CN112111505A - 一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明将相应靶基因crRNA及活性Cas3在氧化葡萄糖酸杆菌中进行表达。通过验证对氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的敲除作用，表明本发明的这种敲除方法能够有效敲除氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因，与现有的在氧化葡萄糖酸杆菌中敲除基因的方法相比，操作更加简便、快捷、高效。

Description

一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法

技术领域

本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌属于醋酸菌群,是一种专性需氧革兰氏阴性微生物,它们能很好地适应含丰富醇糖的栖息地，如鲜花、水果、发酵食品和饮料。由于其众所周知的不完全氧化能力,这种细菌已经成功地应用于商业生产维生素C前体，二羟基丙酮、葡糖酸、米格列醇等。氧化葡萄糖酸杆菌具有两个空间分离的醇类和碳水化合物代谢系统。一方面，含大量膜结合脱氢酶的周质空间使得不同底物快速不完全氧化并将对应的产物释放到发酵培养基中。另一方面，由于缺乏磷酸果糖激酶和琥珀酸脱氢酶，这种细菌缺失糖酵解途径和完整的三羧酸循环,戊糖磷酸途径(PPP)和Entner-Doudoroff途径(EDP)是氧化葡萄糖酸杆菌中分解糖类的两个重要途径。

作为一种应用广泛的工业菌种，通过基因工程改造提高氧化葡萄糖酸杆菌的性能具有重要意义。在前人的工作中，通过蛋白质组学分析，鉴定出一个强启动子。一系列合适的人工聚(A/T)尾被报道可以提高编码山梨醇脱氢酶的sldhAB基因的mRNA丰度。将氧化葡萄糖酸杆菌中隐蔽质粒的par-rep基因插入pUC中，构建了几个穿梭质粒进行基因过表达。分别以5-氟尿嘧啶和蔗糖为反选试剂，建立了两种无标记基因敲除方法。这些研究为氧化葡萄糖酸杆菌的代谢工程做出了贡献。然而，与大肠杆菌、酿酒酵母等模型微生物相比，工业菌株氧化葡萄糖酸杆菌的遗传工具研究相对匮乏。

CRISPR/Cas系统为约46％的细菌和90％的古生菌提供适应性免疫，以抵御质粒和噬菌体等侵入性核酸元件。第2类单Cas核酸酶，如Cas12或Cas9，广泛应用于微生物、动植物等多种生物的基因组修饰。然而，大多数天然CRISPR/Cas系统由多亚基复合物组成，属于第1类。第1类包括I、III和IV型。其中I型系统，包括I-A到I-F加上I-U是最普遍的类型。除了I-F型系统使用Cas2/3作为DNA裂解核酸酶外，其他I型系统使用Cas3来执行此功能。而I型系统的PAM通常位于前间隔序列的5’端。I型系统近年来受到越来越多的关注，基于内源性I型CRISPR/Cas系统的基因敲除系统已在数种微生物中得到开发。到目前为止，还没在氧化葡萄糖酸杆菌中成功开发CRISPR/Cas基因敲除系统的报道。

如果能够在氧化葡萄糖酸杆菌中使用CRISPR/Cas系统来敲除基因，将大大缩短敲除筛选的时间、有效提高基因突变的筛选效率。

发明内容

本发明中，通过CRISPRCasFinder对氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组进行分析，鉴定出一个非常典型的I-E型CRISPR/Cas系统。然后通过分析进一步确定了用于基因敲除的Cas蛋白簇的表达。本发明中，CRISPR/Cas基因敲除系统的开发丰富了氧化葡萄糖酸杆菌的基因编辑工具，促进了用以提高其性能的代谢工程修饰。此外，它可能对其他基因操作工具匮乏菌株的代谢工程改造有启示。

