KR20110018797A - 벼의 잎과 뿌리의 분열조직에서 발현하는 ｐＤＭＥ1 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법 - Google Patents

벼의 잎과 뿌리의 분열조직에서 발현하는 ｐＤＭＥ1 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼(Oryza sativa)에서 분리된 잎과 뿌리의 분열조직에서 발현하는 pDME1 프로모터 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질 전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프로모터를 이용하여 생장이 우수한 품종 개발을 위한 분열촉진 유용 유전자를 잎과 뿌리의 분열조직에서 발현되도록 할 수 있는 벡터와 형질전환체를 얻을 수 있다.
분열조직, 조직 특이적 발현, 프로모터

Description

벼의 잎과 뿌리의 분열조직에서 발현하는 ｐＤＭＥ1 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법 {Recombinant expression vector comprising pDME1 promoter and transformant transformed therewith}
본 발명은 벼(Oryza sativa)에서 분리된 잎과 뿌리의 분열조직에서 발현하는 pDME1 프로모터 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조 방법에 관한 것이다.
벼는 세계에서 가장 중요한 식량작물의 하나로 과거 20여년 동안 꾸준히 수량증대에 힘써왔으나 현재 인구증가 추세로 볼 때 2020년이면 현재의 70%이상에 달하는 수량을 더 생산해야만 될 형편에 놓여있다. 그러나 벼가 재배되는 농지는 세계 각국의 공업화현상으로 갈수록 줄어들고 육종의 소재가 되는 새로운 유전자원은 고갈되어 외래 유용유전자의 도입이 요구되고 있다. 다행히 분자생물학의 발달로 외래 유용유전자의 분리 및 조작이 가능하게 되어 이 유용유전자를 벼를 비롯한 많은 식물세포에 형질전환하여 새로운 유전자가 조합된 형질전환체를 얻음으로서 여러 가지 생명현상을 규명하는 유전자발현 연구는 물론 육종의 좋은 소재가 되고 있 다. 이러한 형질전환을 이용한 신품종 생산은 앞으로 다가오는 21세기에는 고부가가치 산업으로 대두함은 물론이며 인류의 가장 큰 문제점으로 부각되는 식량문제를 어느 정도는 해결할 수 있으리라 생각된다.
현재까지 알려진 벼 형질전환 방법은 80년대에는 원형질체에 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol(PEG))과 전기충격법(electroporation)으로 많은 형질전환체를 획득하였으며, 90년대 후반에는 유전자총 이용법이 보편화되었으며 최근에는 쌍자엽식물에서 널리 이용되어 왔던 아그로박테리움(Agrobacterium ) 이용법도 많이 이용되고 있다. 그밖에 화분법(pollen pathway), 미세주사(microinjection) 방법 등이 있다.
벼 형질전환 효율에 영향을 미치는 프로모터(promoter)는 그 출처가 CaMV(Cauliflower mosaic virus), 벼, 옥수수, 콩 및 감자 등에서 클로닝된 것으로 형질전환 효율에 이바지하였다.
마커유전자 발현정도는 형질전환효율에 아주 중요한 영향을 끼치는데 그의 여러 요인은 효율적인 벡터, 적합한 프로모터, 식물게놈에서의 위치, 복제 수, 3' 비코딩서열(noncoding sequence), 코돈의 빈도 등이 있다. 프로모터는 전환유전자의 패턴을 결정하며 지금까지 2 종류 즉, 항시적인 것과 조직 특이적 프로모터가 사용되어 왔다. 이 항시적인 프로모터는 독립적으로 모든 조직에서 유전자발현을 한다. CaMV35S 프로모터는 강력하고 항시적인 것으로 흔하게 형질전환 연구에 사용되며 광범위하게 벼, 밀, 옥수수에서 사용되었다.
목표하는 조직에서의 유전자발현은 작물개량의 가능성을 시사하고 있는데 벼 는 현재 단자엽 식물에서 유전자발현과 프로모터 연구의 모델로서 이용되고 있으며 이미 밝혀진 요소와 DNA 결합인자간 기능적 상호작용을 이해하는데 크게 도움이 될 것이다.
