CN102776179B - 小麦矮秆基因串联重复片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦矮秆基因串联重复片段及其应用。该DNA分子是由两个以上的如下I或II或III的DNA片段串联而成的分子：I由序列表中序列1的第2218-4089位(Rht-D1b基因)所示的核苷酸序列组成的DNA片段；II由序列表中序列1的第1-4089位(Rht-D1b启动子和Rht-D1b基因)所示的核苷酸序列组成的DNA片段；III由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA片段。本发明的小麦矮秆基因串联重复片段形成的DNA分子可以显著降低小麦株高。

Description

小麦矮秆基因串联重复片段及其应用

技术领域

本发明涉及小麦矮秆基因串联重复片段及其应用。

背景技术

上个世纪60年代，由于小麦的矮秆基因在小麦生产中的广泛利用，使得小麦产量有了大幅度地提高，因此，小麦的矮秆基因Rht-B1b和Rht-D1b被称为“绿色革命”基因。在小麦中发现了21个矮秆基因，从Rht1到Rht21(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/Triticum/wgc/2008/GeneSymbol.pdf)，其中四个，Rht-B1b(Rht1)，Rht-B1c(Rht3)，Rht-D1b(Rht2)以及Rht-D1c(Rht10)是对赤霉素不敏感的，其余的基因对赤霉素敏感。Rht-B1b和Rht-D1b分别定位在4BS和4DS上，这两个基因被广泛地应用到小麦育种中。Rht-B1b和Rht-D1b克隆后，发现它们编码DELLA蛋白，而DELLA蛋白是赤霉素信号转导通路中的一个负调控因子，抑制植物的生长。当赤霉素缺失的时候，DELLA蛋白抑制着赤霉素相应的基因，导致了依赖赤霉素成长的植株生长缓慢；相反，当有赤霉素的时候，GA信号通过一种尚未发现的磷酸酶和SCF^SLY1的复合体诱导了DELLA蛋白的磷酸化，从而使得DELLA蛋白被泛素化进一步被26S蛋白体降解。当DELLA蛋白部分缺失而变得很难降解时，比如拟南芥中的gai，它缺失了接近N端的17个氨基酸残基，植株就会表现出矮秆。在Rht-D1b中有一个T到G碱基的突变，使得E61(GGA)翻译成了终止密码子(TGA)，从而导致了N端的缺失，含有该基因的植株也表现出半矮秆。除了缺失突变会造成矮秆现象以外，过量表达DELLA蛋白也会造成很强的致矮作用。低表达量的gal造成了轻微的矮化，而高表达量的gal则更大程度的矮化了株高，甚至是没有突变的GAI过量表达，也会有一定的降低株高的作用。

矮变一号是西安农科所发现的一个自然突变体，株高只有25cm左右，是世界上最矮的小麦之一。矮变一号中的强降秆是Rht-D1c(Rht10)这个基因在起着作用，而这个基因被定位在4D染色体的短臂上，与Rht-D1b是等位基因。在所有的小麦矮秆基因中，Rht-D1c是降秆能力最强的一个。除了科学上的重要性，Rht-D1c在小麦育种上也有重要的价值。ms2是完全显性的雄性不育基因，也定位在4D短臂上。刘秉华研究员将ms2和Rht-D1c整合到了一起育成了著名的矮败小麦，败育的小麦同时具有矮秆和不育的表型，而高秆的后代是可育的。正因为不育的小麦是矮秆，因此在育种工作中很容易识别和授粉，尤其在轮回选择育种中。矮败小麦已经被证明是很有价值的育种材料，利用该材料目前已培育出了42个新的小麦品种，推广面积1.85亿亩，增产小麦56亿公斤，创造了重大的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的一个目的是提供小麦矮秆基因串联重复片段形成的DNA分子。该DNA分子能够极强的降低小麦株高。

本发明所提供的DNA分子，名称为Rht-D1b::Rht-D1b，来源于小麦，是由两个以上(如两个)的DNA片段串联而成的分子，具体可为如下1)或2)或3)的片段：

1)是如下I或II或III的DNA片段：

I由序列表中序列1的第2218-4089位(Rht-D1b基因)所示的核苷酸序列组成的DNA片段；

II由序列表中序列1的第1-4089位(Rht-D1b启动子和Rht-D1b基因)所示的核苷酸序列组成的DNA片段；

III由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA片段；

2)与1)限定的DNA的序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交的分子。

序列表中序列1的第1-2217位为启动子、第2218-4089位为Rht-D1b基因、第4358-5152位为polyA。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述DNA分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述DNA分子构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的DNA分子构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

