KR101672446B1

KR101672446B1 - 바실러스 세레우스 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 바실러스 세레우스 검출용 매개체

Info

Publication number: KR101672446B1
Application number: KR1020150080121A
Authority: KR
Inventors: 유상렬; 공민석; 나홍준
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2016-11-03
Also published as: KR20160076416A

Abstract

본 발명은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체에 관한 것으로, 본 발명을 이용하면, 검출이 용이하지 않는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 높은 특이성과 높은 민감도로 검출할 수 있는 효과가 발휘된다.

Description

바실러스 세레우스 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 바실러스 세레우스 검출용 매개체 {Bacillus cereus cell wall binding polypeptide, bioprobe for detecting bacillus cereus}

본 발명은 바실러스 세레우스 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 바실러스 세레우스 검출용 매개체에 관한 것이다.

박테리오파지(bacteriophage)는 “세균(Bacteria)”을 “먹는다(Phage)”의 의미에서 비롯된 것으로, 간단히 파지(phage)로도 불리고 있다. 지구상에 있는 전체 세균수 보다 10배 이상 더 많다고 알려져 있으며, 세균이 있는 곳이라면 어디든지 존재할 것으로 예상되고 있다. NGS(next generation sequencing) 기술의 발달로 박테리오파지의 유전체 분석이 용이하게 되면서, 많은 파지의 유전자들이 알려지게 되었는데, 대부분 기존에 알려진 유전자와 상동성이 크지 않다는 점에서 미지의 영역이고, 가능성이 높은 분야라고 할 수 있다.

박테리오파지는 높은 숙주 특이성으로 인하여 박테리아를 검출하는데 이용되기도 한다. 다만, 박테리오파지 자체를 검출에 이용하는 경우, 높은 숙주 특이성과 안정성을 가질 수 있으나, 파지 자체의 용균 능력 때문에 적용 시 효과가 떨어진다는 단점이 있다. 게다가 박테리오파지는 단백질보다 상대적으로 훨씬 큰 크기를 가지기 때문에 박테리아 표면에 고정 시, 단백질과 비교해 적은 양이 고정됨으로 말미암아, 박테리아를 검출하는 능력이 떨어진다고 알려져 있다.

한편, 박테리오파지가 생산하는 단백질 또한 박테리아를 검출하는 데 이용할 수 있는데, 이에 해당하는 대표적인 단백질로는 박테리아 숙주 리셉터(receptor)와 결합하는 리셉터 결합 단백질(receptor binding protein, RBP)과 엔도라이신(endolysin)이 있다.

엔도라이신(Endolysin)은 박테리오파지가 숙주를 깨고 나올 때 숙주 세포벽을 분해하는 데 필요한 효소이다. 엔도라이신의 강한 용균 능력과 숙주 특이성은 최근 항생제 내성 문제와 더불어 강력한 항생제 대체 수단으로서 주목받고 있다. 엔도라이신은 주로 세포 벽(cell wall)의 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 가수분해하는 효소적 활성 도메인(enzymatic active domain, EAD)과 세포 벽(cell wall) 특정부위에 결합하는 세포벽 결합 도메인(cell wall binding domain, CBD)으로 구성되어 있는데, 독립적인 상기 두 개의 도메인(domain)이 유동적인(flexible) 링커(linker)로 연결되어 있는 구조를 가지고 있다. 이 중 CBD는 항체 이상의 강한 결합능(binding affinity)과 높은 숙주 특이성으로 인하여 병원균 검출에 검출 매개체로서 이용될 수 있는 가능성이 매우 높다 할 것이다.

한편, 박테리아의 검출에 이용되는 항체의 경우 동물을 이용하여 생산하기 때문에 절차가 복잡하고, 시간과 비용이 많이 든다는 단점이 있다. 또한, 비특이적 결합(cross-reactivity)이 많이 발생하고, 입자에 결합시 교착이 많이 일어나며, 열, pH 및 염분 농도에 민감하여 안정성이 떨어진다는 단점도 매우 크다. 따라서, 이와 같은 문제점을 해결할 수 있는 새로운 검출 매개체의 발견이 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0809547호 (등록일자: 2008.02.26)에는, gyrB와 groEL 유전자를 지표로 사용하여, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 및 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides)로 이루어진 바실러스 세레우스 그룹에 특이적인 프라이머를 제작하고, 이를 이용하여 다중효소연쇄중합반응을 실시하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스 그룹의 동시 검출방법에 대한 기술이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1339908호 (등록일자: 2013.12.04)에는, 바이오필름을 형성하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대해 생육 억제능을 나타내는 바실러스 파지 BCP-3 KCCM11215P에 대해 기재되어 있다.

