CN111635908B - 一种kda2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。本发明从番茄中分离和克隆到KDA2基因，构建了番茄KDA2基因的亚细胞定位重组载体pK7FW2‑KDA2、基因敲除重组载体pTX‑KDA2、基因敲除重组菌株LBA4404‑pTX‑KDA2及番茄KDA2基因敲除纯合株系，本发明证实了敲除KDA2基因可以有效提高番茄抗灰霉菌侵染的能力，并且番茄KDA2基因敲除株系与野生型株系相比，叶片上的病斑直径明显减小。本发明通过实验证实KDA2基因在提高番茄抗灰霉病方面具有应用价值，并为利用KDA2基因培育抗病植株奠定良好的理论和应用基础。

Description

一种KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。

背景技术

番茄是我国重要的经济作物，由半知菌亚门葡萄孢属的灰葡萄孢（又名灰霉菌）引起的番茄灰霉病是番茄生产中的重要病害之一，是威胁番茄生产的一种毁灭性的腐生型真菌性病害。灰霉菌不仅侵染番茄的果实，还会侵染番茄的茎、叶、花等不同的部位，且传播速度快，严重影响番茄的产量和经济效益。灰葡萄孢还有易变异和多型性的特点，容易受环境和寄主的影响而产生新的变异。目前对番茄灰霉病的防治主要是化学防治和农业防治，但防治效果均不理想，因此需要深入研究植物的的抗病机制及其与病原互作的分子机制，为通过基因工程手段控制番茄灰霉病的发生提供依据，从而为番茄灰霉病的防治提供新的思路。

蛋白质赖氨酸乙酰化修饰是一种可逆而且高度调控的蛋白质翻译后修饰方式，它主要发生在组蛋白赖氨酸残基的ε-NH2位，由乙酰基转移酶（HAT）与(HDAC)调控。目前，真核生物中的去乙酰化酶HDACs分为三大家族：一类是依赖于Zn²⁺的去乙酰化酶，该家族成员在二级结构上与酵母的RPD3/ HDA1 蛋白表现出极大的相似性；一类是与NAD⁺有关的酵母SIR2 的同源蛋白，主要包括SIRTⅠ～Ⅶ 7 个SIRT 家族成员。在植物中还存在一类植物特有的去乙酰化酶家族HD家族，该家族并未在酵母或者动物体内发现。

有证据显示非组蛋白乙酰化几乎参与了所有的生物过程。Nε乙酰化能改变蛋白的大小、电荷或者构象，这些变化会影响蛋白的DNA亲和性、蛋白的稳定性、蛋白-蛋白互作、蛋白的定位和蛋白功能，Nε 乙酰化甚至能影响蛋白的其它翻译后修饰。调控非组蛋白的乙酰化修饰的的酶被命名为赖氨酸乙酰化转移酶（Lysine acetyltransferase，KAT）和赖氨酸去乙酰化酶 （Lysine deacetylase，KDAC），目前植物中有关KDAC 参与非组蛋白乙酰化修饰的研究不多，且大部分局限于模式植物拟南芥，这些酶大多并不定位于细胞核。如拟南芥的去乙酰化酶 HDA14 定位于叶绿体和线粒体，AtSRT2定位于线粒体，HDA5、HDA8、HDA18 定位于细胞质。

生物信息学研究表明，番茄中共有15个去乙酰化酶。其中预测的亚细胞定位除了SlSRT2、SlHDA2、SlHDA5、SlHDA7和SlHDA10外，其余均定位于细胞核或细胞质。其中SlHDA2为RPD3/HDA1家族，该蛋白含有HDAC结构域，为Zn²⁺依赖型去乙酰化酶，预测的亚细胞定位为过氧化物酶体，因为将其命名为KDA2。但是到目前为止，有关该基因的真实亚细胞定位及其在植物抗病过程中的作用没有任何报道。

发明内容

本发明提供了一种KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。本发明从番茄中分离和克隆到KDA2基因，构建了KDA2基因的亚细胞定位载体pK7FW2-KDA2和敲除重组载体pTX-KDA2及其敲除纯合株系，并且证实了KDA2基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。