所述重组载体具体可为pRht-D1b:Rht-D1b::pRht-D1b:Rht-D1b。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述DNA分子导入目的植物中，得到株高低于所述目的植物的转基因植物。

所述目的植物具体可为单子叶植物或双子叶植物，如小麦。

所述转基因植物理解为不仅包含将所述DNA分子转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该DNA分子，也可用常规育种技术将该DNA分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。

所述DNA分子可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明DNA分子的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明DNA分子进行连接。

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adh1和bronze1)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

在实际操作中，也可以将本发明DNA分子进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明DNA分子序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。

可以启动Rht-D1b基因表达的启动子也属于本发明的保护范围。该启动子，是如下a)或b)的DNA分子：

a)其核苷酸序列是序列表中序列1第1-2217位所示的DNA分子；

b)与a)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有启动子活性的DNA分子。

本发明的小麦矮秆基因串联重复片段形成的DNA分子可以显著降低小麦株高。实验证明转入Rht-D1b::Rht-D1b基因的Bobwhite和CB037的T₁代植株中纯合的Rht-D1b::Rht-D1b植株的株高平均只有12cm，降秆率为78％。

附图说明

图1为T₁代转基因Bobwhite的株高表型(A)以及Rht-D1b的表达量(B)。其中的1为纯合的双拷贝Rht-D1b(Rht-D1b::Rht-D1b)单株，2为杂合的双拷贝Rht-D1b(Rht-D1b::Rht-D1b)单株，3为杂合的单拷贝Rht-D1b单株，4为野生型的Bobwhite。

图2为矮变一号及其近等基因系的株高。其中，1为矮变一号，2为矮败/中国春中的矮株，3为矮败/中国春中的半矮株，4为中国春。

图3为Rht-D1b分子标记与含有Rht-D1b或Rht-D1c材料之间的关系。A图为Rht-D1b分子标记在含有Rht-D1b或Rht-D1c材料中的扩增，其中1为矮变一号，2为矮败/中国春中的矮株，3为矮败/中国春中的半矮株，4为中国春，5为蚰包；B图为Rht-D1b分子标记与矮败/中国春近等基因系中株高为60cm左右的矮秆表型共分离；C图为Rht-D1b分子标记与矮败/中国春近等基因系中株高为85cm左右的半矮秆表型共分离。

图4为Rht-D1b在矮变一号及其近等基因系等材料中的拷贝数。A图为通过EcoRV酶切，Rht-D1b为探针的Southern blotting(箭头所指的为4D条带)，其中的1为矮变一号，2为矮败/中国春中的矮株，3为矮败/中国春中的半矮株，4为中国春，5为农林10号，6为CS N4AT4B，7为CS mono4BT₂4A，8为CS N4DT4B；B图为通过real-timePCR检测矮变一号等材料中Rht-D1b的拷贝数，其中以50070like gene序列为内参基因，其中的1为矮变一号，2为矮败/中国春中的矮株，3为矮败/中国春中的半矮株，4为中国春。

图5为Southern blot结果检测出的大片段重复区域。

图6为以中国春为参照的Rht-D1b基因的表达差异。其中的1为矮变一号，2为矮败/中国春近等基因系中的矮株，3为矮败/中国春近等基因系中的半矮株，4为中国春。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、利用串联的两个Rht-D1b即Rht-D1b::Rht-D1b培育矮杆转基因小麦

1、构建转小麦的表达载体(含有单拷贝Rht-D1b的表达载体pRht-D 1b:Rht-D1b和含有双拷贝Rht-D1b的表达载体pRht-D1b:Rht-D1b::pRht-D1b:Rht-D1b的构建)