本发明的第一个目的是提供一种敲除氧化葡萄糖酸杆菌基因的工具，所述工具由Cas3蛋白、crRNA、表达crRNA的启动子和表达载体组成；所述Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述crRNA由任意能够在氧化葡萄糖酸杆菌中可以表达的启动子启动；所述Cas3蛋白由氧化葡萄糖酸杆菌自身的启动子启动。

在本发明的一种实施方式中，crRNA由目的基因的spacer序列和其两端的重复序列组成。

在本发明的一种实施方式中，所述表达crRNA的启动子包括启动子p_Atse，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，启动Cas3蛋白表达的启动子包括P_tufB、P_{B932_2000}或P₁₁₂。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_tufB公开于Xu等Enhanced productionof L-sorbose from D-sorbitol by improving the mRNA abundance of sorbitoldehydrogenase in Gluconobacter oxydans WSH-003.公开日为2014年。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_{B932_2000}公开于Hu等Enhancedproduction of L-sorbose in an industrial Gluconobacter oxydans strain byidentification of a strong promoter based on proteomics analysis.公开日为2015年。

在本发明的一种实施方式中，启动Cas3蛋白表达的启动子优选为P₁₁₂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，以p2-1载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，p2-1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003。

本发明的第二个目的是提供一种敲除氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的方法，利用所述工具，对氧化葡萄糖酸杆菌中的目的基因进行敲除。

在本发明的一种实施方式中，将所述工具转入氧化葡萄糖酸杆菌细胞中得到重组菌，再将重组菌培养，实现对氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的敲除或缺失。

在本发明的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003。

在本发明的一种实施方式中，将目的基因的上下游同源臂融合的片段与所述工具共同转入氧化葡萄糖酸杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因包括山梨糖还原酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还保护所述敲除氧化葡萄糖酸杆菌基因的工具，或敲除氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的方法在氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除中的应用。

本发明的有益效果：

本发明以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003为宿主，表达重组质粒p2-1-p112-Cas3-p_Atse-crRNA，得到了表达相应靶基因crRNA与氧化葡萄糖酸杆菌WSH-005Cas3的重组氧化葡萄糖酸杆菌，利用获得的重组氧化葡萄糖酸杆菌验证了其基因敲除的作用。相比基于5-氟尿嘧啶和蔗糖为反选试剂的基因敲除方法，本发明的方法不需要漫长的筛选过程，操作更加简便、快捷、高效。

附图说明

图1为氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003内源IE型CRISPR/Cas系统基因组分布(A)及转录水平(B)图。

图2为p2-1-p112-Cas3-pAtse-crRNA穿梭质粒图谱。

图3为CRISPR/Cas系统基因敲除原理图。

图4为CRISPR/Cas系统敲除山梨糖还原酶基因琼脂糖凝胶电泳图(A)及测序验证图(B)。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入17g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。

山梨醇培养基：酵母粉10g/L，山梨醇50g/L。加入17g/L琼脂粉，以配制山梨醇固体培养基。

(二)氧化葡萄糖酸杆菌感受态制备(冰上操作)：挑取单菌落接种山梨醇培养基30℃过夜培养，次日10％转接至50mL新液体培养基30℃培养4-6h，发酵液离心弃上清，加入用10％甘油配置的0.1M的预冷氯化钙洗涤一次，4℃离心弃上清，用预冷的10％甘油洗涤两次后每份40μL分装。

(三)氧化葡萄糖酸杆菌转化：将2ug质粒加入到40μL感受态中，混匀后加入到预冷的1mm间隙的电转杯中，用Bio-Rad MicroPulser进行电转，条件为1.8kV电击5ms。电激完后立即加入1mL冷却山梨醇液体培养基，30℃培养3h后涂布至含有50ug/mL头孢氨苄及50ug/mL卡那霉素的固体山梨醇平板上培养约24h至长出可见菌落。