进一步的，所述KDA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述应用包括以下步骤：

（1）构建KDA2基因敲除重组载体：根据KDA2基因的CDS序列设计引物后，并以质粒pTX-043为模板，进行PCR扩增；扩增产物回收纯化后，使用限制性内切酶BsaI对其进行酶切，回收酶切产物后与pTX-041质粒进行连接，得到KDA2基因敲除重组载体；

（2）构建KDA2基因敲除重组菌株：将所述KDA2基因敲除重组载体转化至农杆菌LBA4404中，培养得到KDA2基因敲除重组菌株；

（3）构建KDA2基因敲除株系：将所述KDA2基因敲除重组菌株转化进植物子叶中，使用抗生素Kan对转化的愈伤组织进行筛选，并培养至得到再生植物，即得到KDA2基因敲除株系。

进一步的，所述步骤（1）中引物的序列为

KDA2-F0：5’-ATATATGGTCTCGTTTGGCCGTAATCATATTCGCCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；

KDA2-R0：5’-ATTATTGGTCTCGAAACTAGTCGCCGGAAACGGTTCACAAACTACACTGTT AGATTC-3’。

进一步的，所述KDA2基因敲除重组载体为pTX-KDA2。

进一步的，所述农杆菌为LBA4404。

进一步的，所述步骤（3）中培养的条件为16h光照（26℃）/8h黑暗（18℃）。

进一步的，所述KDA2基因敲除株系与野生型株系相比，叶子上的病斑直径明显减小。

进一步的，所述植物为番茄。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明从番茄中分离和克隆到KDA2基因，并获得KDA2基因的亚细胞定位载体pK7FW2-KDA2，并进一步将KDA2基因靶点信息连接到CRISPR/Cas9基因敲除载体pTX-041上，获得KDA2基因敲除重组载体pTX-KDA2，再利用农杆菌得到基因敲除重组菌株LBA4404-pTX-KDA2，并侵染转化番茄子叶，得到纯合的KDA2基因敲除株系，通过研究基因敲除转基因株系的表型，并将其与相同条件下生长的野生型番茄叶子上的病斑进行比较。本发明通过实验分析首次证明了KDA2基因具有调控番茄对灰霉病抗病性的功能，而敲除KDA2基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力，KDA2基因敲除纯合株系叶子上的病斑明显减小。本发明的技术方案对KDA2基因在提高番茄对灰霉病的抗病性上具有应用价值，同时也为利用KDA2基因培育抗病、高产的番茄品种奠定良好的理论和应用基础。

附图说明

图1A为KDA2基因的PCR扩增及电泳检测结果，其中M为DNA marker；1、2和3均为pTX-KDA；

图1B为KDA2亚细胞定位载体pK7FW2-KDA2-GFP阳性克隆的筛选结果。

图2为KDA2的亚细胞定位结果。

图3为KDA2基因T2代纯合敲除突变体突变位点序列比较结果。

图4为KDA2纯合敲除突变体的抗病性变化结果及叶片上病斑直径的结果，（**p<0.01）。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为市售商品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的PQB载体、pTX-041载体、pK7FW2载体、RFP-HDEL载体和pTX-043载体为市售商品。

实施例1：番茄KDA2基因的扩增及亚细胞定位

1、番茄KDA2基因的扩增

在GeneBank数据库中获得番茄KDA2基因的CDS序列，其长度为1347 bp，编码含有449个氨基酸的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

根据找到的番茄KDA2基因的CDS序列设计特异性引物，引物序列如下：

PQB-KDA2-F 5’- ATGGATTCTTCAGTCGTGGAGG-3’（SEQ ID NO.3）；

PQB-KDA2-R 5’-AAGATTGTAGTAATTACTGAACTTTC-3’（SEQ ID NO.4）。

使用TRI Reagent提取番茄的总RNA，采用反转录试剂盒进行反转录后得到cDNA链，之后以其作为模板，用上述特异性引物对获得的cDNA利用高保真酶进行PCR扩增，电泳结果如图1A所示。