将Rht-D1b基因序列前面连接其启动子区域后面连接来自pJIT163载体(http://www.pgreen.ac.uk/JIT/pJIT163.gb)的polyA整合成一个Rht-D1b表达单元。我们一共构建了两个载体，都是将片段整合在pCAMBIA2200(CAMBIA)载体上，其中一个称为单拷贝载体，只含有一个上述的单元，另一个称为双拷贝载体，含有两个上述的单元，以串联的形式连接在一起。构建单拷贝载体时，首先在启动子(2217bp)的上游引物接上一个Kpn I的接头，在Rht-D1b基因(1872bp)下游引物接上一个SbfI的接头，在polyA(795bp)的上游引物接上一个SbfI接头，下游引物接上一个Kpn I的接头。在启动子和Rht-D1b基因的连接处存在一个HindIII酶切位点，通过这个酶切位点，将扩增的启动子和基因连接在一起，并整合到同时被Kpn I和SbfI双酶切的载体pCAMBIA2200中，通过质粒在大肠杆菌中的扩增而富集。再通过Kpn I和SbfI双酶切将上述载体中的启动子和基因的片段切下来，再与polyA的片段相连，成为一个含有启动子，Rht-D1b基因和polyA的大片段，除去大片段两端的Kpn I的接头该片段的长度为5152bp(其核苷酸序列如序列表中的序列1)。将序列1的5152bp连同两端Kpn I的接头插入pCAMBIA2200的Kpn I位点得到含有单拷贝Rht-D1b的表达载体pRht-D1b:Rht-D1b。序列表中序列1的第1-2217位为启动子、第2218-4089位为Rht-D1b基因、第4358-5152位为polyA。表达载体pRht-D1b:Rht-D1b构建的具体方法如下：

(1)根据本实验室筛选的矮败/中国春BAC文库中的1J9上Rht2(Rht-D1b)上游序列设计引物扩增Rht2(Rht-D1b)基因的启动子序列，并在该上游引物加上一个Kpn I的接头，产物长度2229bp。

上游引物  L9       GGTACCTACGCGTTGGAATGCTGGACAA Tm60.5℃

下游引物  L70-R    CTTCATGATCCGCGAGCTA          Tm55℃

(2)根据BAC 1J9上Rht2(Rht-D1b)附近的序列设计引物扩增Rht2(Rht-D1b)基因的全长序列，并在该下游引物加上一个SbfI的接头，产物长度2212bp(此处扩增的是包含Rht-D1b 1872bp的片段)。

上游引物  L71-F   GGAACCGAGGCAAGCAA               Tm 57℃

下游引物  L13-R   CCTGCAGGGGATTACATTACTACATGCCGGT Tm 59℃

(3)根据pJIT163载体的polyA的序列设计，并在该上游引物加上一个SbfI的接头，在下游引物上加上一个Kpn I的接头，产物长度809bp(含接头)。

上游引物  SbfI-polyA-F  CCTGCAGGATGGCGTGCAGGTCGACT Tm 53℃

下游引物  DpnI-polyA-R  GGTACCGATCTCTCGAGGATATCGC  Tm 50℃

(4)回收上述三种片段(全式金EG101)。

(5)连接上述三种片段的回收产物到T载体上，并转化入大肠杆菌感受态细胞(全式金CB111)。

(6)提质粒，分别测序上述三种片段的单克隆，选取序列完全正确的单克隆。

(7)将启动子区用Kpn I和HindIII双酶切，Rht2(Rht-D1b)用SbfI和HindIII双酶切，polyA用Kpn I和SbfI双酶切。

(8)回收酶切片段。

(9)将回收的启动子与Rht2(Rht-D1b)连接。

(10)再将(9)中这个大约4500bp的片段连接在已经被Kpn I和Sbf I双酶切的载体pCAMBIA2200上，并转化入大肠杆菌中。

(11)大量提取(10)中的质粒，Kpn I和Sbf I双酶切该质粒，回收酶切片段，使酶切片段的量达到连接的水平。

(12)连接(11)中的片段和Kpn I和Sbf I双酶切后的polyA，形成一个5kb大小左右的大片段，将连接的片段回收，再与Kpn I单酶切的载体pCAMBIA2200再连接，得到含有单拷贝Rht-D1b的表达载体pRht-D1b:Rht-D1b。该载体pRht-D1b:Rht-D1b含有由启动子、Rht-D1b基因和polyA组成的长度为5152bp(其核苷酸序列如序列1)的大片段。将该5152bp的DNA片段命名为单拷贝Rht-D1b表达盒用“Rht-D1b”表示。将载体pRht-D1b:Rht-D1b转入大肠杆菌DH5α。

