずれか一項に記載の植物細胞。
- 前記第2の核酸分子が、配列番号7の一部を含む、請求項15〜17および23〜28のいずれか一項に記載の植物細胞。
- 前記植物細胞が、T6ODMの低下した活性を有するように遺伝的に改変され、CODMの低下した活性が、前記植物細胞の遺伝子改変によって導入されなかったCODMをコードする前記内在性遺伝子における突然変異によって付与される、請求項10に記載の植物細胞。
- 前記植物細胞の遺伝子改変によって導入されなかったCODMをコードする前記内在性遺伝子における前記突然変異が、特許寄託指定PTA−9109のもとで寄託された植物の種子に存在する突然変異である、請求項35に記載の植物細胞。
- 植物細胞がCODMの低下した活性を有するように遺伝子改変され、T6ODMの低下した活性が前記植物細胞の遺伝子改変によって導入されなかったT6ODMをコードする前記内在性遺伝子における突然変異によって付与される、請求項10に記載の植物細胞。
- 前記植物細胞の遺伝子改変によって導入されなかったT6ODMをコードする前記内在性遺伝子における前記突然変異が、特許寄託指定PTA−9110のもとで寄託された植物の種子に存在する突然変異である、請求項37に記載の植物細胞。
- テバイン含量が増加したケシ植物を生産する方法であって、
前記方法が、
(a)前記植物にて内在性のテバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること;および
(b)前記植物にてコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること
を含み、
T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の前記発現を減少させることが、T6ODMをコードする前記内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有するように前記植物を遺伝的に改変することを含む、
上記方法。 - T6ODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子が、T6ODMをコードする前記遺伝子における破壊または点突然変異を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記破壊が、欠失または挿入である、請求項40に記載の方法。
- 前記挿入が、T−DNAまたは転位因子である、請求項41に記載の方法。
- テバイン含量が増加したケシ植物を生産する方法であって、
前記方法が、
(a)前記植物にて内在性のテバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること;および
(b)前記植物にてコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること
を含み、
T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の前記発現を減少させることが、T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な異種核酸分子を発現させることを含み、前記異種核酸分子の発現がT6ODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させる、
上記方法。 - T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子がRNA干渉によってT6ODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させる、請求項43に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号2または配列番号4の一部を含む、請求項43または44に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号7の一部を含む、請求項43または44に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号8の一部を含む、請求項43または44に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子の前記発現を減少させることが、CODMをコードする前記内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有するように前記植物を遺伝的に改変すること、またはCODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な異種核酸分子を発現させることを含み、CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子がCODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させる、請求項39〜47のいずれか一項に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子が、CODMをコードする前記遺伝子における破壊または点突然変異を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記破壊が、CODMをコードする前記遺伝子における欠失または挿入である、請求項49に記載の方法。
- CODMをコードする前記遺伝子における前記挿入が、T−DNAまたは転位因子である、請求項50に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、RNA干渉によってCODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させる、請求項48に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号2または配列番号4の一部を含む、請求項48または52に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子の前記発現を減少させることが、CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な異種核酸分子を発現させることを含み、CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、CODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させ、T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子およびCODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、単一の核酸分子である、請求項43〜47のいずれか一項に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号7の一部を含む、請求項48、52、または53に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号8の一部を含む、請求項48、52、または53に記載の方法。
- 前記T6ODMが配列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有し、かつ前記CODMが配列番号3に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項39〜56のいずれか一項に記載の方法。
- テバイン含量が増加したケシ植物を生産する方法であって、
前記方法が、
(a)前記植物にて内在性のテバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること;および
(b)前記植物にてコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること
を含み、