벼의 형질전환에 대한 연구는 1980년대 후반에 원형질을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜방법이나 전기충격법으로 이용하여 자포니카에서 형질전환체를 획득한 것을 기점으로 인디카에서도 유전자 총, 아그로박테리움(Agrobacterium )을 이용하여 형질전환체를 얻을 수 있었다는 보고가 계속되고 있다. 특히 90년대에 들어서 선발유전자로도 알려진 제초제 저항성(bar)유전자는 농업적 유용유전자로도 사용하여 형질전환연구에 가장 많이 이용되고 있으며, 그 후 계속해서 새로운 농업유용유전자가 개발, 제작되어 벼 형질전환에 이용하고 있다.
이와 같은 조직 특이적인 프로모터에 대하여는, 미국특허 US 5,808,034 (Bridges 등, 1998. 09. 15 등록)에 외부의 화학물질에 특이적으로 촉진되는 발현저해자(repressor)를 이용하여 식물의 웅성기관에서 유전자의 다단계 조절(cascade)이 일어나도록 함으로써 생식능력을 조절하는 기술이 개시된 바 있다. 또한, 미국특허 US 6,784,289 (Ouellet 등, 2004. 8. 31 등록)에는 숙주 생명체에서 관여된 단백질의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있는 트랜스레이션 조절 인자의 발현 조절에 관한 기술이 개시되어 있다. 또한, 과일 표피 조직에 특이적으로 발현되는 프로모터(KR 813,118) 및 식물체의 뿌리조직에 특이적으로 발현되는 프로모터(KR 803,390)이 개시된 바가 있다. 벼의 경우에 있어서는 대한민국공개특허 KR 2003-0081377, KR 2001-0085990 등에 조직 특이적인 프로모터에 관한 기술이 기재 되어 있다.
식물의 분열조직에서 조직특이적 발현양상을 보이는 유전자에는 DME유전자가 알려져 있다. 현재 이 유전자의 기능이 명확히 밝혀져 있지는 않으나, 애기장대의 DME 유전자의 기능은 종자 생성을 위하여 수정할 시 특히 수정 전에 암술에서 특이적으로 발현하는 유전자로 세포분열이 일어날 때 일시적으로 발현이 되는 유전자로 알려져 있다.
현재 벼의 잎끝 및 뿌리의 분열조직에 특이적으로 발현되는 프로모터를 이용하여 유용한 외래 유전자를 발현시키는 시스템에 대해서는 개시된 바가 없다. 이들 조직은 벼의 생장에 있어서 중요한 역할을 담당하는 주요 조직이며, 이들 조직에서의 유용 유전자의 발현 또는 조절은 벼의 생장 및 수확과도 직결될 수 있다. 따라서, 유용 유전자 활성의 조절을 통해 생장에 관여되는 생리적 현상을 조절할 수 있는 직접적이면서도 적합한 기술로써 이들 조직에 특이적인 유전자 발현의 조절 기술이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 생장이 우수한 품종 개발을 위해 벼의 잎과 뿌리의 분열조직에 특이적으로 발현되는 프로모터를 개발하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼의 잎끝 및 뿌리의 분열조직에 특이적으로 발현되는 특성의 프로모터를 제공할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기의 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 (operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터를 제공할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 벡터에 의해 형질전환된 아그로박테리움 형질전환 체를 제공할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 벡터 또는 상기 아그로박테리움 형질전환체에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기의 형질전환체는 벼(Oryza sativa)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 식물을 형질전환시켜 상기 외래 유전자를 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는 식물의 형질전환 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계, 벼에 상기 발현벡터를 도입하는 단계 및 상기 발현벡터가 도입되어 벼의 잎끝 및 뿌리의 분열조직에서 외래 유전자가 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는, 벼의 잎끝 및 뿌리의 분열조직에 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체의 제조방법이 제공될 수 있다.
