CN111560058A - 枳抗寒基因PtrMYC2及其在植物抗寒遗传改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了枳抗寒基因PtrMYC2及其在植物抗寒遗传改良中的应用，PtrMYC2基因为一种从极抗寒枳（Poncirustrifoliata）中分离、克隆出的一个MYC家族类转录因子，其序列为SEQ ID NO.1所示。将该基因构建超表达和TRV2载体，并通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入烟草和枳中，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrMYC2基因具有提高植物抗寒性的功能。该基因的发现，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

Description

枳抗寒基因PtrMYC2及其在植物抗寒遗传改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及从枳(Poncirustrifoliata)中分离、克隆得到一个转录调控因子PtrMYC2，还涉及该基因在植物抗寒遗传改良中的应用，将该基因在烟草和枳中超表达，获得的转基因植物抗寒性明显提高。

背景技术

植物本身的不可移动的特性，其必须时刻监测周围环境的变化，并对环境变化做一定的反应。在不同的环境中，植物遭受着不同的环境压力，包括生物胁迫和非生物胁迫，其中生物胁迫主要有病虫害，而非生物胁迫包括低温、高温、高盐、干旱、光照不足等其他物理压力。经过长期的自然选择，植物进化出了一套抵御不利环境压力的防御机制，即在遭遇胁迫时，植物自身会在分子、细胞和生理水平做出一定改变，来抵御胁迫伤害。

温度影响着植物的生长、发育和地理分布，同时也影响着作物的产量和质量。植物在生长发育过程中会不断调节自身来适应环境温度的变化。与温度有关的植物反应包括温周期现象、热形态发生、春化、冷层积和极端温度相应(Casal and Balasubramanian,2019)。低温会破坏植物细胞膜的完整性、产生活性氧、降低酶活性，进而抑制细胞正常功能的发挥(Chinnusamy et al.,2007)，对植物生长发育产生不利影响。植物对低温胁迫的响应可分为三个不同的阶段。第一种是冷适应(预硬化)，它发生在零度以上的低温。第二阶段为硬化阶段，在此期间需要暴露在零下温度的一段时间获得耐受性，。最后阶段是冬季后的植物恢复(Li et al.2008)。在低温胁迫中，植物为生存会做出一系列复杂的代谢改变，包括脂质组成的改变、糖和脯氨酸等兼容的渗透物质的积累以及数百个基因的表达变化(Thomashow,1999)。植物代谢的改变，又受到严格的基因的控制。因此，识别鉴定寒冷胁迫下的关键基因是研究改善作物抗寒性的一个主要重点。

植物的抗逆基因主要分为调控基因和功能基因，调控基因主要参与信号转导和基因表达调控，功能基因则是直接在细胞内发挥作用。转录因子作为一类调控基因，通过与特定的顺式作用元件结合可调控一大批不同抗性基因的表达，参与不同逆境胁迫。因此，发现利用转录因子来提高植物的抗逆能力将会事半功倍。目前很多研究报道表明转录因子可提高植物抗寒性(Huang et al.,2013；Jin et al.,2016)，例如，最近研究报道CBF转录因子在在冷驯化过程中起着重要作用，调控着约170个冷相应基因的表达(Zhaoetal.,2015)。Park等(2015)工作表明至少有17个低温诱导的转录因子和CBFs表达模式相同，这些转录因子包括ZF,CZF1,RAV1,CZF2,MYB73,ZAT12,DOF1.10,ZAT10,HSFC1,DEAR1,MYB44,ERF5,CRF2,WRKY33,ERF6,CRF3和RVE2。另外，Zhao等(2017)发现MEKK1-MKK1/2-MPK4级联反应拮抗MPK3/6通路增强了冷胁迫响应。研究表明MPK6磷酸化MYB15抑制了CBF表达及冷耐受(Kimetal.,2017)。

MYC作为植物细胞重要的转录因子，其参与了植物对逆境胁迫的应答。MYC2(bHLH转录因子)是JA信号途径的核心调控者，并且在响应干旱胁迫中参与了ABA信号途径(Abe，2002；Liuetal.,2014)。JA信号通路涉及了寒冷、干旱、盐度、重金属、光照、O3等胁迫调控。JAZ-MYC模式通过整合调控基因和相关基因在JA信号通路中扮演者核心作用。目前已有研究显示MYC参与了根的生长、花青素生物合成、超敏反应、叶绿素降解、硫代葡萄糖苷的合成、抵抗虫害和病害抗性。然而涉及MYC转录因子抗寒性研究鲜见报道。基于JA在植物生长发育中的重要作用及MYC在JA通路中的核心位置，研究MYC对低温抗性的作用机制，对作物抗寒育种具有重要价值。