PCR所用2×Phanta Max Master Mix购自南京诺唯赞公司。

Infusion-Cloning试剂盒购自南京诺唯赞公司。

Taq PCR Master Mix购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

实施例1：穿梭质粒p2-1-p112-Cas3-p_Atse-crRNA的构建

设计用于载体p2-1线性化的引物对F1和R1，

F1：

ACCGGTTGCCGTTATTACCGGTTCGAGTGCTGGTATGTGTTCCCCGCACACGCGGGGATGAACCGTTTTTTTGTACTGAGAGTGCACCAT(下划线部分为同源臂序列，下同)，

R1：

CTGGGATGCCAGCGCGCGAACAACAGTATCAATCTGCTCTGATGCCGCATAG。

以实验室保存的p2-1质粒为模板，以该引物对其进行PCR线性化扩增，将PCR产物纯化回收，得到线性化片段p2-1(SEQ ID NO.4)。

设计用于扩增启动子P₁₁₂序列的引物对F2和R2，

F2：GATACTGTTGTTCGCGCGC，

R2：GGGAAATACTCCTGATTTCGTCCTG。

以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组序列为模板，利用F2和R2对其进行PCR扩增，将PCR产物纯化回收，得到P₁₁₂片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。

设计用于扩增Cas3序列的引物对F3和R3，

F3：CATGAAACAGGACGAAATCAGGAGTATTTCCCATGGATTTGACGGATTTGGCC，R3：ATATTGAG CCCACGGAAAACTTTCCCATTATGCGGGGAACATCAACCC。

以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-005基因组序列为模板，利用F3和R3对其进行PCR扩增，将PCR产物进行纯化回收，得到片段Cas3。

设计用于扩增启动子p_Atse序列的引物对F4和R4，

F4：TGGGAAAGTTTTCCGTGGGC，

R4：CCAGCACTCGAACCGGTAATAACGGCAACCGGTTCATCCCCGCGTGTGCGGGGAACACAAACCAATGAAAAATAAAGATTATTCCGTTCG。

以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组序列为模板，以该引物对其进行PCR扩增，将PCR产物纯化回收，得到p_Atse片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。

设计用于退火合成crRNA序列的引物对F5和R5，

F5：GTGGTTCCCCGCACACACGCGGGGATGAACCGGTTGCCGTTATTACCGGTTCGAGTGCTGGTATGTGTTCCCCGCACACGCGGGGATGAACCG，

R5：CGGTTCATCCCCGCGTGTGCGGGGAACACATACCAGCACTCGAACCGGTAATAACGGCAACCGGTTCATCCCCGCGTGTGCGGGGAACAC。

将引物F5、R5各取10μL混匀后于PCR仪中95℃保温5min后冷却至室温，得到片段crRNA。

用Infusion-Cloning的方法将线性化片段p2-1、P₁₁₂片段、Cas3片段、p_Atse片段和crRNA片段重组为载体p2-1-p112-Cas3-p_Atse-crRNA，并转化大肠杆菌JM109。将转化后的转化子送至上海生工测序，验证正确的即为阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，即为重组质粒p2-1-p112-Cas3-p_Atse-crRNA。

实施例2：用于敲除氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003山梨糖还原酶的山梨糖还原酶上下游融合同源臂的构建

设计用于扩增山梨糖还原酶上游同源片段序列的引物对F4和R4，

F4：AAGGGAACGAGTCACGGAC，

R4：ATATTAACAATATAAGTGGATTAACTGCCGATAACCTCATTTTTCT。

以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组序列为模板，以该引物对其进行PCR扩增，PCR产物纯化回收得到山梨糖还原酶上游同源片段。

设计用于扩增山梨糖还原酶下游同源片段序列的引物对F5和R5，

F5：

AGAAAAATGAGGTTATCGGCAGTTAATCCACTTATATTGTTAATATCGTGATTAACTAC，

R5：TCGGTCACCCCCAGGTC。

以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组序列为模板，以引物对F5和R5对其进行PCR扩增PCR产物纯化回收得到山梨糖还原酶下游同源片段。