일 실시예에 다르면, 상기 벼에 발현벡터를 도입하는 단계는 상기 발현벡터로 아그로박테리움을 형질전환시키는 단계 및 형질전환된 아그로박테리움을 벼에 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼 형질전환체의 제조방법이 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 프로모터를 이용하여 생장이 우수한 품종 개발을 위한 분열촉진 유용 유전자를 잎과 뿌리의 분열조직에서 발현되도록 할 수 있는 벡터와 형질전환체를 얻을 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1: 게놈 DNA 의 PCR 에 의한 pDME1 프로모터 영역의 클로닝 및 염기서열 분석
1) 유전자 발현 조절 모티프(Motif) 검색 및 프로모터 영역의 PCR 증폭
PLACE(a database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) 프로그램을 이용하여 OsDME 유전자의 상위(upstream) 프로모터 부위의 모티프(Motif)를 검색하여 TATA box, CAAT box, GATA box, AMYBOX2 CBFHV, POLLEN1 등 (Prestridge, D.S, A computer program that scans DNA sequences for eukaryotic transcriptional elements, 1999)의 모티프를 포함하는 영역이 증폭 가능하도록 프라이머를 디자인한 후, PCR을 통해 OsDME 유전자의 프로모터 영역(pDME1)을 분리하였다.
벼의 잎에서 게놈 DNA를 추출(Qiagen사, DNeasy Plant Mini kit 사용)하여 OsDME 유전자의 프로모터 영역으로 예상되는 628bp의 단편을 증폭하기 위한 프라이머를 디자인하여 정방향 프라이머(sense primer) pDME-S : 5-ACTGGTCCTCGTTGGAAAGGCAGTA-3'(서열목록2)와 역방향 프라이머(antisense primer) pDME-AS: 5-TTCTGTAGAGGTGCAAGTCTAGATG-3'(서열목록3)를 합성하여 Takara사의 rTaq 중합효소(polymerase)와 함께 PCR 반응액에 넣어 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 이용된 PCR 반응조건은 95℃에서 10 분간 변성한 후, 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 2분을 25회 반복한 후 다시 확장 반응을 위하여 72℃에서 10 분간 처리하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% 아가로즈에 전기영동 한 후 pDME1 프로모터로 추정되는 밴드를 잘라내어 QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 정제한 후 클로닝(cloning)에 이용하였다.
2) Topo 2.1 vector(Invitrogen 사, TOPO TA Cloning kit) 에 클로닝
증폭된 유전자를 형질전환(transform)하여 X-gal 이 첨가된 LB배지에 도포하여 얻어진 흰색 콜로니(white colony)를 선발하여 콜로니(colony) PCR을 실시하였다. 그 결과 밴드가 확인된 콜로니의 플라스미드를 추출하여 시퀀싱에 이용하였다.
3) 염기서열 분석
ABI 3700 시퀀서를 이용하여 염기서열 분석한 후, NCBI의 BLAST 검색에 의해 상기 pDME1 유전자와 일치함을 확인하였다. (서열목록 1)
실시예 2: 벼 형질전환용 벡터( vector ) 제작
1) pDME1 유전자 운반체 제작
pDME1 유전자 운반체 제작에는 게이트웨이 클로닝 키트(Gateway® cloning, invitrogen사로부터 구입)를 이용하였다. 클로닝을 위해 정방향 프라이머 pDME1-S : 5-AAAAAGCAGGCTCCGAAATGTCTACACACT-3'(서열목록 4)과 역방향 프라이머인 pDME1-AS: 5-AGAAAGCTGGGTATTCTGTAGAGGTGCAAG-3'(서열목록 5)를 합성하였다. 이들 프라이머를 PCR 반응에 투입하여 95℃ 10분간 변성한 후 94℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 2분 조건으로 30회 반복하고 다시 72℃ 10분간 확장 반응하여 pDME1의 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 유전자들에 다시 어뎁터 프라이머(adapter primer)를 붙이기 위해 프라이머 attB1: 5-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'(서열목록6)과 attB2: GGGGACCACTTTGT ACAAGAAAGCTGGGT-3' (서열목록7)를 이용하여 95℃ 3분간 변성한 후 94℃ 30초, 45℃ 3초, 68℃ 2분 조건으로 2회 반복하고 94℃ 3초, 55℃ 3초, 68℃ 2분 조건으로 19회 반복한 후 68℃에서 10 분간 확장 반응하여 pDME1 유전자의 양 말단에 각각 어뎁터 프라이머를 붙여 증폭을 완성하였다.