본 발명은 박테리오파지의 높은 특이성을 유지하면서도 항체가 갖는 여러 단점들을 보완할 수 있는 바실러스 세레우스 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 바실러스 세레우스 검출용 매개체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 세포벽 결합 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명에서는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 세포벽에 특이적으로 결합하는 특성을 가지는 신규한 바실러스 세레우스 세포벽 결합 폴리펩타이드를 분리하였다. 본 발명의 바실러스 세레우스 세포벽 결합 폴리펩타이드는 상대적으로 작은 크기로, 높은 숙주 특이성 및 결합도를 나타내어 다양한 목적에 맞는 융합 단백질을 생산할 수 있다.

상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 세포벽 결합 폴리펩타이드는 바람직하게 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 결합되어 있는 것이 좋다. 하기 실험예에 의하면, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(링커)가 결합되어 있는 세포벽 폴리펩타이드가 우수한 바실러스 세레우스 세포벽 결합능을 나타냈기 때문이다.

한편, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체를 제공한다.

본 발명에서, '매개체'란 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 검출에 사용될 수 있는 기재, 장치 등을 포함하는 의미인데, 일 예로, 검출 키트, 검출 장치 등 일 수 있다.

상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체는 바람직하게 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합되어 있는 것이 좋다.

또한, 상기 검출용 매개체는 바람직하게 GFP(Green Fluorescent Protein)가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합되어 있는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체를 이용하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 검출하는 방법은, 일 실시예로, GFP가 삽입된 pET-28a::GFP 플라스미드를 이용할 수 있다. pET-28a 플라스미드는 T7 프로모터(T7 promoter)와 락 오퍼레이터(lac operator)를 갖고 있어 락토오즈(lactose) 및 그 유도체를 이용하여 단백질의 선택적인 과발현을 가능케 하며, 단백질에 His-tag을 융합시킬 수 있어 해당 단백질의 분리, 정제를 용이하게 해준다.

한편, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 그람양성균으로 내열성 포자를 형성하는데, 감염시 설사 및 구토를 일으킨다. 호기성 세균으로 토양, 곡류 등의 자연계에 널리 분포되어 있다. 이 균주의 포자는 다른 균주의 포자에 비해 표면 부착능이 우수하여 세척과 소독이 어려운 특징이 있다.

또한, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 조리 후, 수 시간 동안 상온에 방치된 고기, 야채, 밥, 면 등에서 포자의 발아로 증식되며, 저온살균 후의 우유, 치즈 등에서도 발아할 수 있다. 일반 음식에서는 10 CFU/g 이하 가량 존재하므로 질병을 일으키지 않으나, 1×10⁶ CFU/g 이상까지 증식하면 식중독을 일으킬 수 있다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)가 일으키는 식중독은 다른 심각한 식중독균에 비해 상대적으로 덜 심각하다고 할 수도 있으나, 내열성 독소를 생산하기 때문에 열에 대해 저항성을 보여, 억제 및 제어가 쉽지 않다.

기존에 바실러스 세레우스를 억제 및 제어하고자 하는 기술에 대해서는 다수 개시되어 있으나, 바실러스 세레우스의 세포벽에만 특이적으로 결합하는 바실러스 세레우스 검출용 매개체에 대해서는 전혀 개시된 바 없다.

본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체는 바실러스 세레우스의 세포벽에만 특이적으로 결합능을 가지며, 강한 결합능을 보인다. 이에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체를 이용하면 바실러스 세레우스의 검출 및 제어가 용이해진다.

한편, 본 발명의 상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 특정의 균주에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 종에 속하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 27348, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 14579, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 10876, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCTC 1094의 균주를 모두 포함할 수 있는 것이다.

본 발명을 이용하면, 검출이 용이하지 않는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 높은 특이성과 높은 민감도로 검출할 수 있는 효과가 발휘된다.