将山梨糖还原酶上游和下游同源的纯化片段作为模板，各加1μL，F4跟R5各加1μL，加21μL水，加25μL 2×Phanta Max Master Mix进行重叠延伸PCR，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段10个循环，按照95℃，15s，60℃，15s，72℃，20s进行；扩增阶段25个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，30s进行；终延伸72℃，5min。所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳及测序验证。

实施例3：重组氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003山梨糖还原酶的敲除验证

将测序正确的p2-1-p112-Cas3-p_Atse-crRNA与山梨糖还原酶上下游融合同源臂共转化氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003，待固体山梨醇平板上培养约24h至长出可见菌落后随机挑取单菌落利用交叉引物F4和R5进行菌落PCR验证。使用Taq PCR Master Mix进行菌落PCR，条件如下：预变性94℃，3min；扩增阶段25个循环，按照94℃，30s，56℃，30s，72℃，2min进行；终延伸72℃，5min。

若山梨糖还原酶基因被敲掉，则PCR所得片段大小为1023bp；若山梨糖还原酶基因未被敲掉，则PCR所得片段大小为1815bp。经琼脂糖凝胶电泳结果可知，随机挑取的12个单菌落中，1个为山梨糖还原酶基因被敲掉的菌株，效率为8.3％，并将此菌落PCR产物送上海生工测序验证(图4)，测序结果显示，该菌株的山梨糖还原酶基因已被敲除。

实施例4

利用实施例2和3中的方法对氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003中山梨醇脱氢酶sldBA1小亚基基因sldB1(核苷酸序列与NCBI登录号为NZ_JH668178.1所示序列的第409140位至409520位一致)、山梨醇脱氢酶sldBA1大亚基基因sldA1(核苷酸序列与NCBI登录号为NZ_JH668178.1所示序列的第406918位至409140位一致)、山梨醇脱氢酶sldBA2小亚基基因sldB2(核苷酸序列与NCBI登录号为NZ_JH668178.1所示序列的第190588位至190968位一致)、山梨醇脱氢酶sldBA2大亚基基因sldA2(核苷酸序列与NCBI登录号为NZ_JH668178.1所示序列的第190968位至193187位一致)进行敲除。

结果显示，同样也能够取得于实施例3类似的效果，将上述基因敲除。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法

<130> BAA200644A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgggaaagtt ttccgtgggc tcaatattga gagtggtcat atcgccgtcg tgtttcaaga 60

aaaaaattca tttgccccgc aaaaatttta tctccgaacg gaataatctt tatttttcat 120

tggttt 126

<210> 2

<211> 524

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatactgttg ttcgcgcgct ggcatcccag agccagtttg aaacagggac aaccctgaaa 60

gcgtggctgt tcacaatcca gagaaatgcc ttttacgaac agcgcagacg ctcatcccgt 120

gaacaggagg tcatgcagga tttcgaactc gatatgcctg tgtcgtctga agctccctcg 180

atgcaaagcg ccagggacgc agttacggat cttggtgaaa tcctctggaa actgcctgac 240

cttctccgtg aagccattat cctggtggga gcacaggaac tttcatacga agatgcggcc 300

tgcatctgta atgtccctcc aggcaccatg aaagcccgtg tttcgagagc ccgcagccaa 360

ctagccgctt tgaccgagac ggaaaatctg agcgaaattc acatctaaaa aactgttaaa 420

taacgatttt ttaaaaaaat ataaaaaaag atcctctgga tgcaacgatc ctgaagcctc 480

gttcattgat cccatgaaac aggacgaaat caggagtatt tccc 524

<210> 3

<211> 891

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asp Leu Thr Asp Leu Ala Gln Phe Trp Ala Lys Thr Asp Thr Gln

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Cys Pro Met His Pro Val Val Ala His Ser Leu Asp