序列表中的序列1的第1-2217位为启动子、第2218-4089位为Rht-D1b基因、第4358-5152位为polyA。

构建双拷贝载体pRht-D1b:Rht-D1b::pRht-D1b:Rht-D1b时，一方面将上述的单拷贝载体pRht-D1b:Rht-D1b用Kpn I完全酶切，回收含有启动子、Rht-D1b基因和polyA的大片段，另一方面将单拷贝载体pRht-D1b:Rht-D1b用Kpn I不完全酶切，即只将单拷贝载体pRht-D1b:Rht-D1b由环形的质粒切成带有Kpn I粘性末端的线性质粒，最后将回收的大片段与这线性的质粒连接起来，获得的载体含有两个串联的5152bp片段，该载体为pRht-D1b:Rht-D1b::pRht-D1b:Rht-D1b。将pRht-D1b:Rht-D1b::pRht-D1b:Rht-D1b中所含的由两个5152bp DNA片段(其核苷酸序列如序列1)通过Kpn I位点串联形成的双拷贝命名为双拷贝Rht-D1b表达盒用“Rht-D1b::Rht-D1b”表示。

2、小麦的农杆菌遗传转化

将构建好的载体pRht-D1b:Rht-D1b和pRht-D1b:Rht-D1b::pRht-D1b:Rht-D1b分别转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens strain C58C1)(Ashby A.M.，Watson M.D.，Loake GJ.，et al.，Ti plasmid-specified chemotaxis of Agrobacterium tumefaciens C58C1toward vir-inducing phenolic compounds and soluble factors from monocotyledonous anddicotyledonous plants.J Bacteriol，1988.170(9)：4181-7.)，以农杆菌侵染的方式转入普通小麦Bobwhite(Weeks JT，Anderson OD，Blechl AE.Rapid Production of MultipleIndependent Lines of Fertile Transgenic Wheat(Triticum aestivum).Plant Physiol.1993，102(4)：1077-1084.http://genbank.vurv.cz/wheat/pedigree/krizeni2.asp？id＝8104)(本身不含Rht-D1b)和CB037(韩晓峰，叶兴国，刘晓蕾，魏亦勤，杜丽璞，王轲，佘茂云，樊明，晏月明.小麦花药培养后代和杂交后代中高分子量麦谷蛋白亚基变异分析.植物遗传资源学报2010，11(6)：6712677.)(自身带有Rht-D1b)中。表达载体构建完成后，经过酶切与测序验证其正确性后，取1μl构建好的表达载体质粒电击转化进入20μlC58C1农杆菌感受态细胞中，然后用1mlYEB液体培养基28℃250rpm恢复培养3h，取10μl菌液涂布于YEB抗性平板上(氯霉素50mg/L，利福平Rif 50mg/L)，于28℃培养2～3天。提取农杆菌的质粒进行目标基因的PCR检测，阳性菌液保存于-70℃超低温冰箱中备用。将阳性菌液扩大培养，然后侵染小麦品种Bobwhite和CB037的幼胚愈伤组织，用G418抗性筛选愈伤，并进一步培养分化成幼苗，然后移栽大田。

3、阳性转化植株的鉴定及后代株高表型调查

通过PCR检测得知，127株T₀代Bobwhite中有15株(12％)为阳性植株，107株T₀代CB037中有24株(22％)为阳性单株(表1)。结果表明，T₀代中，Rht-D1b::Rht-D1b所形成降秆效应大约为33-34％，大大降低了株高。

鉴定T₀和T₁是通过引物polyA：5’-ATGGCGTGCAGGTCGACT-3’和5’-GATCTCTCGAGGATATCGC-3’鉴定。

表1  T₀代植株的株高

***代表极显著差异

从T₀代中获得47株T₁代的Bobwhite以及36株T₁代的CB037。T₁代植株中，转入单拷贝Rht-D1b表达盒即Rht-D1b的CB037转基因植株中，Rht-D1b基因型是纯合的单株平均株高为42cm，比未转基因的对照降秆24.5％(表2)，转基因Bobwhite和CB037的T₁代植株中纯合的双拷贝Rht-D1b表达盒即Rht-D1b::Rht-D1b植株的株高平均只有12cm(图1中A)，降秆率为78％，造成了3倍于单个Rht-D1b基因的效果，这与自然界中的Rht-D1c的强降秆作用是相似的。而且Rht-D1b基因的表达量的变化在转基因小麦中随株高的变化趋势(图1中B)与下文将提到的在矮变一号，矮败/中国春近等基因系的矮株，矮败/中国春近等基因系的半矮株以及中国春中的变化趋势一致(图6)。所有这些结果都说明了Rht-D1c的强降秆作用来源于Rht-D1b的串联重复。

其中，图1中B的Rht-D1b基因的表达量按照下述方法进行检测：实时定量PCR总RNA的提取采用Trizol方法。总RNA的转录使用SuperScriptTM II Reverse Transcriptase(Invitrogen，China)。cDNA以1∶150的比例用DEPC水稀释使用。定量PCR反应采用了