도 1은 박테리오 파지 PBC4의 유전체(genome)의 분석 결과이다.
도 2는 인터프로스캔(Interproscan) 및 커버된 도메인 데이터베이스(Conserved Domain Database)를 이용하여 얻은 엔도라이신(endolysin) LysPBC4의 유전자 도메인(domain) 배열 모식도이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 엔도라이신 LysPBC4와 다양한 다른 바실러스 세레우스 파지 엔도라이신(LysBCP78, B. cereus phage BCP78 endolysin; plyM19, B. anthracis prophage endolysin; LysBc431v3, B. cereus phage vB_BceM_Bc431v3 endolysin)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 4는 다양한 생물정보학 기술을 이용하여 엔도라이신 LysPBC4 구조를 예측한 결과이다. (a)는 'Pole-Bio-Informatique Lyonnals 프로그램'을 이용한 2차 구조 분석으로 LysPBC4의 EAD, 링커(linker), CBD 영역의 위치를 전체 서열 상에서 보여주고 있다. (b)는 'EsyPred 3D 프로그램'을 통한 LysPBC4의 3차 구조 분석 결과를 보여주고 있다. (c)는 1차 (아미노산 서열 비교), 2차 및 3차 구조 예측 모델을 통해 예측한 LysPBC4의 유전자 도메인 배열 모식도이다.
도 5는 박테리오파지 PBC4의 유전체(genome)로부터 CBD 유전자를 PCR 증폭한 결과이다. 레인(Lane) 1은 PBC4의 CBD를 발현할 수 있는 유전자 부위를 증폭한 결과이다. 레인 2는 PCR의 주형이 되는 DNA를 넣지 않은 음성 대조군(Negative control) 결과를 보여주고 있다. 레인 3은 증폭된 DNA의 길이를 가늠하기 위한 레더(DNA ladder)를 보여주고 있다.
도 6은 EGFP-PBC4_CBD 융합단백질의 각 조건에 따른 단백질 용해도(protein solubility)를 확인한 결과이다.
도 7은 'Ni-NTA chromatogrphy'를 이용하여 정제된 EGFP-PBC4_CBD 단백질의 사이즈를 확인한 결과이다. 레인(lane) 1은 단백질의 사이즈를 예측하기 위한 사이즈 마커(Size marker)를 보여주고 있다. 레인 2는 정제된 EGFP-PBC4-CBD를 보여주고 있다.
도 8은 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 EGFP-PBC4_CBD 결합 어세이(binding assay) 결과이다. (a)는 광학현미경 사진, (b)는 형광현미경 사진이다.
도 9는 링커(Linker)의 존재 유무에 따른 EGFP-PBC4_CBD의 바실러스 세레우스(B. cereus) 세포벽 결합능(binding activity)을 비교한 결과이다. (a)는 LysPBC4 유래 링커(linker)가 포함된 EGFP-PBC4_CBD의 유전자 도메인 배열 모식도이다. (b)는 링커(Linker)가 없는 EGFP-PBC4_CBD_NL의 유전자 도메인 배열 모식도이다. (c)는 링커(Linker)가 존재하는 EGFP-PBC4_CBD가 바실러스 세레우스(B. cereus)에 결합(binding)하여 형광을 나타내는 사진이다. (d)는 링커(Linker)가 없는 EGFP-PBC4_CBD_NL이 바실러스 세레우스(B. cereus)에 결합(binding) 하지 못하여 형광이 나타나지 않는 사진이다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실험예 1: 박테리오파지 PBC4 의 분리 및 유전체( genome ) 분석]

1. 박테리오파지 PBC4 의 분리

박테리오파지 PBC4를 분리 및 정제하고자 하였다. 수원 농촌진흥청 안에 있는 운동장의 흙으로부터 채취한 샘플을 BPD 완충용액 (Butterfield's Phosphate-buffered Dilution water)과 섞은 후 스토마커(Stomacher)를 이용하여 잘게 부수고, LB 배지에서 1차로 증식시켰다.

1차로 증식시킨 샘플을 원심분리 (10,350 rpm, 10분)하여 불순물 및 균체를 제거한 후, 박테리오파지가 포함된 상층액을 2차로 LB 배지에서 바실러스 세레우스(B. cereus) ATCC 14579 균주와 함께 증식시켰다.

2차로 증식시킨 배양액을 다시 원심분리 (10,350 rpm, 10분)하여 일부 균체를 제거한 후, 박테리오파지가 증식된 상층액을 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. 그 후, 남은 균체를 제거하고, 박테리오파지를 부분 정제하였다.

박테리오파지의 순수 분리를 위하여, 여과를 통해 부분 정제된 상층액을 바실러스 세레우스(B. cereus) ATCC 14579 균주가 자란 배양액과 같이 0.4% 몰텐 탑 아가(molten top agar)에 혼합하고, 이를 베이스 아가에 오버레이(overlay)하여 굳혔다.

이렇게 해서 굳어진 더블 아가 플레이트 (double agar plate; top + base agar)를 37℃에서 12시간 배양하고, 투명한 플라크(plaque)를 확인하였다. 형성된 개별적인 플라크를 선발하여 SM buffer(Sodium-Magnesium Sulfate buffer)에 풀어준 후 재차 여과 과정을 거쳐 다시 상층액을 얻었다.

얻어진 상층액은 더블 아가 플레이트 법을 이용하여 박테리오파지를 재차 순수 분리하였다. 이러한 싱글 플라크 선별 과정을 최소 3회 이상 시행하여 분리된 박테리오파지를 PEG 6000(Polyethylene glycol 6000)을 이용해 침전시킨 다음, CsCl 농도구배 원심분리법 (25,000 rpm, 4℃, 2시간)을 이용하여 박테리오파지를 순수하게 농축시켰다.

