CN108034003A - 一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种用于生产表皮生长因子hEGF蛋白的烟草叶绿体表达载体pWYP23404。上述蛋白的制备方法包括以下步骤：构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404，EGF基因的烟草叶绿体转化与同质化筛选，得到烟草叶绿体转hEGF基因的同质化植株，叶绿体转基因烟草植株中hEGF表达量分析；表皮生长因子hEGF蛋白的纯化，得到叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白。本发明在烟草叶绿体中高效表达了hEGF的GFP融合蛋白具备了商业化生产的条件。

Description

一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法。
背景技术
生长因子是细胞合成和分泌的一类活性蛋白质，在动物体内组织中，细胞、生长因子及细胞外基质共处于一个动态环境之中，三者之间的多重相互作用构成了生长因子在体内发挥作用的微环境。通过对造血细胞发育的研究，发现生长因子可通过诱导或调节基因的表达作用于细胞的增殖与分化。随着各种生长因子及其生物学特性被不断揭示，关于生长因子在改善各种生理、病理状态，促进组织再生、创伤修复及愈合过程等方面的研究数据不断积累，在医药等应用领域发挥着越来越重要的作用。同时，生长因子的研究也已成为生物化学、细胞生物学、医学及组织工程学等诸多学科的研究热点问题。
表皮生长因子(EGF)是高等动物体内的一种多肽调节因子，由53个氨基酸残基组成，能促进表皮、内皮细胞等多种细胞的生长，提高DNA和蛋白质的合成效率。临床上可用以治疗皮肤创伤、烧伤、角膜损伤及消化性溃疡等。然而人体内生长因子的天然含量极低，每千克组织仅可提取得到微克水平的生长因子，而至今又未找到丰富的组织来源。因此，通过基因工程手段表达上述生长因子具有十分重要的理论研究意义和市场应用前景。
叶绿体具有半自主遗传的特点，叶绿体转化是将外源基因通过同源重组的方法整合到叶绿体基因组上并在叶绿体中表达的操作过程。叶绿体转化法排除了植物受体表达差异的影响，并且叶绿体遗传为母系遗传，不受核基因的影响，不会发生像核转化的“基因飘移”造成的生态风险。此外，叶绿体表达消除了基因沉默的影响，且植物中叶绿体基因组的拷贝数很高，理论上每个被转化的叶绿体中，外源基因的拷贝数可以达到1-2万个，因此外源基因的表达量水平可以积累到很高的水平，与传统的微生物发酵体系相比较，生产成本低廉，因而成为理想的生物反应器。此外，叶绿体基因工程生产的大多数蛋白质可完成二硫键交联、正确折叠等转录后修饰，具有正确的空间构象和生物活性，为商业化生产医用蛋白奠定了基础。Staub等(Staub J M,Garcia B,Graves J,et al.Hi gh yield productionof a human therapeutic protein in tobacco chlorop last[J].Nat Biotechnol,2000,18:333-338.)人将生长素基因导入烟草叶绿体基因组中，转基因烟草表达出的人生长素比核转化系统高300倍，且具有正常的生物学活性。2004年，Daniell等(Daniell H,Medic al molecular Pharming,Encyclpedia of plant and crop science.2004:705-710)将胰岛素生长因子IGF21基因转入烟草叶绿体中，得到成熟的IGF21，表达量占可溶蛋白的32％，重要的是在叶绿体内IGF21可以形成正确的二硫键，而在大肠杆菌内则不能形成。
在已有的文献报道中，尽管利用植物叶绿体表达外源基因的表达量大部分好于核转基因植株，但仍有部分事例证明通过该技术获得的转基因植株中外源蛋白表达水平欠佳。绝大多数试验可以通过更换合适的启动子、终止子、5`UTR等调控元件来改善情况，但有报道称EGF基因(Wirth,S.,M.E.Segretin,A.Mentaberry and F.B.Almonacid.2006.Accumulation of hEGF and hEGF-fusion proteins in chloroplast-transform edtobacco plants is higher in the dark than in the light.Biochemical &Biophysical Research Communications,125(2):159-172.)