KR101818498B1

KR101818498B1 - 클로스트리디움 퍼프린젠스 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 매개체

Info

Publication number: KR101818498B1
Application number: KR1020150056305A
Authority: KR
Inventors: 유상렬; 공민석
Original assignee: 서울대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2015-04-22
Publication date: 2018-01-15
Also published as: KR20160125639A

Abstract

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 매개체에 관한 것으로, 검출이 용이하지 않는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (C. perfreingens)를 높은 특이성과 높은 민감도로 검출할 수 있다.

Description

클로스트리디움 퍼프린젠스 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 매개체 {Clostridium perfringens cell wall binding polypeptide, bioprobe for detection of Clostridium perfringens}

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 매개체에 관한 것이다.

병원성균을 검출하는 바이오센서의 높은 숙주 특이성과 감도는 1차적으로 병원성균에 결합하는 항체의 특성에 기인한다. 그러나, 항체는 열과 pH 변화에 대한 안정성이 약하고, 교차 특이성(cross-reactivity)을 보이는 문제가 있다. 또한, 항체를 생산하는데 동물이 필요하고, 많은 비용이 소요되는 문제도 있다. 이 때문에 항체를 대신할 수 있는 새로운 검출용 매개체 개발이 절실히 요구되고 있다.

박테리오파지(bacteriophage)는 박테리아의 천적으로 지구상에 존재하는 모든 박테리아의 수보다 10배 이상 많은 것으로 추정되는데, 높은 숙주 특이성으로 인하여 박테리아를 검출하는데 이용되기도 한다. 박테리오파지 외에 박테리오파지가 생산하는 단백질 또한 박테리아를 검출하는 데에 이용할 수 있는데, 이에 해당하는 대표적인 단백질로는 박테리아 숙주 수용체와 결합하는 수용체 결합 단백질(receptor binding protein; RBP)과 엔돌라이신(endolysin)이 있다.

엔돌라이신은 박테리오파지가 숙주를 깨고 나올 때 숙주 세포벽을 분해하는데 필요한 효소로서, 강한 용균 능력과 숙주 특이성을 지니고 있기 때문에, 최근 항생제 내성 문제에 발맞춰 강력한 항생제 대체 수단으로서 주목받고 있다. 엔돌라이신은 주로 세포벽의 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 가수분해하는 효소적 활성 도메인 (enzymatic active domain; EAD)과 세포벽 특정 부위에 결합하는 세포벽 결합 도메인 (cell wall binding domain; CBD)이라는 두 개의 독립적인 도메인이 유연한(flexible) 링커(linker)로 연결되어 있는 구조를 가진다. 이중 CBD는 항체 이상의 강한 결합 친화도 (binding affinity)와 숙주 특이성을 갖기 때문에 병원균 검출에 검출 매개체로서 적극 이용될 수 있다.

대한민국 특허공개번호 제10-2012-0076710호 (2012.07.10)에는, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 균에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지(Bacteriophage)가 기재되어 있다. 또한, 대한민국 특허공개번호 제10-2012-0029137호 (2012년03월26일)에는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 장독소(CPE) 단백질의 N-말단 부위 또는 C-말단 부위에 특이적으로 결합하는 항체 및 이 항체를 유효성분으로 포함하는 CPE 단백질 검출용 조성물이 기재되어 있다.

본 발명은 박테리오파지의 높은 특이성을 유지하면서도 항체가 갖는 여러 단점들을 보완할 수 있는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 세포벽 결합 폴리펩타이드 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 매개체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 세포벽 결합 폴리펩타이드를 제공한다.

클로스트리디움 퍼프린젠스는 '가스괴저균'으로도 알려져 있는데, 가스괴저를 일으키는 그람양성, 혐기성의 간균으로, 아포를 형성한다. 쇠고기와 닭고기에서 잘 자라며, 장염의 원인이 되는데, 유아와 노인에게는 특히 중요한 병원성 균으로 보고되고 있다.