최종적으로 순수하게 정제 및 농축된 박테리오파지는 SM 버퍼로 투석하고, 빛이 차단된 4℃에서 보관하였다. 상기의 과정을 통해 순수하게 정제 및 농축된 박테리오파지를 'PBC4'라고 지칭하고 하기에서 사용하였다.

2. PBC4 의 유전체( genome ) 분석

상기에서 분리된 PBC4의 유전체를 분리하고, 분석하고자 하였다.

상기 PBC4의 유전체는 페놀-클로로포름(phenol-chloroform) 추출법으로 추출 및 정제하였다. 정제된 DNA는 'Macrogen' 사에 의뢰하여 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 서열 분석은 'Genome Sequencer FLX Titanium'을 이용하여 진행되었고, 각 리드(read)의 어셈블리(assembly)는 'GS De Novo Assembler v. 2.6'을 이용하여 수행되었다.

또한, 유전체가 갖고 있는 ORF의 위치는 'Glimmer 3.02, GeneMark.hmm, FgenesB'를 이용하여 예측하였다. 이 중 50개 이상의 아미노산을 갖는 단백질을 발현시키는 ORF만 선택하여 추후 분석을 진행하였다. 또한, 'NCBI'의 'BLASTP'를 통해 각 ORF에서 만들어지는 단백질의 기능을 예측하였고, 'tRNAscan-SE 프로그램'을 이용하여 tRNA의 위치를 파악하였다.

예측된 ORF의 기능에 따라 각 ORF에 적절한 이름을 명명(annotation)하였고, 기능이 파악되지 않는 ORF는 모두 가설 단백질(hypothetical protein)이라 명명하였다. 또한, ORF의 위치와 기능, tRNA의 위치 등은 모두 'CLC Genomic Workbench 6'을 통해 정리하였다.

실험결과, 박테리오파지 PBC4 유전체(genome)는 총 길이 80,647 bp, G+C 함량 33.98%의 염기 서열을 갖는 것으로 나타났다. 또한, ORF 분석 결과, 총 137개의 ORF가 예측되었으며, 그 중 아미노산이 50개 이상인 123개의 ORF가 추가 분석되었다. 또한, NCBI의 BLASTP 결과, 총 27개 ORF의 기능이 예측되었으며, 나머지 96개의 ORF는 가설 단백질(hypothetical protein)로 분류되었다. 또한, tRNA의 수는 2개였으며, 각각 트립토판(tryptophan, CCA)과 아스파르트산염(Aspartate, GTC)의 합성에 관여하는 것으로 나타났다 (도 1). 도 1은 박테리오 파지 PBC4의 유전체(genome)의 분석 결과이다.

[ 실험예 2: PBC4 로부터 세포벽 결합 폴리펩타이드의 확인]

1. ORF 에서 엔도라이신(endolysin)의 기능을 할 수 있는 라이신( lysin )의 존재 여부 확인

본 실험예에서는 PBC4로부터 세포벽 결합 폴리펩타이드 (=세포벽 결합 도메인, cell wall binding domain, CBD)를 검색하고, 확인하고자 하였다. 상기 실험예 1에서 예측된 ORF에서 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 'InterProScan'에서 보존 도메인(conserved domain)을 탐색하였고, N-터미널(N-terminal)에 반응 도메인(catalytic domain), C-터미널(C-terminal)에 결합 도메인(binding domain)이 나타나는지를 확인하였다.

전체 유전체의 ORF 분석 결과, 27개의 기능이 밝혀진 ORF 중 774개의 뉴클레오티드를 갖는 ORF가 N-아세틸머라모일-L-알라닌 아미다제(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)와의 일치도가 높은 것을 확인하였고, 해당 ORF가 만들어내는 단백질을 엔도라이신(endolysin)으로 예측하였다.

또한, InterProScan 프로그램을 이용하여 해당 단백질의 도메인을 분석한 결과, 해당 단백질은 N-터미널(N-terminal)에 용균 활성(lytic activity)이 있는 아미다제_3(Amidase_3) 도메인을 가지며, C-터미널(C-terminal)에 결합 활성(binding activity)을 지닌 아미다제02_C(Amidase02_C) 도메인을 갖는 것으로 예측되었다.

이러한 각각의 도메인은 그람 양성균을 저해하는 박테리오파지 엔도라이신(endolysin)의 전형적인 패턴을 보여주었으며, 이에 따라 해당 유전자에서 발현되는 단백질을 엔도라이신(endolysin)으로 확정하고, 그 이름을 'LysPBC4'라 명명하였다 (도 2). 도 2는 인터프로스캔(Interproscan) 및 커버된 도메인 데이터베이스(Conserved Domain Database)를 이용하여 얻은 엔도라이신(endolysin) LysPBC4의 유전자 도메인(domain) 배열 모식도이다.