Premix Ex TaqTM(TaKaRa)。扩增反应机器为ABI Prism 7300(AppliedBiosystems，USA)。本实验中采用的是相对定量法，以持家基因GAPDH为内参基因，按照2^-ΔΔCt的方法进行实验。扩增中用到的引物：

5’-TGAGCATGGAGGACAACACAG-3’和5’-ATCCACCTCTTCACGCCA-3’扩增

Rht-D1；5’-TTAGACTTGCGAAGCCAGCA-3’和5’-AAATGCCCTTGAGGTTTCCC-3’

扩增GAPDH。其中Rht-D1为4D短臂特异的引物。

表2T₁代转基因小麦的株高统计

**代表显著差异***代表极显著差异

下述实施例2-5为实施例1的相关机理，其中所用的材料和方法如下：

材料

矮败/中国春近等基因系是通过矮败和中国春回交，以中国春为背景回交15代获得。其中矮败是矮秆和雄性不育的合称，是刘秉华1987年将Rht-D1c和ms2整合到一起的材料。Rht-D1c和ms2同时定位在4DS，两个基因紧密连锁相距仅为0.18cM。因为ms2是一个完全显性的基因，所以在矮败/中国春的近等基因系中Rht-D1c和ms2的基因型是杂合的。

DNA杂交分析

DNA的提取和DNA杂交依据Stein等描述的方法。在水稻与小麦的共线性的基础上，依据水稻第三染色体上的基因序列：LOC_Os03g49610，LOC_Os03g49630，LOC_Os03g49710，LOC_Os03g49730，LOC_Os03g49900，LOC_Os03g49940，LOC Os03g50030，LOC_Os03g50050，LOC_Os03g50070，我们找到了小麦上的同源基因序列，并分别取名为49610like gene，49630like gene，40710like gene，49730likegene，49900like gene，49940like gene，50030like gene，50050like gene，50070like gene。以这些基因作为探针针对矮变一号、矮败/中国春小麦近等基因系、CS以及其第四同源群的缺体四体的DNA转的膜进行杂交。

矮败/中国春BAC文库构建和筛选

矮败/中国春小麦基因组经过HindIII酶切构建成含有雄性不育基因(ms2)和矮秆基因(Rht-D1c)的BAC文库。这个BAC文库包含了1,000,000个克隆，插入的片段大概118kb(从6到312kb)，覆盖率为基因组的6.5倍。BAC文库通过Isidore等描述PCR的方法筛选获得。依据水稻和小麦的共线性关系，选择水稻第三号染色体SLR1基因附近的基因序列，获得小麦ESTs中同源性高于75％的序列，设计筛选BAC文库的引物。所有用来筛选的引物均为4D特异的引物，通过中国春缺失体确定N4AT4B、mono4BT₂4A和N4DT4A。

通过上述引物筛选到小麦BAC(4N5，4D13，1P9，5P5，11D10，1J9，8M1，9B16，1C14)。BAC shotgun测序是同孔秀英等的方法进行。亚克隆测序采用了BigDyeTerminator v3.1Cycle Sequencing kit，并在ABI3730XL测序仪进行测序(AppliedBioSystems，Foster，CA)。数据拼接采用Lasergene suite 7.1中的SeqMan软件(DNASTAR，Madison，AL)，覆盖率从8-12倍。

实时定量PCR

总RNA的提取采用Trizo1方法。总RNA的转录使用SuperScriptTM II ReverseTranscriptase(Invitrogen，China)。cDNA以1∶150的比例用DEPC水稀释使用。定量PCR反应采用了

Premix Ex TaqTM(TaKaRa)。扩增反应机器为ABI Prism7300(Applied Biosystems，USA)。本实验中采用的是相对定量法，以持家基因GAPDH为内参基因，按照2^-ΔΔCt的方法对Rht-D1的表达量进行相对定量。扩增中用到的引物：5’-TGAGCATGGAGGACAACACAG-3’和5’-ATCCACCTCTTCACGCCA-3’扩增Rht-D1；5’-TTAGACTTGCGAAGCCAGCA-3’和5’-AAATGCCCTTGAGGTTTCCC-3’扩增GAPDH。