枳是柑橘产业中应用较广泛的一种砧木，极抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有关抗寒基因克隆问题的理想材料。因此，克隆枳抗寒有关基因是抗寒基因工程的关键和基础。

发明内容

本发明目的在于提供了一种枳抗寒基因，该基因为一种极抗寒的枳(Poncirustrifoliata)中分离、克隆出一个转录因子，申请人将其命名为PtrMYC2，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

本发明还有一目的在于提供了一种枳抗寒基因PtrMYC2在控制植物抗寒性状中的应用。将该基因在植物中超表达或沉默表达，可获得抗旱能力增强或减弱的植株。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施

申请人基于植物基因克隆技术从极抗寒枳(Poncirustrifoliata)中分离、克隆出的一个转录因子，申请人将其命名为PtrMYC2，其序列为SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；开放阅读框(ORF)预测，发现该基因含一个ORF，长度为2055bp，编码684个氨基酸的蛋白，该蛋白的分子量为74.50kDa，等电点为5.39。申请人通过分析在低温处理前后PtrMYC2转基因株系的表型及相关生理指标，结果表明：相对于非转PtrMYC2基因株系，PtrMYC2超表达株系具有明显的优势，例如，成活率、Fv/Fm、BADH活性及GB含量显著较高，电导率及MDA含量较低，然而PtrMYC2瞬时沉默株系则与之相反，表明PtrMYC2基因是一个潜在的抗寒育种基因。

枳抗寒基因PtrMYC2在植物抗寒中的应用，包括利用本领域的常规方式，将PtrMYC2基因在植株中进行超表达，可获得抗寒的转基因植株；沉默植株中PtrMYC2基因的表达，则可获得抗寒能力降低的转基因植株

以上所述的应用中，优选的，所述的植株为烟草和枳。

以上所述的应用中，优选的，通过构建PtrMYC2基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将PtrMYC2基因导入植株中。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

该基因的发现及鉴定，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

附图说明：

图1是本发明的技术流程图。

图2是本发明PtrMYC2基因亚细胞定位示意图。

图3是本发明PtrMYC2基因转录激活活性分析示意图。

其中：图3中A是本发明的PtrMYC2基因缺失片段构建模式图；图3中B是本发明的PtrMYC2基因转录激活活性检测。

图4是本发明PtrMYC2基因转基因烟草鉴定及相对表达量分析示意图。

其中：图4中A是本发明的PtrMYC2基因特异引物鉴定阳性烟草；B是PtrMYC2的相对表达量；C是NtBADH的相对表达量。

图5是本发明烟草低温处理表型和有关生理指标测定示意图。

图5中A超表达PtrMYC2基因烟草低温处理前(左)和处理后(右)的表型；B是成活率分析；C是电导率分析；D是MDA含量；E是H₂O₂和

实验结果。

图6是是烟草低温处理前后叶绿素荧光测定和Fv/Fm。

图7是烟草处理前后BADH活性和GB含量测定。

图8是本发明VIGS沉默材料鉴定及相对表达定量分析示意图。

其中，A是PtrMYC2沉默材料(PtrMYC2-TRV2)鉴定；B随机选取14株阳性材料鉴定PtrMYC2和PtrBADH相对表达量

图9是枳沉默PtrMYC2基因植株(简称TRV-PtrMYC2)抗寒性分析示意图；

其中，A是干涉PtrMYC2基因枳低温处理前(左)和处理后(右)的表型；B是沉默PtrMYC2基因枳电导率；C沉默PtrMYC2基因MDA含量；D是低温处理前后VIGS植株(简称TRV-PtrMYC2)DAB染色；E是是低温处理前后VIGS植株(简称TRV-PtrMYC2)

显色结果。

图10是枳沉默PtrMYC2基因植株BADH活性及GB含量。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：

枳PtrMYC2基因全长cDNA的克隆及超表达载体pBI121的构建

以枳cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增体系见表1，扩增程序见表2，所用引物为pBI121-MYC2超表达引物：F:5’-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGACGGACTACCGGTTACCTTC-3’和R:5’-ATAAGGGACTGACCACCCGGGTTATTGGGTATCTCCAACTTTGGC-3’。