2) 프로모터 발현용 pBGWFS7 벡터 제작
pDME1 유전자에 attB-adapter primer(Gateway® cloning 키트, Invitrogen사)를 붙인 후 BP Clonase II enzyme mix 2㎕와 혼합하여 25℃에서 1시간 이상 반응(http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cloning/Gateway-Cloning/GatewayC-Misc/Protocols.html#bp 참조)시켜 pDONR221 벡터(Invitrogen사)에 도입시킨 후 다시 LR Clonase II enzyme mix 2㎕와 혼합하여 25℃에서 1시간 이상 반응(http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and- Services/Applications/Cloning/Gateway-Cloning/GatewayC-Misc/Protocols.html#bp 참조)을 통해 목적 벡터인 pBGWFS7 벡터 (PSB 사, Plant System Biology)에 도입시켰다. 콜로니 PCR 과 시퀀싱으로 도입된 유전자를 확인한 후 벼에 형질전환하기 위하여 아그로박테리움(Agrobacterium) 감염에 의해 형질전환 하였다.
도 1에는 게이트웨이 시스템을 통해 제조된 벼 형질전환용 벡터의 모식도가 나타나 있다.
완성된 벡터를 아그로박테리움(LBA4404)에 형질전환하기 위하여 동결과 해동(freeze and thaw)을 2-3번 반복한 후, 37℃의 열충격(heat shock)방법에 의해 형질전환 한 후 YEP배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L)에서 철야배양(overnight)하여 콜로니를 확인하였다.
콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K2HPO4 60g, NaH2PO4 20g/1L), AB Salts(NH4Cl 60g, MgSO47H2O 6g, KCl 3g, CaCl22H2O 0.265g, FeSO4.7H2O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.
실시예 3: 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환
1) 벼 캘러스(callus)유도
아그로박테리움에 의한 벼 형질전환은 MS배지(Duchefa 사 Murashinge and Skoog vitamin 포함 배지)에서 벼의 캘러스를 유도하기 위하여 종자를 락스에 세척한 후 적당히 건조시켜 MS 배지에 2,4-D 호르몬이 첨가된 배지에 치상하였다. 27℃ 에서 3-4주간 암배양하여 캘러스를 유도한 후, MS에 2,4-D 호르몬이 첨가된 새 배지에 배형성 캘러스(embryogenesis callus)를 배양(sub-culture)하였다.
2) 아그로박테리움 감염
배형성 캘러스(embryogenesis callus)와 아그로박테리움 형질전환된 유전자를 AB 액체배지에 배양하여 20분간 살균(disinfection) 시킨 후 3일간 암배양 하였다. 멸균수에 cefotaxime을 첨가하여 아그로박테리움이 완전히 제거될 때까지 씻은 후 다시 MS 배지에 cefotaxime과 ppt(포스피토트리신, phosphinothricin)이 첨가된 배지에서 3주간 암 배양하였다. cefotaxime과 ppt가 첨가된 MS 배지에서 갈변되지 않고 살아남은 캘러스를 다시 cefotaxime과 ppt가 첨가된 MS 배지에 옮겨 2 주간 암배양 하였다. 캘러스에서 슈팅(shooting) 유도를 위해 MSR-cefotaxime과 ppt가 첨가된 배지에 옮겨 4주간 양 배양하여 슈팅된 후 발근이 되면 온실로 옮기기 이전에 순화처리를 실시하였다.
3) 종자 수확 및 후대 고정
약 5-7일간 순화시킨 후 얻어진 형질전환체(T0)는 온실에서 재배하여 종자를 수확한 후 후대 고정을 위하여 Basta(=ammonium glufosinate) 저항성으로 선발하여 3:1의 분리비를 확인하였다. pDME1 프로모터 분석을 위한 형질전환체는 T2세대의 종자에서 GUS 염색에 의해 발현분석 하였다.
도2에는 상기와 같이 아그로박테리움 감염을 통해 얻어진 식물체가 도시되어 있다.