在融合GUS基因的条件下，融合蛋白的表达量也只有总可溶性蛋白的0.001％，而没有融合GUS基因的EGF表达，甚至检测不到。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还公开了一种编码上述叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还公开了一种用于生产表皮生长因子hEGF蛋白的烟草叶绿体表达载体pWYP23404，该载体以16S-trnI和trnA-23S为左右同源序列，其间插入化学合成的Prrn-T7g10-GFP&EGF-aadA-Trps16表达盒；其中，Prrn启动子和Trps16终止子分别为烟草叶绿体基因组的16S rRNA启动子和rhct1基因mRNA 3'端成熟序列(GenBank登录号：NC_001879)；所含的三个基因融合标签基因GFP、目的基因EGF和筛选基因aadA均利用DNA2.0软件进行了密码子优化；在smgfp基因上游和aadA基因下游分别插入同源重组酶识别的attP位点和attB位点。
本发明还公开了一种上述叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404；
2)EGF基因的烟草叶绿体转化与同质化筛选，得到烟草叶绿体转hEGF基因的同质化植株；
3)叶绿体转基因烟草植株中hEGF表达量分析；
4)表皮生长因子hEGF蛋白的纯化，得到叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白。
进一步地，所述步骤1)中的构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404具体步骤如下：
1.1)、优化表皮生长因子hEGF，得到优化后的表皮生长因子hEGF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
1.2)、构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404：利用化学合成法全基因合成表达框，表达框包含以下两部分：作为融合蛋白标签的绿色荧光蛋白基因的C端添加柔性连接肽链与肠激酶识别位点构成的linker，即氨基酸序列为GSSSGSSSGSSSGSSSDDDDK；而作为筛选标记基因的壮观霉素抗性基因置于带有绿色荧光蛋白基因融合标签的目的基因之后，共同构成由烟草叶绿体启动子Prrn启动、烟草叶绿体终止子Trps16终止的多顺反子表达框，其中，烟草叶绿体启动子Prrn含有核糖体结合位点T7g10序列；
1.3)人工合成的表达框在完成目的基因的插入后，利用Nsi I进行酶切消化处理后产生的片段与相同酶处理的携带克隆烟草叶绿体基因组中“16Srrn-trnI-trnA-23Srrn的大片段”的克隆载体pEASY-Nt进行连接反应，使人工合成的表达框插入trnI基因和trnA基因之间，最终获得用于生产表皮生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWYP23404。
进一步地，所述步骤4)中的表皮生长因子hEGF蛋白的纯化筛选具体为：将总可溶性蛋白经0.22μm滤膜抽滤后，置于截流分子量为50KD的超滤离心管中，4000g离心30min，取流出液，再置于截流分子量为30KD的超滤离心管中4000g离心45min后，截留部分液体即为N端融合GFP标签的EGF生长因子的初步纯化产物，利用肠激酶消化，使生长因子与GFP标签蛋白分离开，再用肝素-Sepharose亲和层析柱进行纯化，得到叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明在烟草叶绿体中高效表达了hEGF的GFP融合蛋白，表达量达到了总可溶性蛋白的7.48％，具备了商业化生产的条件。
2)本发明纯化分离纯化了融合蛋白，并通过肠激酶切割，得到了游离的hEGF生长因子的实验室产品，产品的纯度分别达到了95.5％。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明载体构建示意图；其中，linker的氨基酸序列为GSSSGSSSGSSSGSSSDDDDK；Target gene为EGF时，叶绿体表达载体为pWYP23404；smGFP：可溶修饰型绿色荧光蛋白基因；aadA：氨基糖苷-3'-腺苷转移酶基因；Prrn、Trps16：源于烟草叶绿体基因组的调控元件；T7g10：T7噬菌体基因10的引导序列；attP、attB：重组酶识别位点；P1、P2是PCR检测引物(P1：5'-GGTCGGAACAAGTTGATAG-3'，P2：5'-CAGTAGAGTCTTTCAGTGGC-3')，野生型预计扩增片段约为1.2kb，转化株预计扩增片段约为3.9kb；BamH I和Kpn I用于Southern杂交检测的酶切反应，trnI与trnA间约1.4kb的片段为杂交探针；