表1基因扩增体系

表2基因扩增PCR程序

采用AxyPrep-96 DNA凝胶回收试剂盒(Axygene,USA)对扩增得到产物进行纯化回收，利用DNA无缝克隆技术，将纯化产物连接到已线性化超表达载体pBI121，然后将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板，摇菌，然后进行阳性鉴定。获得阳性克隆后，将阳性克隆送生工生物公司测序，根据测序结果，获得PtrMYC2基因全长cDNA序列。超表达载体双酶切体系见表3，重组体系见表4，阳性鉴定体系见表5。

表3双酶切体系

表4重组体系

将测序结果正确的大肠杆菌，用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen，USA)盒提取质粒，质粒命名为pBI121-PtrMYC2。将构建好的测序正确的pBI121-PtrMYC2重组载体转入农杆菌感受态细胞(GV3101)备用。

实施例2：

烟草的遗传转化及阳性鉴定

1)菌株准备：从-80℃取出保存好的转入过pBI121-PtrMYC2载体的农杆菌，用枪头吸取少量农杆菌液，置于不含抗生素的MS液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD600值到0.6-0.8以备侵染用；

2)外植体准备：选取长势良好的无菌烟草，取最大的2-3片叶片，去掉主脉及叶边缘，切成0.5cm²左右大小的方块，放入无菌且加有少量MS液体培养基的三角瓶中，供侵染用；

3)侵染及共培养：将第一步中培养好的菌液倒入装有外植体的三角瓶中，侵染10min，侵染过程中不断轻摇。侵染后，用灭菌的滤纸吸干外植体带有的菌液,叶背面向下，放于铺有无菌滤纸的共培培养基(MS+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上，培养室中暗培养3d；

4)筛选培养：共培养3d后的全部外植体收集放入无菌的三角瓶中，加入含400mg/LCef的无菌水清洗2-3次，然后再用无菌水清洗2-3次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水，置于筛选培养基(MS+400mg/L Cef+100mg/L Km+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上培养；

5)生根培养：将长至1-2cm长的抗性芽切下来，置于MS+400mg/L培养基中生根培养。

上述培养基中均含有3.0％蔗糖和0.8％琼脂，且pH值调至5.9-6.0。培养基高温高压灭菌后，待其冷却至60℃以下时，加入已过滤灭菌的抗生素，分装备用。

当抗性芽生根后，且长出2-3片叶片时，取少量叶片进行DNA提取，DNA提取步骤如下：

1)取少量烟草叶片放入1.5mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600μL CATB提取液，CTAB提取液配制方法见表5；

2)充分混匀后放入65℃水浴锅水浴90min，期间每30min颠倒混匀一次；

3)水浴完成后，加入700μL 24:1(氯仿：异戊醇)混合抽提液，剧烈颠倒混匀，常温下12000r/min离心15min，吸取上层清液(约500μL)转移至新的1.5mL离心管中；

4)加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20℃冰箱沉淀(沉淀时间可延长)；

5)沉淀完成后取出，12000r/min离心10min。倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗2-3两次，弃酒精，于通风橱内风干；

6)每管加入20-30μL ddH2O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱。

浓度检测，每个样品取1μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo,USA)测量，其OD260/OD280比值为1.8-2.0范围内时，DNA纯度较高。同时也通过凝胶电泳检测。

表5 CTAB提取液配方

利用鉴定引物，通过PCR鉴定获得了多株阳性植株(结果见图4中A)，鉴定引物序列为35S-F:5’-TCCTCGGATTCCATTGCCCAGC-3和gene-R:5’-TTATTGGGTATCTCCAACTTTGGC-3’；以及NPTII-F:5’-CGGCTATGACTGGGCACAACA-3’和NPT II-R:5’-CGGCAGGAGCAAGGTGAGATG-3’。实时荧光定量分析了阳性烟草植株中PtrMYC2和NtBADH的相对表达量，结果显示相对WT，PtrMYC2和NtBADH表达量明显升高，且两者表达模式一致(图4中B、C)，依据阳性苗鉴定结果选取了#2和#4超表达植株T2代种子用于后续分析。