2. LysPBC4의 상동성 비교

'NCBI'의 'BLASTP'를 통하여 LysPBC4와 상동성이 높은 다른 엔도라이신(endolysin)이 존재하는지 여부를 판별하고, 다른 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 파지 엔도라이신과의 아미노산 서열을 비교하였다.

실험결과, LysPBC4는 다른 탄저균(Bacillus anthracis) 파지(phage)의 엔도라이신(endolysin)인 plyM19나 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 파지(phage)의 엔도라이신(endolysin)인 LysBCP78, LysBc431v3과 N-터미널(N-terminal) EAD (Amidase_3) 부분이 보존됨(conserved)을 확인할 수 있었다. 하지만, C-터미널(C-terminal) 부분은 유사한 단백질이 하나도 발견되지 않았는데, 이를 통해 LysPBC4는 신규한 아미노산 서열을 가졌음을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 본 발명에서 분리한 엔도라이신 LysPBC4와 다양한 다른 바실러스 세레우스 파지 엔도라이신(LysBCP78, B. cereus phage BCP78 endolysin; plyM19, B. anthracis prophage endolysin; LysBc431v3, B. cereus phage vB_BceM_Bc431v3 endolysin)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

3. EAD ( enzymatic active domain ), CBD ( cell wall binding domain ) 및 링커( linker ) 부위 확인

LysPBC4의 N-터미널(N-terminal)에 존재하는 EAD(enzymatic active domain)와 C-터미널(C-terminal)에 존재하는 CBD(cell wall binding domain) 및 상기 EAD와 CBD를 이어주는 링커(linker) 부위의 위치를 예측하고자 'Pole-Bio-Informatiques Lyonnals 프로그램'을 이용하여 단백질의 2차 구조를 예측하였고, 'EsyPred 3D 프로그램'을 이용하여 단백질의 3차 구조를 예측하였다. 또한, 상기 'InterProScan'의 도메인 검색 결과 및 다른 엔도라이신(endolysin)과의 상동성 분석 결과 등을 종합하여 EAD와 링커(linker) 및 CBD의 부위를 더욱 정확하게 예측하였다.

실험결과, EAD는 1번째 아미노산 잔기에서 169번째 아미노산 잔기까지, 링커(linker)는 170번째 아미노산 잔기에서 185번째 아미노산 잔기까지, CBD는 186번째 아미노산 잔기에서 257번째 아미노산 잔기까지에 해당하는 부분인 것으로 예측되었다 (도 4). 도 4는 다양한 생물정보학 기술을 이용하여 엔도라이신 LysPBC4 구조를 예측한 결과이다. (a)는 'Pole-Bio-Informatique Lyonnals 프로그램'을 이용한 2차 구조 분석으로 LysPBC4의 EAD, 링커(linker), CBD 영역의 위치를 전체 서열 상에서 보여주고 있다. (b)는 'EsyPred 3D 프로그램'을 통한 LysPBC4의 3차 구조 분석 결과를 보여주고 있다. (c)는 1차 (아미노산 서열 비교), 2차 및 3차 구조 예측 모델을 통해 예측한 LysPBC4의 유전자 도메인 배열 모식도이다.

CBD는 서열번호 1에 기재하였고, 링커는 서열번호 2에 기재하였다.

[ 실험예 3: PBC4 유래 CBD 및 CBD 에 GFP 가 결합된 GFP _ PBC4 _ CBD 의 발현과 정제]

1. CBD 발현 및 정제

PCR을 사용하여 CBD 유전자를 증폭하였다. PCR 프라이머(primer)는 예측된 CBD의 뉴클레오티드 서열 정보를 토대로 제작되었으며, 수월한 제한효소의 처리를 위해 제한효소의 절단 부위를 각 프라이머(primer)의 양쪽 말단 부위에 삽입하여 합성하였다. 합성한 각 프라이머(primer)의 뉴클레오티드 염기 서열은 LysPBC4F(5'-gcgggatccGGACAAGAAACAAGTGGAGGTTCTAACAAT-3'), LysPBC4R(5'-gcgaagcttTTAAACTTC GTATAACTCAACGAACCAACCTT-3')이었다.

PCR 반응은 'Takara' 사의 'PrimeStar polymerase'를 사용하여 정확도를 높이고자 하였다. 증폭된 PCR 산물(product)은 'Promega'사의 'Wizard SV Gel and PCR clean up kit'를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 제한 효소인 BamHI과 HindIII를 이용하여 말단 부분을 절단하여 접착 말단(sticky end)을 만들었다. 반응이 끝난 PCR 산물은 다시 'Wizard SV Gel and PCR clean up kit'를 사용하여 정제하였다.