图2是本发明叶绿体转化植株的同质化筛选、分子检测和T1代抗性鉴定；A：首轮筛选获得的叶绿体转EGF基因的烟草抗性植株；B：经过连续3轮高压筛选获得的叶绿体转EGF基因的烟草抗性植株的Southern杂交结果；其中，M标准分子量对照，-为野生型植株，1-4为转基因植株；
C：经过连续3轮高压筛选获得的叶绿体转EGF基因的烟草抗性植株的SDS-PAGE结果，P为GFP蛋白，wt为野生型植株，1-4为转基因植株；D：经过连续3轮高压筛选获得的叶绿体转EGF基因的烟草抗性植株的western杂交结果，P为GFP蛋白，wt为野生型植株，1-4为转基因植株；
图3是本发明蛋白标签绿色荧光蛋白GFP的活体检测；
图4是本发明叶绿体表达的3种生长因子蛋白纯品及其活性检测；其中，A：叶绿体表达的生长因子蛋白冻干粉；B，C：生长因子促进3T3细胞增殖实验，初步证实了所获得的生长因子具有细胞活性；PBS，PBS缓冲液作对照；C hEGF为市售商品化的hEGF；PD hEGF为叶绿体来源的hEGF。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1表皮生长因子的烟草叶绿体表达载体pWYP23404(EGF)的构建
1)利用现代生物信息学技术对NCBI数据库中的人源的表皮生长因子(humanEpidermal growth factor，hEGF)基因的核苷酸序列进行优化设计。在保持氨基酸序列不发生改变的前提下，利用Gene Designer将编码基因的所有密码子采用烟草叶绿体密码子最适编码方式进行密码子替换，对经修饰后的基因序列再通过DNAMAN7.0和Vector NTI10.0软件分析其中的酶切位点信息，将表皮生长因子编码基因的第35位氨基酸Ile的编码密码子由第1最适密码子TAT，变更为第2最适密码子TAC以消除EcoR I酶切位点，修饰后的人源的表皮生长因子(human Epidermal growth factor，EGF)基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2)利用化学合成法全基因合成表达框。表达框包含以下两部分：作为融合蛋白标签的绿色荧光蛋白基因(GFP)的C端添加柔性连接肽链与肠激酶识别位点构成的linker，即氨基酸序列为GSSSGSSSGSSSGSSSDDDDK以方便以防止蛋白合成过程中进行空间折叠引发的问题和分离提取目的蛋白后对GFP标签的切除，目的基因通过预留的Cla I和Xba I酶切位点成功与GFP基因进行融合；而作为筛选标记基因的壮观霉素抗性基因(aadA)置于带有GFP融合标签的目的基因之后，共同构成由烟草叶绿体启动子Prrn(含核糖体结合位点T7g10序列)启动，烟草叶绿体终止子Trps16终止的多顺反子表达框。
3)人工合成的表达框在完成目的基因的插入后，利用Nsi I进行酶切消化处理后产生的片段与相同酶处理的携带克隆烟草叶绿体基因组中“16Srrn-trnI-trnA-23Srrn的大片段的克隆载体pEASY-Nt进行连接反应，使人工合成的表达框插入trnI基因和trnA基因之间，最终获得用于生产表皮生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWYP23404(EGF)。
按照上述方法，本发明构建了烟草叶绿体转化载体pWYP23404，如图1所示。该载体以16S-trnI和trnA-23S为左右同源序列，其间插入化学合成的Prrn-T7g10-GFP&EGF-aadA-Trps16表达盒。其中，Prrn启动子和Trps16终止子分别为烟草叶绿体基因组的16S rRNA启动子和rhct1基因mRNA 3'端成熟序列(GenBank登录号：NC_001879)；所含的三个基因融合标签基因GFP、目的基因EGF和筛选基因aadA均利用DNA2.0软件进行了密码子优化。在smgfp基因上游和aadA基因下游分别插入同源重组酶识别的attP位点和attB位点，目的是用于后续切除筛选标记基因。
实施例2：EGF基因的烟草叶绿体转化与同质化筛选