实施例3：

PtrMYC2抗寒性分析

30d苗龄的盆栽转基因烟草和野生型烟草(WT)被用于低温抗性鉴定。在低温处理前，超表达PtrMYC2基因的烟草和野生型烟草没有明显的表型差异，但在-2℃处理12h后，野生型受到伤害比转基因系更严重，绝大多数的叶片都呈水渍化状态，而转基因系只有部分烟草呈现水渍化(图5中A)。恢复后统计成活率，转基因植株具有更高的成活率(图5中B)，其中#2系为84％，#4系为89％，而野生型植株的存活率仅为8％。电导率测定发现野生型烟草在低温处理后的相对电导率更高(图5中C)，说明更严重的细胞膜伤害发生在了野生型烟草中，从而导致了更严重的电解质泄漏。此外，相对于WT烟草，转基因烟草积累的MDA含量更低(图5中D)。H₂O₂和

染色实验结果显示，在低温处理后，相比野生型烟草，超表达PtrMYC2基因的烟草H₂O₂和

的积累量显著减少，说明在低温处理下转基因植株表现出更强的活性氧清除的能力。

图6中A中，处理前野生型和转基因植株叶绿素荧光都呈现深蓝色，而在处理后野生型呈现蓝色部位的面积远远小于超表达系。叶绿素荧光参数Fv/Fm值用于表征PSⅡ反应中心光能的转化效率，在没有外界胁迫时该数值趋于稳定，变化极小，而当植物遭受外界胁迫时，该参数明显降低。因此，可以通过对植物叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm值的测定来评价植物的抗逆能力。通过测定发现，处理前转基因系与野生型的Fv/Fm值无明显差异，而处理后转基因Fv/Fm值明显高于野生型(图6中B)，说明野生型在低温胁迫下伤害程度更大。

甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)是甜菜碱(glycinebetaine,GB)合成的关键酶,能通过调节植物生理生化过程参与多种非生物胁迫响应。图7结果显示，在低温处理前，野生型和转基因烟草BADH活性和GB含量差别不大，但是在低温处理后，相对与野生型，转基因系BADH活性和GB含量显著提高。综上，通过表型观察以及生理数据测定表明超表达PtrMYC2使转基因烟草具有更高的耐寒抗冻能力。

实施例4：

VIGS材料鉴定及低温抗性分析

以PtrMYC2基因序列的非保守片段设计TRV2同源重组引物，构建进TRV2基础载体，得到TRV2-PtrMYC2载体(构建及转化过程同上pBI121-PtrMYC2)，用于干涉PtrMYC2基因的正常表达。引物为Trv-F：5’-AGAAGGCCTCCATGGGGATCCGCAGAGTCTGATACAGAGGA-3’(BamHI)和Trv-R：5’-TGTCTTCGGGACATGCCCGGGTTATTGGGTATCTCCAACTTTGGC(SmaI)-3’。

采用VIGS介导的方法，将该基因进行沉默。转化的植株用两对引物检测，引物分别为TRV1-F：5’-ATTGAGGCGAAGTACGATGG-3’，TRV1-R：5’-CCATCCACAATTATTTTCCGC-3’和TRV2-F：5’-ATTCACTGGGAGATGATACGCT-3’，gene-R：5’-TTATTGGGTATCTCCAACTTTGGC-3’。，只有当转化植株能同时用两对引物扩增出条带时才被认定为阳性植株。TRV2-PtrMYC2与TRV1空载质粒共转的植株为实验组(TRV-PtrMYC2)，TRV2空载质粒与TRV1空载质粒共转为对照组(TRV)。转化后对2个月苗龄的植株做阳性鉴定，鉴定出数31棵阳性植株(图8中A)，选取14株阳性苗，对其PtrMYC2和PtrBADH进行了实时定量分析(图8中B,图8中C),结果显示，阳性植株中PtrMYC2的表达量相对于空载被抑制了1％-70％，且普遍表达量较低，说明VIGS具有较高的沉默效率。

在低温处理前，PtrMYC2沉默植株与对照植株在表型上没有明显的区别，而低温处理后，沉默植株的叶片萎蔫程度远高于对照组(图9中A)。于对照组比较，低温处理前，沉默植株与对照植株电导率和MDA含量基本一致，而低温处理后，沉默植株电导率和MDA含量显著升高(图9中B,9中C)。H₂O₂和