박테리오파지 PBC4의 유전체로부터 PBC4_CBD 및 링커(linker) 부위를 PCR로 증폭한 결과, 매우 높은 농도의 DNA 단편(fragment)을 얻을 수 있었고, 해당 단편은 링커 및 PBC4_CBD를 합친 부위와 길이가 같음을 확인할 수 있었다 (도 5). 도 5는 박테리오파지 PBC4의 유전체(genome)로부터 CBD 유전자를 PCR 증폭한 결과이다. 레인(Lane) 1은 PBC4의 CBD를 발현할 수 있는 유전자 부위를 증폭한 결과이다. 레인 2는 PCR의 주형이 되는 DNA를 넣지 않은 음성 대조군(Negative control) 결과를 보여주고 있다. 레인 3은 증폭된 DNA의 길이를 가늠하기 위한 레더(DNA ladder)를 보여주고 있다.

2. GFP _ PBC4 _ CBD 단백질의 발현 및 정제

클로닝을 진행할 벡터로는 발현 벡터인 pET-28a 플라스미드에 GFP(Green Fluorescent Protein)가 삽입된 pET-28a::EGFP 플라스미드를 사용하였다. pET-28a 플라스미드는 T7 프로모터와 락 오퍼레이터(lac operator)를 갖고 있어 락토오즈(lactose) 및 그 유도체를 이용하여 단백질의 선택적인 과발현을 가능케 하며, 단백질에 His-tag을 융합시킬 수 있어 해당 단백질의 분리, 정제를 용이하게 해준다.

pET-28a::EGFP 플라스미드는 pET-28a 플라스미드를 제한효소인 NdeI과 BamHI으로 처리하고, 그 절단 부위 사이에 EGFP 유전자를 삽입한 재조합 플라스미드이다. pET-28a::EGFP 플라스미드를 상기 PCR 산물과 마찬가지로 제한 효소인 BamHI과 HindIII를 처리하여 접착 말단(sticky end)을 갖는 선형(linear) 상태로 만든 후 'Wizard SV Gel and PCR clean up kit'를 사용하여 정제하였다.

정제된 PCR 산물과 벡터는 'Roche' 사의 'rapid DNA ligation kit'를 이용해 결합(ligation)하여 재조합 플라스미드인 pET-28a::EGFP_PBC4_CBD를 만들었다. 상기 pET-28a::EGFP_PBC4_CBD는 대장균(Escherchia coli) DH5α 컴피턴트 세포(competent cell)에 'heat shock tramsformation' 방법으로 집어넣었고, 이를 카나마이신(kanamycin) 첨가 배지에 배양하여 벡터가 들어간 세포만 자랄 수 있도록 해주었다. 또한, 항생제 첨가 배지에서 자란 단일 콜로니(single colony)를 이용하여 콜로니 PCR을 진행함으로써 자가결합(self-ligation)되어 CBD 유전자가 들어간 벡터와 CBD 유전자가 정상적으로 삽입된 벡터를 구분하였다.

CBD 유전자가 정상적으로 삽입된 벡터는 다시 한번 추출하여 유전자 서열 정보가 의도한 것과 일치하는지 확인하였다. 유전자 서열 정보가 확인된 벡터는 단백질 발현 균주인 대장균(E. coli) BL21(DE3)에 'heat shock transformation'을 통해 다시 삽입하였다.

단백질 발현은 대장균(E. coli) BL21(DE3) 클론을 LB 배지에 접종하고 37℃, 220 rpm에서 OD₆₀₀ 값이 1.0이 될 때까지 키운 후, IPTG를 일정량 넣어주고 다시 특정 온도에서 일정 시간 동안 진탕 배양함으로써 이루어졌다. 이때, IPTG 첨가 농도, 배양 온도, 배양 시간을 달리하여 최적 발현 조건을 찾아내고자 하였다 (① 37℃, 3시간 발현, IPTG 유도 없음 / ② 37℃, 3시간 발현, 0.1 mM IPTG 유도 / ③ 37℃, 3시간 발현, 1 mM IPTG 유도 / ④ 37℃, 6시간 발현, IPTG 유도 없음 / ⑤ 37℃, 6시간 발현, 0.1 mM IPTG 유도 / ⑥ 37℃, 6시간 발현, 1 mM IPTG 유도 / ⑦ 18℃, 20시간 발현, IPTG 유도 없음 / ⑧ 18℃, 20시간 발현, 0.1 mM IPTG 유도 / ⑨ 18℃, 20시간 발현, 1 mM IPTG 유도).