用载体pWYP23404包裹金粉进行基因枪轰击。具体操作参见专利一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法(申请号：201510310239.3，申请日：2015-06-08，公开号：CN104946656A)。
A.烟草外植体准备
烟草种子用70％乙醇泡30sec，期间轻轻摇晃；小心弃去乙醇，加入0.1％HgCl2，轻轻摇晃2min；小心弃去HgCl2溶液，加无菌水漂洗3次，每次1min。最后一次漂洗后先留下少些部分水，将种子悬浮起来，倾倒到若干层无菌滤纸上，吸干水，用镊子小心把种子接种到1/2MSO培养基上，在恒温25℃，光周期为光照16h/黑暗8h的培养室内培养。
叶绿体转化用PDS 1000/He基因枪(美国Bio-Rad公司)进行：金粉颗粒直径为0.6μm，轰击距离为9cm，采用1100psi可裂膜，金粉微弹按每毫克金粉用0.2μg质粒DNA包裹。具体如下：
B.微弹的制备和金粉的包裹
1、精确称量20mg直径为0.6μm的金粉，小心转移至1.5mL的进口离心管中。
2、向装有金粉的离心管中加入200mL无水乙醇，涡旋振荡3次，每次2min，间隔1min。
3、震荡处理后，将离心管置于室温条件下静置10分钟。
4、室温条件下，12,000g离心1min。
5、用移液器小心吸走上清液，在向装有金粉的离心管中加入200μL无菌水，涡旋振荡30秒，使金粉充分重悬。
6、室温条件下，12,000g离心1min。
7、重复步骤5、6两次。
8、用移液器小心吸走上清液，在向装有金粉的离心管中加入200μL无菌水，涡旋振荡30秒，金粉充分重悬后备用。
9、用移液器吸取制备经过上述处理的金粉悬液100μL至经高温灭菌过的1.5mL的进口离心管中，并向其中加入10μL浓度至少1μg/μL的烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03，冰上涡旋振荡30sec。
10、继续用移液器向离心管中添加100μL浓度为12.5M的CaCl2溶液，并在冰上涡旋振荡30sec以便使液体充分混匀。
11、用移液器缓慢将40μL浓度为0.1M的亚精胺溶液加入到离心管中，同时用枪头搅拌混匀。
12、将振荡混匀器置于4℃的陈列柜或冰箱中，并将离心管振荡混匀30min。
13、室温12,000g高速离心1min，小心移去上清。
14、用移液器向离心管中添加500μL无水乙醇，并用枪头轻轻吹洗沉淀。
15、于4℃的陈列柜或冰箱中，将离心管涡旋振荡15sec，使沉淀彻底重悬。
16、室温12,000g高速离心1min，小心移去上清。
17、用移液器向离心管中添加100μL无水乙醇，涡旋振荡15sec，使金粉充分悬浮备用。
18、将铁环、承载膜、可裂膜、阻挡网等工具用无水乙醇浸泡30min后，于超净工作台中风干，并将承载膜装入铁环中，用移液器取10μL点于微粒载膜中央，使其尽量平铺干燥后待用。
C.基因枪轰击
1、选取野草无菌苗第3-4片、叶片直径约为3cm的健康叶片作为外植体，剪下后背面朝上放在恢复培养基上，暗环境下培养4小时。
2、将待用的1100psi可裂膜和微粒载片先在无水乙醇中浸泡30分钟，然后在无菌操作台中风干待用。
3、使用70％的酒精擦洗无菌操作台的台面、内壁和基因枪内外，擦拭之后打开紫外灯灭菌至少30min以上。
4、关闭紫外灯，开启无菌风循环系统，并打开真空泵和基因枪的供电开关。
5、用扳手旋开装有氦气的高压气瓶的阀门，调节氦气压力阀门，使供气口氦气气压高于1300psi。
6、打开轰击室外门，将可裂膜挡盖取下来，用镊子将可裂膜置于其内侧卡槽里，再重新将挡盖安装上。
7、取出微粒发射装置并旋下外盖，依次放入阻挡网和装有携带金粉的承载膜的铁环，使承载膜沾有金粉的一面朝向下方(即待轰击的植物材料一侧)，重新旋上外盖并将微粒发射装置沿卡槽推入轰击室。
8、将装有待轰击的植物材料的培养皿放置在样品盘上插入到轰击室的适当卡槽位置，每个卡槽之间距离为3cm，微粒发射装置和样品盘之间间隔几个卡槽即表明轰击距离为3×n cm，关闭轰击室的外门并仔细检查是否密封。
9、按照基因枪操作规则，依次进行如下操作，打开VAC开关(上挡)开始抽真空，直至真空压力表读数为所需值(27～28niHg)并不再增加时，将开关迅速调整到HOLD开关处(下挡)，然后长按FIRE开关向基因枪内注入氦气，当注入的氦气压力达到可裂膜能够承受的最大压力时，可裂膜破裂氦气通过基因枪室进入并将承载膜上的金粉打入植物材料中，此时松开FIRE开关。
10、将开关移动到VENT处(中间挡)，释放轰击室内外的大气压力，当真空压力表读数恢复到0时，即可打开轰击室外门。
11、打开轰击室门，取出样品盘上装有经基因枪轰击过的植物材料的培养皿，盖上培养皿盖并用封口膜封口。