본 발명에서는 클로스트리디움 퍼프린젠스의 세포벽에 특이적으로 결합하는 특성을 가지는 신규한 클로스트리디움 퍼프린젠스 세포벽 결합 폴리펩타이드를 분리하였다. 본 발명의 클로스트리디움 퍼프린젠스 세포벽 결합 폴리펩타이드는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대해 높은 숙주 특이성 및 결합도를 나타내었다.

한편, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 검출용 매개체를 제공한다.

본 발명에서, '매개체'란 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 검출에 사용될 수 있는 기재, 장치 등을 포함하는 의미이다. 일 예로, 검출 키트, 검출 장치 등 일 수 있다.

본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 매개체는 클로스트리디움 퍼프린젠스의 세포벽에만 특이적으로 결합능을 가지며, 강한 결합능을 보인다. 이에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 매개체를 이용하면 클로스트리디움 퍼프린젠스의 검출 및 제어가 용이한 장점이 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스는 특정의 균주에 한정되지 않고, 이 종에 속하는 모든 균주를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 검출용 매개체는 바람직하게 GFP(Green Fluorescent Protein) 또는 EGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합되어 있는 것이 좋다. GFP 또는 EGFP를 이용함으로써, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 클로스트리디움 퍼프린젠스에 결합되었는지 여부를 시각적으로 용이하게 확인할 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명은 본 발명의 일 예로, '상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 검출용 매개체' 또는 'GFP 또는 EGFP가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 결합되어 있는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 검출용 매개체'를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 검출 키트를 제공한다.

본 발명에 의하면, 검출이 용이하지 않는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (C. perfreingens)를 높은 특이성과 높은 민감도로 검출할 수 있는 효과가 발휘된다.

도 1 은 C. perfringens ATCC 13124 CPF_0369 유전자 근처의 게놈 맵 (genome map) 모식도이다. 빨간 상자; CPF_0369 (Glycosyl hydrolase), 초록 상자; CPF_0370 (holin).
도 2는 본 발명 CPF_369와 다른 C. perfringens 엔돌라이신 간의 아미노산 서열 비교이다.
도 3은 (a) Pymol 프로그램을 통한 Psm 엔돌라이신의 3차 구조 분석 결과이다. EAD는 빨간색, CBD는 녹색으로 나타냄. (b) Psm 구조를 바탕으로 CPF369 단백질의 도메인 및 링커를 예측한 모식도임.
도 4는 C. perfringens ATCC 13124 콜로니로부터 CPF369_CBD 유전자 PCR 증폭 결과이다 (Lane 1 : DNA 사이즈 마커, Lane 2 : CPF369_CBD (사이즈 : 441 bp)).
도 5는 Ni-NTA 크로마토그래피를 이용하여 정제된 EGFP-CPF369_CBD 단백질을 보여준다 (사이즈: 45.4 kDa).
도 6은 C. perfringens에 대한 CPF369_CBD 결합 어세이 결과이다. 왼쪽; 광학현미경 사진, 오른쪽; 형광현미경 사진임.
도 7은 CPF369_CBD가 C. perfringens 외에 다른 박테리아에는 결합하지 못하는 것을 확인한 결과이다. 왼쪽; 광학현미경 사진, 오른쪽; 형광현미경 사진임.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 클로스트리디움 퍼프린젠스 ( C. perfreingens ) ATCC 13124의 용균성 효소 ( lytic enzyme ) 분석]

엔돌라이신(endolysin)의 EAD(enzymatic active domain)는 CBD(cell wall binding domain)에 비하면 상대적으로 보존되어(conserved) 있는 경우가 많으므로, 보고된 클로스트리디움 퍼프린젠스 파지 엔돌라이신의 EAD 아미노산 서열을 이용하여 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 검색을 수행하였다.

입력된 엔돌라이신 서열로는 클로스트리디움 퍼프린젠스 에피조말 파지 (episomal phage) phiSM101의 엔돌라이신인 Psm (NCBI accession ID: YP_699978.1)과 클로스트리디움 퍼프린젠스 파지 phi3626의 엔돌라이신인 Ply3626 (NCBI accession ID: NP_612849.1)의 아미노산 서열이 이용되었다.