상기 발현 조건에서 대장균(E. coli) BL21(DE3) 클론을 50 ㎖ 배양 후, 세포(cell)를 원심분리 (10,000 × g, 1분, 4℃)를 통해 가라앉히고, 다시 이를 용균 버퍼(lysis buffer) {50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 200 mM NaCl} 5 ㎖에 재 현탁한 후, 초음파처리를 통하여 용균시켰다.

용균 후 원심분리 (21,330 × g, 60분, 4℃)를 통해 용해되지 않는 단백질(insoluble protein)을 제거하였고, 이후 다른 단백질들과 함께 섞여있는 엔도라이신을 Ni-NTA 레진(resin)에 4℃에서 1시간 가량 배양한 뒤, 이를 'Biorad' 사의 'Poly-prep chromatography column'에 통과시켜 레진에 결합하지 않은 단백질을 제거하였다.

또한, 10 mM, 20 mM 이미다졸(imidazole) 용액을 각각 10 ㎖, 5 ㎖씩 컬럼에 통과시켜 비특이적으로 결합한 단백질을 제거하였고, 마지막으로 250 mM 이미다졸 용액이 포함된 용균 버퍼를 통과시켜 레진에 결합한 것으로 예상되는 EGFP_PBC4_CBD 융합단백질을 용리(elution)시켰다.

이렇게 얻어진 단백질의 농도는 'Bradford assay'를 통해 확인하였고, 정제도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 여러 조건에서 EGFP-PBC4_CBD 융합단백질의 발현 정도 및 안정성을 시험해본 결과, EGFP-PBC4_CBD 융합단백질은 18℃에서 오랜 시간 (20시간) 발현시켰을 때가 37℃에서 짧은 시간 발현했을 때 보다 단백질 용해성(protein solubility)이 높은 것으로 확인할 수 있었다 (도 6). 이 조건으로부터 약 3 mg/㎖의 높은 농도를 갖는 단백질 샘플(stock)을 얻을 수 있었다 (도 7). 도 6은 EGFP-PBC4_CBD 융합단백질의 각 조건에 따른 단백질 용해도(protein solubility)를 확인한 결과이다. 또한, 도 7은 'Ni-NTA chromatogrphy'를 이용하여 정제된 EGFP-PBC4_CBD 단백질의 사이즈를 확인한 결과이다. 레인(lane) 1은 단백질의 사이즈를 예측하기 위한 사이즈 마커(Size marker)를 보여주고 있다. 레인 2는 정제된 EGFP-PBC4-CBD를 보여주고 있다.

이렇게 수득된 단백질을 'GE healthcare' 사의 'PD miditrap G-25 kit'를 이용해 스토리지 버퍼(storage buffer) {50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 50% glycerol}로 버퍼 교환 후, -20℃의 온도에서 보관하였다.

[ 실험예 4: 형광 현미경을 이용한 EGFP - PBC4 _ CBD 의 바실러스 세레우스( Bacillus cereus ) 세포벽 결합 여부 확인]

1. 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )에 대한 EGFP - PBC4 _ CBD 세포벽 결합 어세이( cell wall binding assay )

본 실험예에서는 상기에서 수득한 EGFP-PBC4_CBD가 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 세포벽에 결합하는지 여부를 판별하고자 EGFP-PBC4_CBD 세포벽 결합 어세이를 수행하였다.

바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 14579 균주를 OD₆₀₀ 값이 1.0이 될 때까지 키운 후, 배양액 1 ㎖를 원심분리 (21,330 × g, 1분, 4℃)를 통해 가라앉히고, 다시 반응완충용액(reaction buffer, Phosphate Buffered Saline, PBS) 200 ㎕에 재 현탁하였다.

이후, EGFP-PBC4-CBD를 400 nM이 되도록 넣어주고, 상온에서 5분간 반응시켰다. 반응 후, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 14579 균주를 원심분리 (21,330 × g, 1분, 4℃)를 통해 가라앉힌 후, PBS 500 ㎕로 세척하였으며, 총 세 차례 반복함으로써 세포에 붙지 않은 잔여 EGFP-PBC4-CBD 및 비특이적으로 결합한 단백질을 제거하였다.

세척 단계 후, 다시 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 14579 균주를 가라앉히고, PBS 20 ㎕로 재 현탁하여 얼음에 박아둠으로써 시료의 준비를 마쳤다. 각 시료들은 여기 파장(excitation wavelength) 485 nM, 방출 파장(emission wavelength) 535 nM 인 EGFP 형광 필터가 달린 형광현미경에서 관찰하였으며, 현미경의 노출 시간을 조정하며 CBD의 결합 여부를 판별하였다. 이때, 결합 세기도 간접적으로 파악하였다.