12、取出微粒发射装置并将之前装入的铁环和阻挡网取出重新浸泡于无水乙醇中。
13、将可裂膜挡盖取下，用镊子将破损的可裂膜或可裂膜碎片取出。
14、重复步骤6-13，直至所有材料的基因枪轰击过程结束。
15、关闭氦气瓶的主阀，长住FIRE开关放掉基因枪室与氦气瓶之间的导气管和气体加速管内的氦气，当压力表读数为0时，依次切断基因枪、真空泵、超净工作台的电源。
D.同质化筛选
第一轮筛选：轰击过的叶片背面朝上在恢复养基上25℃暗培养3天。暗培养后，将叶片切成5mm×5mm的小片，背面朝下放在筛选培养基Ⅰ(含500mg/L壮观霉素)上，以16h光照、8h黑暗的光周期25℃培养，每20天更换培养基。产生不定芽后，用365nm紫外灯检测，将产生绿色荧光的不定芽剪下，置于生根培养基Ⅰ(含500mg/L壮观霉素)上。PCR检测选择性标记基因GFP、aadA以及目的基因EGF。
第二轮筛选：选取转基因植株中绿色荧光较强的植株，将其叶子切成5mm×5mm的小片，背面朝下放在筛选培养基Ⅱ(含625mg/L壮观霉素)上，以16h光照、8h黑暗的光周期25℃培养，每20天更换培养基。产生不定芽后，剪下不定芽在生根培养基Ⅱ(含625mg/L壮观霉素)上生根。PCR检测其同质化程度。
第三轮筛选：选取经PCR检测转化率高的植株，将其叶子切成5mm×5mm的小片，背面朝下放在筛选培养基Ⅲ(含750mg/L壮观霉素)上，如上述方法进行筛选；此筛选在出不定芽后重复一次，最后获得的不定芽在生根培养基Ⅲ(含750mg/L壮观霉素)上生根。PCR检测其同质化程度。
第四轮筛选：选取经PCR检测转化率高的植株，将其叶子切成5mm×5mm的小片，背面朝下放在筛选培养基Ⅳ(含1000mg/L壮观霉素)上，如上述方法进行筛选；此筛选在出不定芽后重复一次，最后获得的不定芽在生根培养基Ⅳ(含1000mg/L壮观霉素)上生根。PCR检测其同质化程度，并通过southern杂交验证同质化检测结果。
PCR检测方法如下：PCR反应使用引物P1和P2在烟草叶绿体基因组上的位置见图1所示。PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性20sec，56℃退火20sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃后延伸5min。
Southern blot分析方法如下：取4μg叶绿体DNA用BamH I和Kpn I酶切，0.8％琼脂凝胶80V电泳3个小时后转移到硝酸纤维素膜上，紫外交联两次，每次30秒，间隔2分钟。按照Roche公司试剂盒提供的方法进行Southern杂交分析，探针为trnI-trnA区段BamH I和KpnI内切酶之间约1.4kb的片段。具体操作参见专利一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法(申请号：201510310239.3，申请日：2015-06-08，公开号：CN104946656A)。
外源蛋白表达分析如下：按专利一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法(申请号：201510310239.3，申请日：2015-06-08，公开号：CN104946656A)的方法提取总可溶性蛋白。
SDS PAGE和Western blot分析如下：提取转基因烟草植株和野生型植株的蛋白粗提液，分别取蛋白溶液10μl与等量2×上样缓冲液混合，沸水温浴5min，取10μl混合液上样，在12％的SDS-PAGE凝胶中电泳分离。电泳时80V电压预电泳1h，之后160V电压至电泳结束。同时跑两块胶，其中一块用考马斯亮蓝染色，另一块利用BIO-RAD公司的半干电转装置转移到PVDF膜上，具体操作参见专利一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法(申请号：201510310239.3，申请日：2015-06-08，公开号：CN104946656A)。
ELISA分析如下：用Branford法测定蛋白粗提液的浓度，然后分别用anti-GFP抗体进行ELISA分析，具体操作参见专利一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法(申请号：201510310239.3，申请日：2015-06-08，公开号：CN104946656A)。