20 25 30

Val Ala Ala Val Ala Met Ser Leu Pro Glu Thr Met Leu Pro Gln Ile

35 40 45

Asp Asn Asp Pro Ile Asp Arg Arg Leu Leu Gly Phe Leu Ala Ser Leu

50 55 60

His Asp Ile Gly Lys Leu Gly Ala Thr Phe Gln Phe Leu Arg Pro Asp

65 70 75 80

Leu Trp Pro Thr Ala Leu Gly Ala Thr Pro Ala Ala Leu Pro Pro Gly

85 90 95

Pro Arg His Asp Ala Ala Gly Leu Gln Ile Leu Gly Gln Leu Ser Thr

100 105 110

His Pro Val Leu Lys Ile Leu Phe Pro Asp Trp Ser Leu Ser Glu Lys

115 120 125

Leu Arg Val Leu Ala Gly Val Ala Gly His His Gly Lys Pro Ile Ser

130 135 140

Arg Ala Tyr Gln Arg Pro Ala Asn Leu Thr Ser Leu Asp Glu Asn Thr

145 150 155 160

Leu Asn Ala Ala Arg Ile Phe Leu Asp Val Met Ala Ser Leu Phe Gln

165 170 175

Pro Pro Ser Phe Pro Glu Asp Phe Ser Glu Asp Ala Met Asp Ala Leu

180 185 190

Ala Trp Arg Leu Ala Glu Cys Leu Pro Val Ala Asp Trp Ile Gly Ser

195 200 205

Asn Arg Thr Trp Phe Pro Tyr Ala Thr Pro His Thr Leu Thr Asp Pro

210 215 220

Ala Asp Tyr Phe Trp Asn Lys Ala Leu Pro Gln Ala Gln Lys Ala Ile

225 230 235 240

Phe Gln Ala Gly Leu Gly Pro Val Arg Thr Arg Pro Phe Gln Ser Ala

245 250 255

Lys Asp Leu Leu Pro His Leu Glu Thr Gln Ala Leu Ser Pro Leu Gln

260 265 270

Arg Trp Ala Glu Thr Thr Ser Leu Pro Asp Gly Pro Ala Leu Ile Val

275 280 285

Ile Glu Glu Met Thr Gly Ser Gly Lys Thr Glu Ala Ala Leu Ile Leu

290 295 300

Ser His Arg Leu Ile Ala Arg Gly His Ala Asn Gly Val Phe Leu Ala

305 310 315 320

Leu Pro Thr Met Ala Thr Ala Asn Ala Met Phe Asp Arg Val Ala Ala

325 330 335

Ala Tyr Gly Lys Met Phe His Pro Ala Asp Arg Pro Ser Leu Ala Leu

340 345 350

Ala His Gly Lys Ala Arg Leu Ser Glu Arg Phe Thr Gln Thr Ile Leu

355 360 365

Ser Glu Lys Ser Leu Ser Ser Phe Ala Gly Ile Arg Lys Gln Pro Gly

370 375 380

Glu Ser Ala Cys Met Glu Trp Leu Ala Ser Glu Asn Arg Arg Ala Leu

385 390 395 400

Leu Ala Gln Val Gly Val Gly Thr Ile Asp Gln Ala Leu Leu Ala Val

405 410 415

Leu Pro Val Arg Tyr Thr Thr Ile Arg Arg Gln Gly Leu Thr Gly Lys

420 425 430

Ile Leu Cys Ile Asp Glu Ala His Thr Phe Asp Ala Tyr Met Asn Glu

435 440 445

Glu Met Lys Glu Leu Leu Thr Leu His Ala Ser Arg Gly Gly Ser Val

450 455 460

Ile Leu Leu Ser Ala Thr Leu Ser His Ala Leu Arg Thr Ala Leu Val

465 470 475 480

Asn Ala Phe Arg Lys Gly Leu Asn Leu Pro Ala Thr Thr Leu Gln Asp

485 490 495

Thr His Tyr Pro Leu Thr Thr Leu Val Ser Gly Thr Asp Ala Pro Val

500 505 510

Glu Thr Pro Cys Glu Pro Arg Pro Gly Leu Gly Arg Thr Val Arg Leu

515 520 525

Asn Arg Leu Ser Asp Val Gly Glu Ala Glu Thr Arg Val Ile Glu Leu

530 535 540

Ala Glu Thr Gly Ser Ala Ile Ala Trp Ile Arg Asn Thr Val Asp Glu

545 550 555 560

Ala Ile Ala Ser Ala Glu Ser Leu Arg Ala Lys Gly Leu Lys Val Gln

565 570 575

Leu Phe His Ala Arg Phe Ala Met Val Asp Arg Leu Glu Ile Glu Gln

580 585 590

Asp Ile Leu Arg Lys Phe Gly Lys His Ser Ser Pro Asp Gln Arg Ala

595 600 605

Gly Val Leu Val Ser Ser Gln Ile Leu Glu Gln Ser Leu Asp Leu Asp

610 615 620

Phe Asp Ser Val Ile Thr Asp Leu Ala Pro Ala Asp Leu Leu Ile Gln