的积累量结果显示低温处理后，沉默株系H₂O₂和

含量明显高于对照株系。

实施例5：

PtrMYC2基因亚细胞定位和转录激活分析

扩增PtrMYC2的ORF区域(不含终止密码子)，引物序列为p101YFP-MYC2-F:5’-CGGGATCC ATGACGGACTACCGGTTACC-3’和p101YFP-MYC2-R:5’-CGGAATTCTTGGGTATCTCCAACTTTGG-3’，将目的基因构建到101LYFP载体上，YFP蛋白位于基因的3’端，表达由CaMV35S启动子驱动。35S:PtrMYC2-YFP+mCherry与对照35S:YFP+mCherry分别瞬时转化到本氏烟草的叶片表皮细胞，激光共聚焦观察荧光发现对照的荧光充满整个表皮细胞，包括细胞质、细胞核，而转化35S:PtrERF109-YFP的荧光只集中在细胞核内。说明PtrMYC2是一个核定位蛋白(图2)。

PtrMYC2基因亚细胞定位结果显示PtrMYC2是定位在核的转录因子，为了研究分析PtrMYC2转录激活活性，将该基因分为全长；MYC2-N端(1-723bp/1-241aa)—JAZ互作区，扩增引物为5’-ATGACGGACTACCGGTTACC-3’和5’-AATCACCTCAGTGGACCCCA-3’)；MYC2-C端(1417bp-2055bp/473-684aa)—bHLH互作区，扩增引物为5’-GTTGTTAAGGACCCTGATAG-3’和5’-TTATTGGGTATCTCCAACTTTGG-3’)和MYC2-mid(724-1416bp/242-472aa)—AD区，扩增引物为5’-ATTCAAAACTCGGATCTGATG-3’和5’-AGAAGCTTCAAGATCGGAATG-3’)。然后分别将PtrMYC2基因编码区序列片段连接到酵母GAL4融合表达载体pGBKT7上构建好重组载体，之后分别转化酵母AH109感受态细胞(图3中A)，在相应的缺陷培养基上检验PtrMYC2的转录激活活性。实验分别设置阳性对照和阴性对照。结果发现，所有的转化子都能在SD/-Trp缺失培养基上生长，而只有全长PtrMYC2和中间PtrMYC2-AD能在缺失培养基SD-Trp/Ade/His和SD-Trp/Ade/His+X-α-Gal上正常生长，而含有C端和N段的序列的转化体酵母不能生长，也不显蓝色(图3中B)。说明PtrMYC2-AD可以激活LacZ报告基因，然后引起β-半乳糖苷酶的分解，将X-α-Gal分解显蓝色。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 枳抗寒基因PtrMYC2及其在植物抗寒遗传改良中的应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2055

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacggact accggttacc ttcaacgatg aatctatgga ctgacgataa cggctctgta 60

atggaagctt tcatgagctc tgatttgacc agtatttggc caccttcgca gtcttctgca 120

tctacagccg accccatgaa aactcacatc tcttcatcat cccaacaaca gcaacaacaa 180

caacaattct tcaatcaaga aacactccag caacgccttc agcaattgat tgaaggctct 240

cgtgagggct ggacctacgc catattctgg caatcctcgt gcgattactc cggctcctct 300

atgttaggat ggggcgatgg gtattacaaa ggagaaggag agaaaggaaa atcatcaaaa 360

attaaaacgt cgtcagctgc ggagcaggag catcgtaaga aggtgctgcg cgaacttaac 420

tcgttgattt ctggatcaac gtcttcgccg actgatgatg ctgttgatga agaggttaca 480

gatacagaat ggttcttttt gatttcgatg actcagtctt tttacgtgac cggaggcggt 540

ggcggtggcg ggctgccggg tcaagcgtat tttggtaaca gtccggtttg ggttagcgga 600

gcggagcgac tggcgaattc aggttgtgac cgggcaagac aggggcaggt tttcgggtta 660

cagactttgg tttgtatacc gtcggcaaat ggggttgttg aattggggtc cactgaggtg 720

attattcaaa actcggatct gatgaataag gttcgatttt tgtttaattt taatggcagt 780

atggagattg gtacttggcc ttctgctatg caaaacccag atcaaggaga gaatgatcca 840

tcctcgtgga ttaatgatcc cagtcccact cccgctccca ctgcgggttt cattgaaatc 900

aaagactcta ctgctgctgc tgcaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaccagca 960