2、番茄KDA2基因亚细胞定位载体的构建及KDA2的亚细胞定位

将扩增产物进行回收、纯化后克隆到PQB载体上，阳性克隆结果图1B所示，获得PQB-KDA2重组质粒，送公司测序确认序列。测序正确的质粒通过Gateway方法与带有绿色荧光蛋白标签的pK7FW2载体融合，构建pK7FW2-KDA2载体。将pK7FW2-KDA2转入LBA4404农杆菌感受态中，通过农杆菌注射渗透法转化烟草，48h后在激光共聚焦电子显微镜下观察KDA2的亚细胞定位。同时共注射RFP-HDEL作为定位于内质网的阳性对照。结果如图2所示，KDA2与内质网标记蛋白共定位于内质网上。其中，pK7FW2-KDA2载体筛选所用引物序列如下：

PQB-KDA2-F 5’- ATGGATTCTTCAGTCGTGGAGG-3’ （SEQ ID NO.5）；

pBIN-eGFP-Rv：5’-CCCTAATTCCCTTATCTGGGAAC-3’ （SEQ ID NO.6）。

实施例2：番茄KDA2基因敲除突变体和纯合株系的获得

1、番茄KDA2基因敲除突变体的获得

（1）载体构建

KDA2全长基因编码序列（CDS）如SEQ ID NO.7所示，在CRISPRdirect网站输入KDA2基因全序列，根据结果筛选合适的靶点，并据此设计引物，引物序列如下（下划线部分为KDA2靶点）：

KDA2-F0 ：5’-ATATATGGTCTCGTTTGGCCGTAATCATATTCGCCGA

GTTTTAGAGCTAG AAATAGC-3’（SEQ ID NO.8）；

KDA2-R05’-ATTATTGGTCTCGAAACTAGTCGCCGGAAACGGTTCA

CAAACTACACTGTT AGATTC -3’（SEQ ID NO.9）。

以质粒pTX-043为模板，使用上述引物，通过高保真酶进行PCR扩增靶点序列KDA20（敲除靶点），并将扩增产物进行回收、纯化。使用限制性内切酶BsaI对PCR产物和pTX-041质粒进行酶切，分别回收后，将KDA20与pTX-041进行连接。之后将连接产物转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆送公司测序，测序无误的质粒命名为pTX-KDA2。其中，质粒筛选所用引物信息如下：

PTX-Fw：5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA -3’（SEQ ID NO.10）；

PTX-Rv：5’- GCAGGCATGCAAGCTTATTGG-3’（SEQ ID NO.11）。

（2）转基因植株的制备

将重组载体pTX-KDA2转化至农杆菌LBA4404中，根据农杆菌介导的转基因方法利用番茄子叶进行转化，再利用抗生素Kan对转化的愈伤组织进行筛选，同时设置转空载体作为对照，每2-3周更换培养基直到得到再生植株，其中培养条件为16h光照（26℃）/8h黑暗（18℃）。

分别提取再生苗的基因组DNA，对KDA2基因包含靶点的部分序列进行PCR扩增，所用引物的序列为：

PQB-KDA2-F 5’- ATGGATTCTTCAGTCGTGGAGG-3’ （SEQ ID NO.12）；

KDA2-R582：5’- CAATACACGCTTGTGGACCTTG-3’ （SEQ ID NO.13）。

将得到的PCR产物电泳检测后切胶送公司测序。如果序列靶点附近开始有套峰或者序列在两个靶点之间有部分缺失，则说明该植株为KDA2敲除阳性植株。测序结果显示，本发明得到3个阳性植株，分别记为KDA2-4，KDA2-5，KDA2-6。

2、番茄KDA2基因敲除突变体纯合株系的获得

收获T0代敲除突变体的种子作为T1代；将得到的T1代种子播种，待2-3周后每个敲除系分别取5-10棵植株，提取基因组DNA，用PQB-KDA2-F和KDA2-R582进行PCR扩增，PCR产物回收后连接pMD-18T载体，挑选阳性克隆送公司测序。每个敲除系的植株送4个样品去克隆。测序结果显示，每个植株所有4个克隆全部无套峰，且靶点位置发生突变或两个靶点之间发生部分缺失的为KDA2基因敲除突变体纯合株系。