625 630 635 640

Arg Ala Gly Arg Leu Trp Arg His His Arg Glu Asp Arg Pro Val Asp

645 650 655

Tyr Pro Gln Leu Asp Ile Leu Ser Pro Ser Pro Val Ser Asp Pro Asp

660 665 670

Ala Asn Trp Ile Arg Arg Val Leu Pro Gly Thr Ala Ala Val Tyr Arg

675 680 685

Asp Pro Ser Leu Leu Trp Arg Thr Ala Arg Ala Leu Phe Ala Arg Asn

690 695 700

Val Leu Arg Thr Pro Glu Asp Val Arg Ser Ile Ile Glu Glu Val Ala

705 710 715 720

Asp Thr Thr Ser Pro Gly Ser Val Pro Ala Ala Leu Glu Lys Glu Met

725 730 735

Leu Thr Thr Gln Gly Lys Asn Leu Ser Ala Gln Gly Leu Gly Arg Gln

740 745 750

Thr Val Leu Lys Thr Gly Glu Pro Tyr Asp Pro Gly Thr Gly Gln Trp

755 760 765

Asp Thr Asp Leu Gln Ala Arg Thr Arg Leu Glu Thr Asp Pro Thr Val

770 775 780

Ile Val Arg Leu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Val Ile His Pro Tyr Ala

785 790 795 800

Glu Asp Val Asp Pro Ser Gln Ala Trp Ala Leu Ser Glu Ile Arg Val

805 810 815

Ala Arg Arg Arg Leu Lys Ser Cys Pro Pro Pro Glu Gly Leu Gln Thr

820 825 830

Ala Ile Glu Thr Ile Arg Ala Ser Trp Ser Arg Trp Glu Arg Asp Ala

835 840 845

Val Glu Asp Ile Leu Val Leu Val Leu Phe Glu Ser Val Asp Gly Gly

850 855 860

Phe Glu Gly Arg Gly Leu Asp Lys Asp Asp Asn Ala Leu Met Leu Gln

865 870 875 880

Tyr His Lys Ala Thr Gly Leu Met Phe Pro Ala

885 890

<210> 4

<211> 5038

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 60

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 120

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 180

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 240

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 300

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 360

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 420

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 480

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 540

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 600

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 660

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 720

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 780

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 840

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 900

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 960

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1020

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1080

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1140

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt ttcatagaag gcggcggtgg aatcgaaatc 1200

tcgtgatggc aggttgggcg tcgcttggtc ggtcatttcg aaccccagag tcccgctcag 1260

aagaactcgt caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg 1320

taaagcacga ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta 1380

gccaacgcta tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca 1440

gaaaagcggc cattttccac catgatattc ggcaagcagg catcgccatg ggtcacgacg 1500

agatcctcgc cgtcgggcat gcgcgccttg agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc 1560