CODMをコードする前記内在性遺伝子の前記発現を減少させることが、CODMをコードする前記内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有するように前記植物を遺伝的に改変することを含む、
上記方法。 - 前記機能喪失対立遺伝子が、遺伝子における破壊または点突然変異を含む、請求項58に記載の方法。
- 前記破壊が、欠失または挿入である、請求項59に記載の方法。
- 前記挿入が、T−DNAまたは転位因子である、請求項60に記載の方法。
- テバイン含量が増加したケシ植物を生産する方法であって、
前記方法が、
(a)前記植物にて内在性のテバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること;および
(b)前記植物にてコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること
を含み、
CODMをコードする前記内在性遺伝子の前記発現を減少させることが、CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な異種核酸分子を発現させることを含み、前記異種核酸分子の発現が、CODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させる、
上記方法。 - CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、RNA干渉によってCODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させる、請求項62に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号2または配列番号4の一部を含む、請求項62または63に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号7の一部を含む、請求項62または63に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号8の一部を含む、請求項62または63に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の前記発現を減少させることが、T6ODMをコードする前記内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有するように前記植物を遺伝的に改変すること、またはT6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な異種核酸分子を発現させることを含み、T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子がT6ODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させる、請求項58〜66のいずれか一項に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子が、T6ODMをコードする前記遺伝子にて破壊または点突然変異を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記破壊が、T6ODMをコードする前記遺伝子における欠失または挿入である、請求項68に記載の方法。
- 前記挿入が、T6ODMをコードする前記遺伝子におけるT−DNAまたは転位因子である、請求項69に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、RNA干渉によってT6ODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させる、請求項67に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号2または配列番号4の一部を含む、請求項67または71に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の前記発現を減少させることが、T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な異種核酸分子を発現させることを含み、T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子がT6ODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を減少させ、T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子およびCODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、単一の核酸分子である、請求項62〜66のいずれか一項に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号7の一部を含む、請求項67、71、または72に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の一部に対して相同な前記異種核酸分子が、配列番号8の一部を含む、請求項67、71、または72に記載の方法。
- 前記T6ODMが、配列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項62〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)およびコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子の低下した発現を有する遺伝子改変したポピー(poppy)植物細胞であって、前記遺伝子改変した植物細胞が、
前記植物細胞にてT6ODMをコードする内在性遺伝子の発現を減少させるための安定して遺伝するトランスジェニック発現構築物;および
前記植物細胞にてCODMをコードする内在性遺伝子の発現を減少させるための安定して遺伝するトランスジェニック発現構築物
を含む、
上記遺伝子改変した植物細胞。 - 請求項39〜76のいずれか一項に記載の方法によって生産される遺伝子改変した植物細胞。
- テバインを生産する方法であって、前記方法が、請求項10〜38および78のいずれか一項に記載の植物細胞から回収される乳状液またはケシ殻からテバインを単離することを含む、上記方法。
- 野生型ケシ植物と比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法であって、
前記方法が、
i)分子法を用いて、コデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして第1の植物を特定すること;
ii)前記第1の植物と、テバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有する第2の植物との交配を確立すること;
iii)前記交配に由来する子孫を自家受粉させること;および
iv)CODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子およびT6ODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子の双方に関してホモ接合型である植物について自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすること
を含む、
上記方法。 - T6ODMをコードする前記内在性遺伝子にて前記機能喪失対立遺伝子を有する前記第2の植物が、分子法を用いて特定される、請求項80に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子が、前記第2の植物またはその祖先の遺伝子改変によって生成される、請求項80に記載の方法。
- T6ODMをコードする前記内在性遺伝子にて前記機能喪失対立遺伝子を有する前記第2の植物が、ATCC PTA−9110として寄託された株の植物である、請求項80に記載の方法。