通过基因枪法将表达载体导入烟草叶绿体基因组中，经过500mg/L的壮观霉素筛选获得了抗性再生芽点(图2A)。进一步筛选获得的抗性植株经Southern杂交分析，除叶绿体转EGF基因的烟草抗性植株中3为非同质化植株，其余均为同质化植株。叶绿体基因组用BamH I和Kpn I酶切后电泳转膜。我们可以预测，野生型对照植株应该在约2.4kb的位置出现杂交信号，而转基因植株如果处于同质化的纯合状态，只能在约5.2kb处检测到杂交信号，而异质化植株则会同时出现5.2kb和2.4kb两个杂交信号。如图2B所示，Southern杂交显示叶绿体转EGF基因的烟草抗性植株中3同时出现5.2kb和2.4kb两个杂交信号，为异质化植株。其余均为同质化植株。
为了检测目的基因的表达量，我们还进行了SDS-PAGE和Western杂交，结果见图2C和图2D。生长因子的叶绿体转基因植株出现杂交信号，且其杂交信号分子大小均大于GFP蛋白且与预期大小相符。
同质化植株移栽到温室中，正常管理，收获种子。T1代种子经10％过氧化氢灭菌并在湿润的滤纸上萌发后，移植含有500mg/L壮观霉素的MS培养基培养基1周并观察植株生长状况。
实施例3蛋白标签绿色荧光蛋白GFP的活体检测
对转基因材料进行整株荧光分析，具体操作参见专利一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法(申请号：201510310239.3，申请日：2015-06-08，公开号：CN104946656A)。
对转基因植株表达的目的蛋白N端的GFP标签进行荧光检测。在365nm的紫外光下，转基因植株在暗室中发出强烈的绿色荧光，表明绿色荧光蛋白获得大量表达，而对照株则表现为自发红光荧光(图3)。
实施例4叶绿体表达的生长因子蛋白的分离、提取与GFP标签的去除
分别提取非转基因对照和转基因同质化植株的成熟叶片，在液氮中研磨成粉末，每克叶片加入5mL的PBS缓冲液提取植株叶片中可溶性总蛋白，经0.22μm滤膜抽滤后，置于截流分子量为50KD的超滤离心管中，4000g离心30min，取流出液，再置于截流分子量为30KD的超滤离心管中4000g离心45min后，截留部分液体即为N端融合GFP标签的EGF生长因子的初步纯化产物。
利用肠激酶消化，使生长因子与GFP标签蛋白分离开，再用肝素-Sepharose亲和层析柱进行纯化，纯化后的蛋白利用Balb/c 3T3细胞对上述生长因子进行细胞增殖实验，以检测其是否具有活性。
提取转基因同质化植株的成熟叶片，在液氮中研磨成粉末，每克叶片加入5mL的PBS缓冲液，提取叶片中可溶性总蛋白，经0.22μm滤膜抽滤后，置于截流分子量为50KD的超滤离心管中，4000g离心30min，取流出液，再置于截流分子量为30KD的超滤离心管中4000g离心45min后，截留部分液体即为N端融合GFP标签的EGF生长因子的初步纯化产物。纯化前后经ELISA检测，蛋白损失比例控制在30％以内，含GFP标签的重组蛋白约占纯化后蛋白的73％以上。
利用肠激酶消化，使生长因子与GFP标签蛋白分离开，再用肝素-Sepharose亲和层析柱进行纯化，经条件摸索证实，用含有0.5mol/L的NaCl和10mmol/L的PB组成的缓冲液洗脱生长因子，可获得最佳纯化效果和高回收效率，获得纯度为95.5％的EGF，经冻干处理后获得初级实验室产品(图4A)。纯化后的蛋白利用3T3细胞对上述生长因子进行细胞增殖实验，结果如图4C所示，与阴性对照比较，生长因子均具有明显的促进3T3细胞增殖效果，而进一步对比试验中发现利用本研究所述方法获得的EGF较商品化的EGF在细胞增殖活性方面提高15.7％(图4B)，上述实验结果证实利用叶绿体生物反应器生产的hEGF具备作为药用蛋白原料的潜力。本发明在烟草叶绿体中高效表达了hEGF的GFP融合蛋白，表达量达到了总可溶性蛋白的7.48％，具备了商业化生产的条件。本发明纯化分离纯化了融合蛋白，并通过肠激酶切割，得到了游离的hEGF生长因子的实验室产品，产品的纯度分别达到了95.5％。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法
<130> 2017
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 165
<212> DNA
<213> 表皮生长因子(Epidermal growth factor)
<400> 1
atgaattctg attctgaatg tcctttatct catgatggat attgtttaca tgatggagta 60
tgtatgtata ttgaagcttt agataaatat gcttgtaatt gtgtagtagg atatattgga 120