用CTAB法提取DNA。模板DNA浓度大约50ng/μl。定量PCR反应采用了SYBR

Ex TaqTM(TaKaRa)。扩增反应机器为ABI Prism 7300(Applied Biosystems，USA)。本实验中采用的是相对定量法，以持家基因50070like gene为内参基因，按照2^-ΔΔCt的方法对Rht-D1的拷贝数进行相对定量。5’-TGAGCATGGAGGACAACACAG-3’和5’-ATCCACCTCTTCACGCCA-3’扩增Rht-D1；5’-ACCTGACGGAAGTGCCAT-3’和5’-CCTAGTTAGAAGGCAACCATT-3’扩增50070like gene。其中Rht-D1和50070like gene的引物为4D短臂特异的引物。

施例2、发现小麦强降杆基因Rht-D1c为矮秆基因Rht-D1b的串联重复

1、在含有Rht-D1c的小麦材料中扩增出Rht-D1b的特异分子标记

首先，构建矮败/中国春近等基因系，在得到的13061个单株中，有5961株是平均株高为60cm的矮株，7100株是平均株高为120cm的高株。在大的分离群体中其中有1株是株高为85cm的半矮株(图2)。根据Izumi等报道矮败中的矮的性状为显性单基因控制，即Rht-D1c来自矮变一号。

另外，Rht-D1b和Rht-D1c同时定位在4DS上。为了研究Rht-D1b和Rht-D1c之间的关系，我们依据Rht-D1b的突变位点设计了一个Rht-D1b特异的分子标记，用以检测矮败/中国春近等基因系中矮株和该分子标记之间的关系(图3中A)。结果表明在矮变一号和矮败中检测到该分子标记，而且矮败/中国春近等基因系中矮株以及半矮株和Rht-D1b分子标记共分离，而该群体中的高株却没有该分子标记的扩增(图3中B和C)，这说明Rht-D1c和Rht-D1b存在着关联，而且与Rht-D1b为等位基因，这个结果与

和Mettin(1988)的结果一致。

2、证明小麦中Rht-D1c与Rht-D1b二者的侧翼序列一致

为了检测Rht-D1c和Rht-D1b以及两个基因侧翼序列的差异，我们构建了矮败BAC文库，该文库为HindIII酶切产生插入片段平均大小为118kb，覆盖率接近全基因组的6.5倍。利用Rht-D1b特异的引物，筛选到了3个BAC克隆，并对其中一个克隆进行测序(～200kb)和组装。依据Rht-D1b两侧的序列设计引物，扩增矮变一号(Rht-D1c)，矮败(Rht-D1c)，蚰包(Rht-D1b)的该基因的上游5kb和下游3kb的序列。结果表明这些材料中的序列是一致，由此我们进一步推测Rht-D1b是Rht-D1c。

3、确定小麦中Rht-D1c含有两个重复的Rht-D1b

鉴于Rht-D1c和Rht-D1b相关，然而这两个基因的周边序列一致，所以我们利用Southern blotting和real-time PCR对矮变一号等材料中的Rht-D1b基因的拷贝数进行了测定。在以EcoRV酶切的膜中增加了中国春第四同源群的材料，以此来判断4D上的条带(图4中A)。依据Rht-D1b为探针序列，又在上述材料中只有Rht-D1b，无其他同源序列，我们认为4D上的条带便为Rht-D1b的条带。结果发现，矮变一号中的4D上的条带最亮，其次为矮败，最弱的为中国春上的条带(图4中A)。除此之外，我们还用了很多其他的限制性内切酶酶切这些材料，比如DraI，HindIII，BamHI和EcoRI，杂交后的结果与上述结果一致。利用软件Qantity one 4.6.1分析，结果表明在矮变一号上有两个拷贝的Rht-D1b，在矮败上有1.5个拷贝，因为矮败是杂合体，在矮败/中国春近等基因系的半矮株中为一个拷贝的Rht-D1b(图2)。

为了进一步证实Rht-D1b拷贝数，我们用50070like gene序列为内参基因，对矮变一号，矮败和中国春等材料进行了real-time PCR。结果与Southern杂交的结果一致，即在矮变一号中两个Rht-D1b，在矮败中1.5个拷贝，在矮败/中国春的半矮株以及中国春中均为一个拷贝(图4中B)。这个结果表明在矮变一号中的Rht-D1c其实为两重复的Rht-D1b。