- 野生型ケシ植物と比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法であって、
前記方法が、
i)分子法を用いて、テバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして第1の植物を特定すること;
ii)前記第1の植物と、コデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有する第2の植物との交配を確立すること;
iii)前記交配に由来する子孫を自家受粉させること;および
iv)CODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子およびT6ODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子の双方に関してホモ接合型である植物について自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすること
を含む、
上記方法。 - 分子法を用いて、CODMをコードする前記内在性遺伝子にて前記機能喪失対立遺伝子を有する前記第2の植物が特定される、請求項84に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子が前記第2の植物またはその祖先の遺伝子改変によって生成される、請求項84に記載の方法。
- CODMをコードする前記内在性遺伝子にて前記機能喪失対立遺伝子を有する前記第2の植物がATCC PTA−9109として寄託された株の植物である、請求項84に記載の方法。
- 野生型ケシ植物と比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法であって、
前記方法が、
i)分子法を用いて、テバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定すること;
ii)コデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子に機能喪失対立遺伝子を導入するように前記植物を遺伝的に改変すること;
iii)前記植物を自家受粉させること;および
iv)CODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子およびT6ODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子の双方に関してホモ接合型である植物について前記自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすること
を含む、
上記方法。 - 野生型ケシ植物と比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法であって、
前記方法が、
i)分子法を用いて、コデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定すること;
ii)遺伝子改変によって前記植物においてテバイン6−O−脱メチル化酵素 T6ODM)をコードする内在性遺伝子に機能喪失対立遺伝子を導入するように前記植物を遺伝的に改変すること;
iii)前記植物を自家受粉させること;および
iv)CODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子およびT6ODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子の双方に関してホモ接合型である植物について前記自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすること
を含む、
上記方法。 - 野生型ケシ植物と比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法であって、
前記方法が、
i)分子法を用いて、テバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定すること;
ii)コデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように前記植物を遺伝的に改変すること;
iii)前記植物を自家受粉させること;および
iv)T6ODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子に関してホモ接合型であり、かつCODMをコードする前記内在性遺伝子の低下した発現を有する植物について前記自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすること
を含む、
上記方法。 - CODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を低下させるように前記植物を遺伝的に改変することが、CODMをコードする前記内在性遺伝子を標的とするヘアピンRNAを発現させるために発現構築物を導入することを含む、請求項90に記載の方法。
- 野生型ケシ植物と比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法であって、
前記方法が、
i)分子法を用いて、コデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定すること;
ii)テバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)をコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように前記植物を遺伝的に改変すること;
iii)前記植物を自家受粉させること;および
iv)CODMをコードする前記内在性遺伝子における前記機能喪失対立遺伝子に関してホモ接合型であり、かつT6ODMをコードする前記内在性遺伝子の低下した発現を有する植物について前記自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすること
を含む、
上記方法。 - T6ODMをコードする前記内在性遺伝子の発現を低下させるように前記植物を遺伝的に改変することが、T6ODMをコードする前記内在性遺伝子を標的とするヘアピンRNAを発現させるために発現構築物を導入することを含む、請求項92に記載の方法。
- 前記分子法が、ゲノム中の標的化誘発局所的損傷(TILLING)の方法論を含む、請求項80〜93のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項80〜94のいずれか一項に記載の方法に従って生成される、ケシ植物細胞。
- 単離された核酸分子であって、前記核酸分子の配列が配列番号7を含む、前記核酸分子。
- ケシ植物にてテバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)およびコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子の発現を同時に低下させるための発現ベクターであって、前記発現ベクターが請求項96に記載の単離された核酸を含む、前記発現ベクター。
- ケシ植物にてテバイン6−O−脱メチル化酵素(T6ODM)およびコデイン3−O−脱メチル化酵素(CODM)をコードする内在性遺伝子の発現を同時に低下させるための、配列番号2または配列番号4の一部を含む配列を有するポリヌクレオチド分子の使用。
- テバインの生産のための、請求項10〜38、77、78、および95のいずれか一項に記載の植物細胞を含む植物の使用。
- 請求項10〜38、77、78、および95のいずれか一項に記載の植物細胞を含む植物に由来するケシ殻。
- 請求項10〜38、77、78、および95のいずれか一項に記載の植物細胞に由来する乳状液。
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