gaaagatgtc aatatagaga tttaaaatgg tgggaattaa gataa 165
<210> 2
<211> 54
<212> PRT
<213> 表皮生长因子(Epidermal growth factor)
<400> 2
Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu
1 5 10 15
His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys
20 25 30
Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu
35 40 45
Lys Trp Trp Glu Leu Arg
50

Claims (6)

1.一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.编码权利要求1所述的叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种用于生产表皮生长因子hEGF蛋白的烟草叶绿体表达载体pWYP23404，其特征在于，该载体以16S-trnI和trnA-23S为左右同源序列，其间插入化学合成的Prrn-T7g10-GFP&EGF-aadA-Trps16表达盒；其中，Prrn启动子和Trps16终止子分别为烟草叶绿体基因组的16S rRNA启动子和rhct1基因mRNA 3'端成熟序列(GenBank登录号：NC_001879)；所含的三个基因融合标签基因GFP、目的基因EGF和筛选基因aadA均利用DNA2.0软件进行了密码子优化。
4.一种权利要求1所述的叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404；
2)EGF基因的烟草叶绿体转化与同质化筛选，得到烟草叶绿体转hEGF基因的同质化植株；
3)叶绿体转基因烟草植株中hEGF表达量分析；
4)表皮生长因子hEGF蛋白的纯化，得到叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白。
5.根据权利要求4所述的叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404具体步骤如下：
1.1)、优化表皮生长因子hEGF，得到优化后的表皮生长因子hEGF，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；
1.2)、构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404：利用化学合成法全基因合成表达框，表达框包含以下两部分：作为融合蛋白标签的绿色荧光蛋白基因的C端添加柔性连接肽链与肠激酶识别位点构成的linker，即氨基酸序列为GSSSGSSSGSSSGSSSDDDDK；而作为筛选标记基因的壮观霉素抗性基因置于带有绿色荧光蛋白基因融合标签的目的基因之后，共同构成由烟草叶绿体启动子Prrn启动、烟草叶绿体终止子Trps16终止的多顺反子表达框，其中，烟草叶绿体启动子Prrn含有核糖体结合位点T7g10序列；
1.3)人工合成的表达框在完成目的基因的插入后，利用Nsi I进行酶切消化处理后产生的片段与相同酶处理的携带克隆烟草叶绿体基因组中“16Srrn-trnI-trnA-23Srrn的大片段”的克隆载体pEASY-Nt进行连接反应，使人工合成的表达框插入trnI基因和trnA基因之间，最终获得用于生产表皮生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWYP23404。
6.根据权利要求4所述的叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中的表皮生长因子hEGF蛋白的纯化筛选具体为：将总可溶性蛋白经0.22μm滤膜抽滤后，置于截流分子量为50KD的超滤离心管中，4000g离心30min，取流出液，再置于截流分子量为30KD的超滤离心管中4000g离心45min后，截留部分液体即为N端融合GFP标签的EGF生长因子的初步纯化产物，利用肠激酶消化，使生长因子与GFP标签蛋白分离开，再用肝素-Sepharose亲和层析柱进行纯化，得到叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白。
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