实施例3、在自然突变的矮变一号中存在一个包含Rht-D1b的大片段重复

为了界定重复发生在Rht-D1b区域的范围，我们找到Rht-D1b在水稻上的同源基因Os03g49990，又依据水稻和小麦的共线性关系，沿着水稻上的同源基因的上游和下游找寻两侧的基因，通过这些基因的序列，从本实验室的全长cDNA文库中找到相似度最高的基因序列，作为探针杂交矮变一号，矮败，中国春等材料(http://wheat.pw.usda.gov/wEST/binmaps/wheat4rice.html)。结果与Rht-D1b的结果一致，即在矮变一号中两个拷贝，在矮败中1.5个拷贝，在矮败/中国春的半矮株以及中国春中均为一个拷贝(图5)。同时本实验室的段佳磊以这些序列作为筛选矮败/中国春BAC文库的引物，获得了一个小麦4DS的遗传图谱。包含了9个BAC，其中4个位于Rht-D1b基因的上游，1个位于Rht-D1b基因的下游。当用49630like gene和50050like gene探针杂交时，杂交条带不再如Rht-D1b等基因的杂交条带那样有强弱的区别，而是在带型上出现了多态性(图5)。而当沿着与水稻的共线性再分别往上下游延伸到基因49610like gene和50070like gene时，各个材料之间的杂交条带表现为一致，即既无强弱的区别亦无多态性(图5)。其中，实验方法如下：矮变一号，矮败/中国春的矮株和半矮株，以及中国春的DNA经过分别被DraI和EcoRV完全酶切后转膜，再分别用49610like gene，49630like gene，40710like gene，49730like gene，49900like gene，49940like gene，50030like gene，50050like gene，50070like gene的序列作为探针。结果发现49710like gene，49730like gene，49900like gene，49940like gene和50030like gene如Rht-D1b的结果一致。在49630like gene和50050like gene杂交时，条带出现多态性。而到49610like gene和50070like gene时，所有的材料杂交条带一致。

9个来自矮败BAC文库的BAC包含在重复区域(4N5，4D13，1P9，5P5，11D10，1J9，8M1，9B16，1C14)，而且这些BAC的大小加起来大约为1104Kb(表3)，又因为这些BAC之间还有未搭建起的空隙，因此估计这个大片段重复区域的大小应该超过1Mb。这些结果都说明这个区域是一个串联的大片段重复(tandem segmental duplicationTSD)。其中有26个基因包含在这个大于1Mb的片段中(表4)。

表3BAC的插入片段的大小

BACID	Lengtha(Kb)
		4N5	105
4D13	106
		1P9	116
5P5	94
		11D10	94
1J9	208
		8M1	140
9B16	110
		1C14	131
Total	1104

^aBAC的长度是通过HindIII酶切估计得出

Rht-D1位点附近不包括TSD的区域是一个重组热点，重组概率为4.4cM/Mb(Duanet al.，unpublished data)。然而，在矮败/中国春BC₁₄F₁大群体中关于Rht-D1b的重组在大于13000多个单株中才有一次，这个概率才0.00008cM/Mb。这说明TSD形成了一个单倍型，两个拷贝的Rht-D1b基因被分离成了一个单个基因。

表4在大片段重复中26个基因可能的功能

实施例4、大片段重复断点的预测

根据Southern blotting的结果，左边界的区域应该在49710like gene和49610likegene之间，而目前已知的这段区域的序列为49630like gene和49610like gene的序列，为53.5kb，位于BAC 4N5上。右边界则锁定在50030like gene和50070like gene之间且为50050like gene附近的序列位于BAC 1C14的50kb的区域内。比对和分析了上述两段边界序列，在两段序列中找到了一个70bp的片段(AGACACGTCTCCGGTCAATAACCAATAGCGGAACCTGGATGCTCATATTGGCTCCCACATATTCTACGAA)，100％的相似度。这个序列是Tyl-copia反转录转座子的一部分，分别位于4N5的70519-70588bp，1C14的73023-73092bp。我们猜测这个序列可能是边界的断点序列。通常断点的位置有13mer motif‘CCNCCNTNNCCNC’(Lam，Mu et al.2010)，在这70bp序列附近我们发现4N5的70949-70961bp和70961-70973bp有‘CCCCCCTTTCCTC’和‘CCCCCCTCTCCCC’；在1C14的72570-72582bp有‘CCCCCCTGCCCCC’。而且包含这13mer motif的区域的序列GC含量比较高，4N5中从70776bp到71013bp其GC％为62.62％，1C14中从72525bp到72797bp，GC％为64.1％，而一般小麦的序列GC％约为45％。