ccctgatgct cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt 1620

gctcgctcga tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta 1680

tgcagccgcc gcattgcatc agccatgatg gatactttct cggcaggagc aaggtgagat 1740

gacaggagat cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg 1800

acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct 1860

gcctcgtcct gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg 1920

cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc 1980

cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag aacctgcgtg caatccatct 2040

tgttcaatca tgcgaaacga tcccgtctat ctccaaaacc ctgcctccca cgagacaggg 2100

gtaagactga aagttcattc cagccagcat ccagattccc ggatgctgcc gaaagccctt 2160

tagcgggttc tgattaccag cgatagtgac tgaatgcctt gttagcttca gccatacggt 2220

gggtgtcttc gcgcttctta acagcagcgc cacgattgtt gaccgcgtcc atcagttcgt 2280

tggacaggcg ctcctgcatc gtgttctcac cgcgcttgcg ggaggcatcg atcagccacc 2340

ggatcgccag ggcctgacgg cgctcagcgc gcacttcgac aggcacctga taggtagcac 2400

caccgacacg acgtgagcgg acttcaacag ccggcttcac attgtccagt gccgagtgga 2460

acatggccac cgggtcagca gcgctaccac cacggttacg cagaacctca agcgcaccgt 2520

aaacgatgcc ctcagcggtg gatttctttc catcgtacat cagcgcattc atgaagcgcg 2580

tgataacgat gtctccgaac tttggatcgg gaaggatctc acgctttaca gcgcggtgac 2640

ggcgactcat tccaaatacc tcactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 2700

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatggggg 2760

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 2820

cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg 2880

acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 2940

atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct 3000

ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg atactgttgt tcgcgcgctg gcatcccaga 3060