将鉴定得到的三株阳性KDA2基因敲除植株分别记为敲除系KDA2-4-20、KDA2-5-7和KDA2-6-3。与野生型植株相比，敲除系KDA2-4-20基因中第98位后多一个碱基G，216-217位碱基发生缺失，最终发生移码突变；敲除系KDA2-5-7基因中第217位后多两个碱基GA，发生移码突变；敲除系KDA2-6-3基因中第217位后多一个碱基A，发生移码突变；具体的序列比对信息见图3。将得到的KDA2基因敲除突变体纯合株系移栽大盆，收取种子，用于后续实验。

实施例3：阳性KDA2基因敲除植株表型的鉴定

1、选取KDA2基因敲除株系KDA2-4-20、KDA2-5-7和KDA2-6-3与野生型番茄（WT）的种子分别播种于营养土中，培养于温室中。培养条件为16h光照（26℃）/8h黑暗（18℃）。然后，选取4周左右，大小长势相同的KDA2敲除突变体植株与野生型各3组，每组含3棵番茄植株，用孢子浓度为10⁶的孢子液接种番茄叶片，将叶片置于塑料盒中，上面敷上一层保鲜膜以保持百分百湿度，22℃下保持24-48小时后观察番茄叶片发病情况并进行数据统计。结果如图4所示，与野生型相比，KDA2基因敲除株系叶子上的的病斑直径明显减小，表明KDA2基因对番茄抵抗灰霉菌侵染有重要作用，且敲除KDA2基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力，因此番茄KDA2基因具有调控番茄抵抗灰霉菌侵染的功能。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

atggattctt cagtcgtgga gggcggcgca tcgctccgtt cgacgggtac cgacgctaca 60

aaacgtcgtg tttcttattt cttcgactct tccatcggcg aatatgatta cggcgagggt 120

catctaatga agcctcaccg tattcgtgtt gcccacaatc ttattttaaa ctataatctt 180

caccgtaaaa tggagataat tgaaccgttt ccggcgacta aggaggaaat tgggtcgttt 240

cactcgtcgg actatgtgga gtttctctct tcagtttctc ctgagactat taatgacaag 300

tacgattcct accagcgtag acgcttcaat gttggtttgg actcggaaag ctttgattgt 360

cctgtttttt atgggctttt tgatttttgt caaacttcat ctggtggctc aattggcgcc 420

gccgctaagc ttaataggaa tgaagctgat atagctatca attgggctgg tgggttgcat 480

catgcaaaga aaagtgaagc ttctggattt tgctatgtca atgatattgt tcttggaatt 540

ctagaacttc tcaaggtcca caagcgtgta ttgtatgtag acattgatgt tcatcacggg 600

gatggagttg aggaggcttt ttttaccact gatcgggtta tgacagtgtc tttccataag 660

tttggagact tctttcctgg tacagggcat atcaaagaca ttggtgcaag taccgggaag 720

tactatgcct taaatgcacc attgggtaat ggtattgatg atgaaagttt ccgtagtcta 780

ttccgtcctg taatccaaaa agtgatggag gtttatcaac ctgaagctgt tgttgttcaa 840

tgtggtgctg attcactagc aggagacagg ttgggtgtct ttaacttgtc tgttaaaggc 900

catgcagatt gcattcgatt cctcaggtct ttcaatgtcc ctttaatgat gttgggtggt 960

ggaggttata ccgttaaaaa cgttgctcgg tgctggtgct atgagacagc agttgcagtt 1020

ggagtagagc ttgataatga tttgccttac aatgagtttt acgagtattt tgcccctgat 1080

tatattcttt atcatgaatc attacatatg aagaatgaaa attcgccctc ggaactagag 1140

aggatcagga acactttgct ggagcaactc tcgcgtttac cccatgtacc cagtgttcca 1200

tttcaagtga caccttccgt aacagaggtt ccagaaaagg aagacgaaaa catggatcaa 1260

aggcctaaac cagagataag ccaagattac gatactgacg acgaggagaa gtcaaataac 1320

ggaaagttca gttactttcg ttacaaagtc aaagatgagg agatgatttg a 1371

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Asp Ser Ser Val Val Glu Gly Gly Ala Ser Leu Arg Ser Thr Gly