实施例5、矮变一号及其近等基因系中Rht-D1b的表达

为了进一步理解Rht-D1c的作用机制，我们利用real-time PCR检测了Rht-D1b在矮变一号及其近等基因系中的表达量。结果表明矮变一号中Rht-D1b基因的表达量是中国春的3倍，矮败/中国春近等基因系中的矮株是中国春表达量的2倍，矮败/中国春近等基因系中的半矮株为中国春的1.5倍(图6)。Rht-D1b基因的表达水平正好与各个材料的株高趋势相反，表明了Rht-D1c的强降秆作用来源于Rht-D1b的表达量的增多。矮变一号中Rht-D1b的高表达量则是因为Rht-D1b基因的大片段重复造成的。

以上实验结果表明：

1、大于1Mb的大片段重复的进化

基因复制在植物界是一个常见而又重要的进化过程，在产生基因新功能上起着至关重要的作用。很多的基因组变化都能引起基因的重复，包括了非等位交换，反转录转座子，以及整个染色体或基因组的复制等。针对我们研究中发现的这个大于1Mb的大片段重复，非等位交换可能是比较接近的解释，因为反转录转座子所产生的重复远远小于1Mb，而整个染色体/基因组的复制产生的重复片段又远远大于1Mb。为了分析复制产生的机制，我们对已知的边界区域的序列进行了分析，结果发现这些序列中有一些非等位同源重组(non-allelic homologous recombination(NAHR))的特征：有100％相似的70bp的序列存在，而且在其周围有13mer motif存在，而包含这个短的DNA结构的序列GC含量都不少于60％。又因为重复之间Rht-D1b本身及其上游5kb下游3kb的序列都一致，所以我们认为这个大片段重复可能还处在进化的早期，两重复之间的序列还没有发生变化。植物NBS-LRR类抗病基因是多以基因簇的形式存在，说明植物中基因功能的放大可以通过拷贝数的增加来实现。在我们的研究中，Rht-D1b的表达量因为基因组上拷贝数的增倍而增强，从而大大降低了植物的株高。矮变一号包含了这样一个大于1Mb的串联重复片段对于研究重复事件来说是一个很有价值的材料。

2、串联重复在遗传育种中具有重要的利用价值

串联重复在遗传育种中具有重要的意义。众所周知，基因的功能和其表达是密切相关的。为了提高基因的表达量，通常的做法就是连接一个强的启动子，比如35S或者Ubiquitin。然而，加上过量表达启动子，使得随时随处基因都过量表达，这对作物的产量来说并不是一件好事。为了使得基因在适当的时候合适的组织中高表达，需要组织特异的启动子或者诱导表达的启动子，然而，并不是所有的目标基因都能轻易找到这样合适的启动子。即便找到了这样的启动子，有时候结果也不尽如人意。本实验中的Rht-D1b基因及其启动子是经过上百万年从自然界和人工筛选而来，经过实践证明非常适合作物生产。基因串联重复加上其自身的启动子能使基因在适当的时候合适的组织中过量表达，因此，这对作物产量来说是非常有利的。这种方式对于转基因育种具有可行性，对于未来的粮食产量具有重大意义。

Claims (16)

1.DNA分子，是由一个DNA片段或两个DNA片段串联而成的分子，其特征在于：所述DNA片段为如下Ⅱ或Ⅲ的DNA片段：

Ⅱ由序列表中序列1的第1-4089位所示的核苷酸序列组成的DNA片段；

Ⅲ由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA片段。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述DNA分子插入pCAMBIA2200得到的重组表达载体。

4.根据权利要求2或3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体中，启动权利要求1所述DNA分子转录的启动子的核苷酸序列是序列表中序列1第1-2217位所示的DNA分子。

5.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。

6.含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系。

7.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。

8.含有权利要求1所述DNA分子的重组病毒。

9.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求1所述的DNA分子导入目的植物中，得到株高低于所述目的植物的转基因植物；

所述目的植物为小麦。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：权利要求1所述的DNA分子通过权利要求2-4中任一所述的重组载体导入目的植物中。

11.一种DNA分子，其核苷酸序列是序列表中序列1第1-2217位所示的DNA分子。

12.含有权利要求11所述DNA分子的重组载体。

13.含有权利要求11所述DNA分子的表达盒。

14.含有权利要求11所述DNA分子的转基因细胞系。

15.含有权利要求11所述DNA分子的重组菌。

16.含有权利要求11所述DNA分子的重组病毒。

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