ccggttgccg ttattaccgg ttcgagtgct ggtatgtgtt ccccgcacac gcggggatga 3120

accgtttttt tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 3180

ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 3240

gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 3300

gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaatt gggtctgtgg 3360

ttcagaacgg aaggacgcag gcgtctgagc actcggtaat cttccgaagc ctccagacgg 3420

ttggccagag cgtctagagc gcggtcagga agaggaaagt tgtccacagg cattcgggtt 3480

tcaaatagtt ttaagtgttt taaagagttt taggagcgaa aaagtcgatt ttaccgtttt 3540

ttatcaatgt cttgtaaaga agggcggttc ctaaaagacg gagtttggtt cctaaaagac 3600

ggaaatcggt tcctaaaaga cggagtttgg ttcctaaaag acggaatttt cacaggtggg 3660

tgagacagat taaggctttt caccttaaag ccgccccttc tccgtctatt aggaacctaa 3720

agaagaatgt tgcttctctg aacggtatct catgattaga agtggtccgt ctcgcccact 3780

ttcttcgtga aggtcatatt caggcaggtc gttccgttta acaaactctc taagttcgta 3840

tgaacatctt ttaaaagttc cttggctacc actacgttca taaatcaacc ggaatgacca 3900

tttagcttca tttttcccag cagctactct tgccaatcta tacagaaatc ttccgagtcc 3960

aggttttaaa aggaaataat ctggatggac ggtaagaact tcaggatttt ctgactccac 4020

taccgccgag tatagccagt tgggaagctc tatctctaca gccattacac gcccagtatc 4080

tgcatatgat atggttttgt aatcgtttat taagccagac ccagtagttt ctcggatcgt 4140

acggccactc ctagttttct tttcgccgcg aactatttca agagaagttt gtttaaggcg 4200

ccgcaaagcg gattcaaccg cttcatattg cctaccgcca tcagattgac gacaaaattt 4260

taatatgtct gatacttgag gagaaaaaat tcggccaggc ttttctccta gcccagaccg 4320

atatttattc attgcttcgg ttaaatatga aatacccatt aaaattatat catagtccca 4380

aatagacgcc atgccgtcag gaccactagt tatacgtaca taaccatcag ggagatgatg 4440

tatcattaca tcatttgcgc gtttgtcttt tttagataga cgaaatactg cgacatccat 4500

aacgccacga ttatcttttg tcgcaagatc gtataatccg ggaacaaaaa aatccccttg 4560

ctcttggtca gatggagcgg agcgaaaagt tttgctagag ggatcttttt caatacccat 4620

aagatattct tccaatacta attggatatt aaattcactt aaaaacatct ccttctaagg 4680

ctctataaat cgccatattt ataatccctg cgcgggcctg accggttctt ttggcaattt 4740

cgtcaacgcg ctgcaataat tctggggcaa tcgtcaaact gatttgccgc ttatgtcctt 4800

taggtatgcc cttgttgtat gcttctgggg gggagtttgt ggaaatcccg ccatccggtg 4860

cccccgcaat gaatgcatcc tctaccgaag gagatattgg tctctggggt ctttttaaaa 4920

tggccatttt gatatcctta tgatatttat ttaatattaa aaaggtattc agataatttt 4980

tcaagctctt tgcaagcctt tgcgtctttt acgggcatct ccgaaacagc taacccag 5038

<210> 5

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggatatgg gtatttccgg aaaggttgcc gttattaccg gttcgagtgc tggtatcggt 60

ctggctatag ctgaaggctt tgcgaaagag ggagtgcata ttgttctggt tgcccgtcag 120

gtagaacgac tgcaagaagc ggcaaaatct ctcaaggaga agtttggagt tcgcgttctt 180

gaagttgcag tcgatattgc tacgccggaa ggcgttgatg aggtcattga atccgttcaa 240

agcgcatttg gtggcgcaga cattctggta aacaatgccg ggacgggttc taacgaaaca 300

atcatggagg cttcagacga gaagtggcag ttttattggg aactgcacgt catggctgcc 360

gtccgccttg cgcgtggact ggtcccagga atgcgcgcgc gcggaggtgg ggccatcatt 420

cacaacgcat caatctgtgc tgcacagccg ttgtggtatg agcccattta caacgttaca 480

aaagcagcgt tgatgatgtt ctccaaaact ctcgctaccg aagtcgtcaa agacaacatt 540

cgggtcaact gtgttaatcc tggtcttgtc cttacgcctg actggatcaa gacagcaaag 600

gaactgacaa aagataccgg gggagactgg gaaggttatc ttcagtctgt tgcagatgaa 660

catgctccga taaagcgatt tgcatctcct gaagagttgg ccaatttctt cgtctttctg 720

gcttctgata aagcctccta cagtgtggga tcagcatact tcgttgatgg tggaatgcta 780

aagactctct ga 792

Claims (10)

1.一种敲除氧化葡萄糖酸杆菌基因的工具，其特征在于，所述工具由Cas3蛋白、crRNA、表达crRNA的启动子和表达载体组成；所述Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述crRNA由任意能够在氧化葡萄糖酸杆菌中可以表达的启动子启动；所述Cas3蛋白由氧化葡萄糖酸杆菌自身的启动子启动。

2.根据权利要求1所述的工具，其特征在于，所述表达crRNA的启动子包括启动子p_Atse，所述启动子p_Atse的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的工具，其特征在于，启动Cas3蛋白表达的启动子包括P_tufB、P_{B932_2000}或P₁₁₂。

4.根据权利要求1所述的工具，其特征在于，以p2-1载体为表达载体。

5.根据权利要求1所述的工具，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003。

6.一种敲除氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一所述工具转入氧化葡萄糖酸杆菌细胞中得到重组菌，再将重组菌培养，实现对氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的敲除或缺失。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将目的基因的上下游同源臂融合的片段与所述工具共同转入氧化葡萄糖酸杆菌中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述目的基因包括山梨糖还原酶的编码基因。

10.权利要求1～5任一所述工具，或权利要求5～9任一所述方法在氧化葡萄糖酸杆菌基因敲除中的应用。

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