실험 결과, EGFP-PBC4_CBD를 박테리오파지 PBC4의 숙주인 바실러스 세레우스(B. cereus) ATCC 14579 균주에 결합시켰을 때, 녹색 형광이 세포 모양으로 보였다. 따라서, EGFP-PBC4_CBD가 바실러스 세레우스(B. cereus)의 세포벽에 결합 가능함을 확인할 수 있었다 (도 8). 도 8은 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 EGFP-PBC4_CBD 결합 어세이(binding assay) 결과이다. (a)는 광학현미경 사진, (b)는 형광현미경 사진이다.

2. 링커( linker ) 유무에 따른 EGFP - PBC4 _ CBD 세포벽 결합 어세이 변화 확인

본 실험에서는 EGFP-PBC4_CBD의 링커가 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 세포벽 결합능에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 링커가 존재하지 않는 재조합 폴리펩타이드를 EGFP-PBC4_CBD_NL이라고 하였고, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 EGFP-PBC4_CBD, EGFP-PBC4_CBD_NL 세포벽 결합 어세이를 수행하였다.

실험 결과, 링커가 존재하지 않는 EGFP-PBC4_CBD_NL은 결합하지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 링커 부분이 EGFP-PBC4_CBD의 세포벽 결합 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 추론할 수 있었다 (도 9). 도 9는 링커(Linker)의 존재 유무에 따른 EGFP-PBC4_CBD의 바실러스 세레우스(B. cereus) 세포벽 결합능(binding activity)을 비교한 결과이다. (a)는 LysPBC4 유래 링커(linker)가 포함된 EGFP-PBC4_CBD의 유전자 도메인 배열 모식도이다. (b)는 링커(Linker)가 없는 EGFP-PBC4_CBD_NL의 유전자 도메인 배열 모식도이다. (c)는 링커(Linker)가 존재하는 EGFP-PBC4_CBD가 바실러스 세레우스(B. cereus)에 결합(binding)하여 형광을 나타내는 사진이다. (d)는 링커(Linker)가 없는 EGFP-PBC4_CBD_NL이 바실러스 세레우스(B. cereus)에 결합(binding) 하지 못하여 형광이 나타나지 않는 사진이다.

3. EGFP - PBC4 _ CBD 의 특이성 검증

EGFP-PBC4_CBD가 특이적으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 세포벽에 결합하는지를 확인하고자, 여러 종류의 박테리아에 대한 EGFP-PBC4_CBD 세포벽 결합 어세이를 수행하였다. 박테리아의 종류는 하기 표 1과 같았다.

실험 결과, 상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, EGFP-PBC4_CBD는 실험에 사용한 9개 바실러스 세레우스(B. cereus) 균주 중 4개의 균주에 결합 가능하였고, 이외에도 같은 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹으로 분류될 수 있는 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 마이코이데스(B. mycoides)에도 결합 가능함이 확인되었다.

그러나, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)를 비롯한 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹이 아닌 경우에는 결합 하지 않았으며, 리스테리아(Listeria), 스트렙토코쿠스( Staphylococcus), 엔터로코쿠스( Enterococcus), 대장균(E. coli) 등 다른 속(genus)의 균주에 대해서도 결합하지 않았다.

이는 EGFP-PBC4_CBD가 매우 특이적으로 바실러스 세레우스(B. cereus) 그룹에 결합할 수 있음을 보여주고 있는 것이다. 또한, 현미경의 노출 시간을 줄여도 녹색 형광이 선명하게 관찰되는 것으로 보아, 강한 결합능을 가지고 있을 것으로 예상되었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Bacillus cereus cell wall binding polypeptide, bioprobe for detecting bacillus cereus <130> AP-2014-0218 <150> 10-2014-0185754 <151> 2014-12-22 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 72 <212> PRT <213> Bacteriophage PBC4 <400> 1 Lys Met Trp Val Met Lys Thr Gly Gly Leu Gly Cys Pro Leu Ala Gln 1 5 10 15 Glu Val Met Asp Lys Leu Ala Glu Phe Asn Val Thr Gly Lys Leu Val 20 25 30 Tyr Gln Gly Gln Gly Ile Phe Tyr Leu Glu Thr Asn Pro Val Ala Asp 35 40 45 Arg Asn Gln Leu Gly Ala Ile His Trp Tyr Cys Lys Asp Tyr Lys Gly 50 55 60 Trp Phe Val Glu Leu Tyr Glu Val 65 70 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Bacteriophage PBC4 <400> 2 Gly Gln Glu Thr Ser Gly Gly Ser Asn Asn Asn Thr Gly Gly Ala Ala 1 5 10 15

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 세포벽 결합 폴리펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 세포벽 결합 폴리펩타이드는,
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 세포벽 결합 폴리펩타이드.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체.
제3항에 있어서,
상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체는,
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체.
제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 검출용 매개체는,
GFP(Green Fluorescent Protein)가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 매개체.