1 5 10 15

Thr Asp Ala Thr Lys Arg Arg Val Ser Tyr Phe Phe Asp Ser Ser Ile

20 25 30

Gly Glu Tyr Asp Tyr Gly Glu Gly His Leu Met Lys Pro His Arg Ile

35 40 45

Arg Val Ala His Asn Leu Ile Leu Asn Tyr Asn Leu His Arg Lys Met

50 55 60

Glu Ile Ile Glu Pro Phe Pro Ala Thr Lys Glu Glu Ile Gly Ser Phe

65 70 75 80

His Ser Ser Asp Tyr Val Glu Phe Leu Ser Ser Val Ser Pro Glu Thr

85 90 95

Ile Asn Asp Lys Tyr Asp Ser Tyr Gln Arg Arg Arg Phe Asn Val Gly

100 105 110

Leu Asp Ser Glu Ser Phe Asp Cys Pro Val Phe Tyr Gly Leu Phe Asp

115 120 125

Phe Cys Gln Thr Ser Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ala Ala Ala Lys Leu

130 135 140

Asn Arg Asn Glu Ala Asp Ile Ala Ile Asn Trp Ala Gly Gly Leu His

145 150 155 160

His Ala Lys Lys Ser Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile

165 170 175

Val Leu Gly Ile Leu Glu Leu Leu Lys Val His Lys Arg Val Leu Tyr

180 185 190

Val Asp Ile Asp Val His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Phe

195 200 205

Thr Thr Asp Arg Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Phe Gly Asp Phe

210 215 220

Phe Pro Gly Thr Gly His Ile Lys Asp Ile Gly Ala Ser Thr Gly Lys

225 230 235 240

Tyr Tyr Ala Leu Asn Ala Pro Leu Gly Asn Gly Ile Asp Asp Glu Ser

245 250 255

Phe Arg Ser Leu Phe Arg Pro Val Ile Gln Lys Val Met Glu Val Tyr

260 265 270

Gln Pro Glu Ala Val Val Val Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Ala Gly

275 280 285

Asp Arg Leu Gly Val Phe Asn Leu Ser Val Lys Gly His Ala Asp Cys

290 295 300

Ile Arg Phe Leu Arg Ser Phe Asn Val Pro Leu Met Met Leu Gly Gly

305 310 315 320

Gly Gly Tyr Thr Val Lys Asn Val Ala Arg Cys Trp Cys Tyr Glu Thr

325 330 335

Ala Val Ala Val Gly Val Glu Leu Asp Asn Asp Leu Pro Tyr Asn Glu

340 345 350

Phe Tyr Glu Tyr Phe Ala Pro Asp Tyr Ile Leu Tyr His Glu Ser Leu

355 360 365

His Met Lys Asn Glu Asn Ser Pro Ser Glu Leu Glu Arg Ile Arg Asn

370 375 380

Thr Leu Leu Glu Gln Leu Ser Arg Leu Pro His Val Pro Ser Val Pro

385 390 395 400

Phe Gln Val Thr Pro Ser Val Thr Glu Val Pro Glu Lys Glu Asp Glu

405 410 415

Asn Met Asp Gln Arg Pro Lys Pro Glu Ile Ser Gln Asp Tyr Asp Thr

420 425 430

Asp Asp Glu Glu Lys Ser Asn Asn Gly Lys Phe Ser Asn Tyr Tyr Asn

435 440 445

Leu

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggattctt cagtcgtgga gg 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagattgtag taattactga actttc 26

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggattctt cagtcgtgga gg 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctaattcc cttatctggg aac 23