실시예 4: pDME1 프로모터의 GUS 염색에 의한 발현 분석
GUS 염색에 의한 pDME1 프로모터 영역의 조직화학적(histochemistry) 검정을 통해, 이 프로모터에 의해 GUS리보터 유전자는 발아 후 3일부터 잎의 분열조직에서 발현되기 시작하여 6일 전 후로 뿌리의 분열조직에서 강하게 발현됨을 확인하였다.
도 3에는 발아 후 3일부터 6일 전후 GUS유전자의 발현으로 인해 발색반응을 보이는 식물체가 도시되어 있다.
실시예 5: pDME1 프로모터의 뿌리 측근 발현 분석
벼에 형질전환 시킨 pDME1 프로모터 영역의 발현을 관찰한 결과, 발아 후 6일 이후부터 측근이 나오는 시기에 pDME1 프로모터가 뿌리에서 강하게 발현함을 확인하였다.
도4는 발아 6일 내지 7일째 뿌리 측근에서 GUS가 강하게 발현되고 있는 양상이 나타나 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도1은 게이트웨이 시스템(Gateway system)을 이용하여 제조된 벼 형질전환용 벡터의 모식도를 나타낸다.
도2는 아그로박테리움(Agrobacterium) 감염 형질전환에 의해 얻어진 형질전환 식물체를 나타낸다.
도3은 pDME1 프로모터의 GUS 염색에 의한 수분 전과 후의 발현 양상을 나타낸다.
도4는 pDME1 프로모터의 뿌리에서의 발현 양상을 나타낸다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Recombinant expression vector comprising pDME1 promoter and transformant transformed therewith <130> NPF-15281 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 628 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 gaaatgtcta cacactttta aactagtgtt gtggtttgca agggatattc cttaaattat 60 ggaatttatt attgtggttt gcaagggaat ctaatttaaa ctaaactcca ctttacactt 120 taaagtctac aatctacaca cttaaagtag atattcctta aaactaggga atctattgtt 180 gtggtttgca agggaattta gtttaaagtg tcaagtgcac tttttattgt gagggaatct 240 acatttcctt ttaagtgttg tggttcattt gttgcttcct tagaatcctc acttagagag 300 aagattgaac tatataagtt gaaacaaatt tcgctcagac tggggtttat ttgtagaggt 360 gggattttgt tggagggatt ggggtttagt tctagagtag ttgcttgatt ataccctatt 420 tttcttgctt taatattttg agaaacacaa tcagaagtgt agttgcatgc aaccaattta 480 ctatgccatt ttcattatat tgtgattagt attgatcttt tgaatagtat atgaccatct 540 aaattgcgtc cttatgatat tgtcataggt gaaaacgacg ggaagctaac tagaaccgtg 600 cttcatctag acttgcacct ctacagaa 628 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDME-S <400> 2 actggtcctc gttggaaagg cagta 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDME-AS <400> 3 ttctgtagag gtgcaagtct agatg 25 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDME1-S <400> 4 aaaaagcagg ctccgaaatg tctacacact 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDME1-AS <400> 5 agaaagctgg gtattctgta gaggtgcaag 30 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 <400> 6 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 <400> 7 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벼의 잎끝 및 뿌리의 분열조직에 특이적으로 발현되는 특성의 프로모터.
  2. 제1항의 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터.
  3. 제2항의 벡터에 의해 형질전환된 아그로박테리움 형질전환체.
  4. 제2항에 따른 벡터 또는 제3항에 따른 아그로박테리움 형질전환체로 형질전환된 형질전환 식물체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 벼(Oryza sativa) 형질전환체임을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  6. 제2항의 벡터로 식물을 형질전환시켜 상기 외래 유전자를 식물체에서 발현시키는 단계를 포함하는 식물의 형질전환 방법.
  7. 하기의 단계들을 포함하는 벼의 잎끝 및 뿌리의 분열조직에 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체의 제조방법:
    서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된(operatively linked) 외래 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
    벼에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
    상기 발현벡터가 도입되어 벼의 잎끝 및 뿌리의 분열조직에 특이적으로 발현되는 벼 형질전환체를 선별하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 벼에 발현벡터를 도입하는 단계는 상기 발현벡터로 아그로박테리움을 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 아그로박테리움을 벼에 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼 형질전환체의 제조방법.
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