attggttctg gttccgcatc taatctttca aaaggaattc attttgagct tcccagttcg 1020

gtttctttaa ctgaaagcgt tgatttacaa catcaacaga ttccgcagac acagagtttt 1080

tttaccagag aactgaattt ctctgaatat gcatatgatc ataacagtgt gaagaacggg 1140

agttcacgtt tgcttaagcc tgagtccggg gagatattga attttgcgga gagtaagaga 1200

agttcttgta ctggtaacgg gaacaacagt ttgttttcca atcactccca atttgtagca 1260

gaggacagta ataagaagaa aagatctcct acttcgagag ggagtactga agaggggatg 1320

ctttcattta cttctggtgt gattttgcca tcatctggtg ttgtaaaatc aagtggtggt 1380

gctggtgatt ccgatcattc cgatcttgaa gcttctgttg ttaaggaccc tgatagtagc 1440

agggttgaac ctgaaaagaa gccacggaag cgggggagaa aacccgcaaa tggaagagaa 1500

gagcctttga atcatgtgga agctgagcgt caaagaagag agaagcttaa tcagagattc 1560

tacgctttgc gagctgttgt gcctaatgta tccaagatgg acaaagcttc actactaggt 1620

gatgcaattt cttatatcaa tgagcttaga acgaagcttc aaagtgcaga gtctgataca 1680

gaggatttac aaaaggaatt ggcatcagtg aagaaggagt tggcaggtgg tggcaaagat 1740

tcccaatcag ggccttcaac atctgatcaa gaccttaaaa tgtcaaacca tgctagtaaa 1800

ttgattgact tggatattga ggtgaagata attggatggg atgcgatgat taggattcaa 1860

tctagtaaga agaaccatcc tgcagcgaag ttaatgcaag ccttgaaaga gttggacttg 1920

gaagtgaatc atgcaagtat gtctgtggtg aatgatttga tgattcaaca agctactgta 1980

aagatgggaa gccggtttta cacgcaggag cagctaaaga acgtcctagc agccaaagtt 2040

ggagataccc aataa 2055

<210> 2

<211> 684

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Asp Tyr Arg Leu Pro Ser Thr Met Asn Leu Trp Thr Asp Asp

1 5 10 15

Asn Gly Ser Val Met Glu Ala Phe Met Ser Ser Asp Leu Thr Ser Ile

20 25 30

Trp Pro Pro Ser Gln Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asp Pro Met Lys Thr

35 40 45

His Ile Ser Ser Ser Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Phe Phe

50 55 60

Asn Gln Glu Thr Leu Gln Gln Arg Leu Gln Gln Leu Ile Glu Gly Ser

65 70 75 80

Arg Glu Gly Trp Thr Tyr Ala Ile Phe Trp Gln Ser Ser Cys Asp Tyr

85 90 95

Ser Gly Ser Ser Met Leu Gly Trp Gly Asp Gly Tyr Tyr Lys Gly Glu

100 105 110

Gly Glu Lys Gly Lys Ser Ser Lys Ile Lys Thr Ser Ser Ala Ala Glu

115 120 125

Gln Glu His Arg Lys Lys Val Leu Arg Glu Leu Asn Ser Leu Ile Ser

130 135 140

Gly Ser Thr Ser Ser Pro Thr Asp Asp Ala Val Asp Glu Glu Val Thr

145 150 155 160

Asp Thr Glu Trp Phe Phe Leu Ile Ser Met Thr Gln Ser Phe Tyr Val

165 170 175

Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Pro Gly Gln Ala Tyr Phe Gly

180 185 190

Asn Ser Pro Val Trp Val Ser Gly Ala Glu Arg Leu Ala Asn Ser Gly

195 200 205

Cys Asp Arg Ala Arg Gln Gly Gln Val Phe Gly Leu Gln Thr Leu Val

210 215 220

Cys Ile Pro Ser Ala Asn Gly Val Val Glu Leu Gly Ser Thr Glu Val

225 230 235 240

Ile Ile Gln Asn Ser Asp Leu Met Asn Lys Val Arg Phe Leu Phe Asn

245 250 255

Phe Asn Gly Ser Met Glu Ile Gly Thr Trp Pro Ser Ala Met Gln Asn

260 265 270

Pro Asp Gln Gly Glu Asn Asp Pro Ser Ser Trp Ile Asn Asp Pro Ser

275 280 285

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ala Gly Phe Ile Glu Ile Lys Asp Ser Thr