<210> 7

<211> 2489

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 7

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acagcaatcg caatggattc ttcagtcgtg gagggcggcg catcgctccg ttcgacgggt 120

accgacgcta caaaacgtcg tgtttcttat ttcttcgact cttccatcgg cgaatatgat 180

tacggcgagg gtcatctaat gaagcctcac cgtattcgtg ttgcccacaa tcttatttta 240

aactataatc ttcaccgtaa aatggagata attgaaccgt ttccggcgac taaggaggaa 300

attgggtcgt ttcactcgtc ggactatgtg gagtttctct cttcagtttc tcctgagact 360

attaatgaca agtacgattc ctaccagcgt agacgcttca atgttggttt ggactcggaa 420

agctttgatt gtcctgtttt ttatgggctt tttgattttt gtcaaacttc atctggtggc 480

tcaattggcg ccgccgctaa gcttaatagg aatgaagctg atatagctat caattgggct 540

ggtgggttgc atcatgcaaa gaaaagtgaa gcttctggat tttgctatgt caatgatatt 600

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gttcttttaa gcgtaaaata atattcatat tttatatgta tatgatgaat ttcttatacg 720

tctttgtcta tgattttggg ttttgctgat atactctgtt tttattactc tgtttcactt 780

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attgatgtat attaaaaaac gaaattttgg atgtgcttcg atcatatgag tttgtatgtc 1020

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tgctgattca ctagcaggag acaggttggg tgtctttaac ttgtctgtta aaggccatgc 1680

agattgcatt cgattcctca ggtctttcaa tgtcccttta atgatgttgg gtggtggagg 1740

ttataccgtt aaaaacgttg ctcggtgctg gtgctatgag gtgaatctct atttctccct 1800

tttggttctt tttcctgtct atagattttc accctattac ctttcacttg tcttataagt 1860

tgttgtgcta aggttgaagt tcttcaatat gtacagacag cagttgcagt tggagtagag 1920

cttgataatg atttgcctta caatgagttt tacgagtatt ttgcccctga ttatattctt 1980

tatcatgaat cattacatat gaagaatgaa aattcgccct cggaactaga gaggatcagg 2040

taatttgaac atcattcctt tagggcttgc ttttagtgaa ctatcagaaa atactatcta 2100

ataatattcg aatctgtata atgtaaaagc tttttcattg ttcaatcttt ttgaagtatt 2160

agcgagtgtg agatgatgtt attgaacatg aataatcggt gggtgcagga acactttgct 2220

ggagcaactc tcgcgtttac cccatgtacc cagtgttcca tttcaagtga caccttccgt 2280

aacagaggtt ccagaaaagg tgagaactag tttattttca agatcatttg attttcatta 2340

tcaatactga tcctcattta ataatttaat gtatgcagga agacgaaaac atggatcaaa 2400

ggcctaaacc agagataagc caagattacg atactgacga cgaggagaag tcaaataacg 2460

gaaagttcag taattactac aatctttaa 2489

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attattggtc tcgaaactag tcgccggaaa cggttcacaa actacactgt tagattc 57

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcaggcatgc aagcttattg g 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggattctt cagtcgtgga gg 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caatacacgc ttgtggacct tg 22

Claims (7)

1.一种KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述KDA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述植物为番茄。

2.根据权利要求1所述的KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

（1）构建KDA2基因敲除重组载体：根据KDA2基因的CDS序列设计引物并进行PCR扩增；扩增产物纯化后，使用限制性内切酶对其进行酶切，回收酶切产物后与质粒进行连接，得到KDA2基因敲除重组载体；

（2）构建KDA2基因敲除重组菌株：将所述KDA2基因敲除重组载体转化至农杆菌中，得到KDA2基因敲除重组菌株；

（3）构建KDA2基因敲除株系：将所述KDA2基因敲除重组菌株转化进植物子叶中，使用抗生素进行筛选并培养至得到再生植物，即得到KDA2基因敲除株系。

3.根据权利要求2所述的KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述步骤（1）中引物的序列为

KDA2-F0：5’-ATATATGGTCTCGTTTGGCCGTAATCATATTCGCCGAGTTTTAGAGCTAGA AATAGC-3’；

KDA2-R0：5’-ATTATTGGTCTCGAAACTAGTCGCCGGAAACGGTTCACAAACTACACTG TTAGATTC -3’。

4.根据权利要求2所述的KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述质粒为pTX-041。

5.根据权利要求2所述的KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述农杆菌为LBA4404。

6.根据权利要求2所述的KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述步骤（3）中培养的条件为16h光照/8h黑暗。

7.根据权利要求2所述的KDA2基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述KDA2基因敲除株系与野生型株系相比，叶子上的病斑直径明显减小。

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