290 295 300

Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Pro Ala

305 310 315 320

Ile Gly Ser Gly Ser Ala Ser Asn Leu Ser Lys Gly Ile His Phe Glu

325 330 335

Leu Pro Ser Ser Val Ser Leu Thr Glu Ser Val Asp Leu Gln His Gln

340 345 350

Gln Ile Pro Gln Thr Gln Ser Phe Phe Thr Arg Glu Leu Asn Phe Ser

355 360 365

Glu Tyr Ala Tyr Asp His Asn Ser Val Lys Asn Gly Ser Ser Arg Leu

370 375 380

Leu Lys Pro Glu Ser Gly Glu Ile Leu Asn Phe Ala Glu Ser Lys Arg

385 390 395 400

Ser Ser Cys Thr Gly Asn Gly Asn Asn Ser Leu Phe Ser Asn His Ser

405 410 415

Gln Phe Val Ala Glu Asp Ser Asn Lys Lys Lys Arg Ser Pro Thr Ser

420 425 430

Arg Gly Ser Thr Glu Glu Gly Met Leu Ser Phe Thr Ser Gly Val Ile

435 440 445

Leu Pro Ser Ser Gly Val Val Lys Ser Ser Gly Gly Ala Gly Asp Ser

450 455 460

Asp His Ser Asp Leu Glu Ala Ser Val Val Lys Asp Pro Asp Ser Ser

465 470 475 480

Arg Val Glu Pro Glu Lys Lys Pro Arg Lys Arg Gly Arg Lys Pro Ala

485 490 495

Asn Gly Arg Glu Glu Pro Leu Asn His Val Glu Ala Glu Arg Gln Arg

500 505 510

Arg Glu Lys Leu Asn Gln Arg Phe Tyr Ala Leu Arg Ala Val Val Pro

515 520 525

Asn Val Ser Lys Met Asp Lys Ala Ser Leu Leu Gly Asp Ala Ile Ser

530 535 540

Tyr Ile Asn Glu Leu Arg Thr Lys Leu Gln Ser Ala Glu Ser Asp Thr

545 550 555 560

Glu Asp Leu Gln Lys Glu Leu Ala Ser Val Lys Lys Glu Leu Ala Gly

565 570 575

Gly Gly Lys Asp Ser Gln Ser Gly Pro Ser Thr Ser Asp Gln Asp Leu

580 585 590

Lys Met Ser Asn His Ala Ser Lys Leu Ile Asp Leu Asp Ile Glu Val

595 600 605

Lys Ile Ile Gly Trp Asp Ala Met Ile Arg Ile Gln Ser Ser Lys Lys

610 615 620

Asn His Pro Ala Ala Lys Leu Met Gln Ala Leu Lys Glu Leu Asp Leu

625 630 635 640

Glu Val Asn His Ala Ser Met Ser Val Val Asn Asp Leu Met Ile Gln

645 650 655

Gln Ala Thr Val Lys Met Gly Ser Arg Phe Tyr Thr Gln Glu Gln Leu

660 665 670

Lys Asn Val Leu Ala Ala Lys Val Gly Asp Thr Gln

675 680

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagaacacgg gggactctag aatgacggac taccggttac cttc 44

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataagggact gaccacccgg gttattgggt atctccaact ttggc 45

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctcggatt ccattgccca gc 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttattgggta tctccaactt tggc 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggctatgac tgggcacaac a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggcaggagc aaggtgagat g 21

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaaggcctc catggggatc cgcagagtct gatacagagg a 41

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtcttcggg acatgcccgg gttattgggt atctccaact ttggc 45

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attgaggcga agtacgatgg 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccatccacaa ttattttccg c 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

attcactggg agatgatacg ct 22

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttattgggta tctccaactt tggc 24

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgggatccat gacggactac cggttacc 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cggaattctt gggtatctcc aactttgg 28

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgacggact accggttacc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aatcacctca gtggacccca 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gttgttaagg accctgatag 20

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttattgggta tctccaactt tgg 23

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

attcaaaact cggatctgat g 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agaagcttca agatcggaat g 21

Claims (6)

1.一种从枳中分离出的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的序列，其序列为SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的序列在提高植物抗寒性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述的植物为枳或烟草。

6.根据权利要求5所述的应用，其应用过程包括：构建PtrMYC2基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将PtrMYC2基因导入烟草或枳中。

Images