클로스트리디움 퍼프린젠스 ATCC 13124는 가스 괴저(gas gangrene) 환자에서 분리된 클로스트리디움 퍼프린젠스 타입 A 균주로, 많은 양의 괴저 관련 독소(toxin)을 낸다고 알려져 있다.

Psm 엔돌라이신과 Ply3626 엔돌라이신의 아미노산 서열을 퀘리(query)로 하여 BLAST를 돌린 결과, 클로스트리디움 퍼프린젠스 ATCC 13124 균주 내에는 각각 4개의 Psm homolog와 1개의 Ply3626 homolog가 발견되었다 (표 1).

클로스트리디움 퍼프린젠스 ATCC 13124의 용균성 효소 (lytic enzymes)

Gene	Protein	AA identity(Psm)	Holin	phage genes nearby	Domain structure
CPF_1568	YP_696011	96%	No	Yes	GH25, 2×SH3_3
CPF_0973	YP_695420	93%	Yes(CPF_0971)	Yes	GH25, 2×SH3_3
CPF_0369	YP_694826	71%	Yes(CPF_0370)	No	GH25, 2×SH3_3
CPF_1521	YP_695964	22%	No	No	GH25
CPF_1753	YP_696189	64%(Ply3626)	No	No	Amidase_3

이중 CPF_0973은 기존에 연구된 PlyCM (YP_695420)과 일치하였으며, 근처에 파지 터미나아제 (phage terminase), 파지 캡시드 단백질 (phage capsid protein) 등과 같은 유전자가 있는 것으로 보아, 프로파지(prophage) 상에 존재하는 것이라고 추측되었다.

반면, CPF_1521과 CPF_1753은 주변에 홀린(holin)을 비롯한 파지 유전자가 없는 것으로 보아, 박테리아 호스트가 자체적으로 지니고 있는 오토라이신(autolysin) 일 것으로 생각되었다. 특히, CPF_1753은 'N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase'로 기존에 연구되어 있는 엔돌라이신 Ply3626과 아미노산 서열이 64% 일치하는데, 이는 파지 엔돌라이신 유전자와 숙주 오토라이신 간에 수평적 유전자 전이 (horizontal gene transfer) 등을 통해 서로 긴밀하게 진화하고 있다는 것을 암시한다.

결국, 여러 융균성 효소 (lytic enzyme) 후보군 중에서 CPF_0369 유전자를 CBD를 찾을 수 있는 후보로 선정하였는데, 이는 CPF369 (CPF_0369 유전자가 코딩하고 있는 단백질)가 '단백질 3차 구조가 밝혀진 Psm 엔돌라이신'과 유의적으로 비슷하면서(71% 일치), 동시에 C-말단에 SH3_3 도메인을 가지고 있었기 때문에, CBD를 동정하는데 상대적으로 용이할 것으로 판단되었기 때문이다. 박테리아의 SH3(bacterial Src homology) 도메인은 세포벽 펩티도글리칸에 붙는다고 알려진 도메인으로서, 많은 파지 엔돌라이신에서 CBD로 밝혀져 있다.

[ 실시예 2: CPF _0369 유전자에서 CBD 검색]

상기에서는 BLAST 분석을 통해 얻은 용균성 효소 (lytic enzyme) 후보군의 유전체(genome) 내 위치를 파악하여 근처에 홀린(holin)을 비롯한 파지 유전자의 존재 유무를 확인하였다. 그리고, 각각의 용균성 효소의 아미노산 서열을 BLAST 분석하여 기존에 알려져 있는 엔돌라이신과 일치하는 것은 제외하였다.

한편, 단백질의 아미노산 서열을 이용, InterProScan 프로그램을 통해 보존된 도메인 (conserved domain)을 탐색하였고, N-말단에 촉매 도메인 (catalytic domain), C-말단에 결합 도메인 (binding domain)이 나타나는지 확인하였다.

CBD를 유추하기 위해 ClustalX2 프로그램을 이용하여 단백질의 1차 구조인 아미노산 서열 비교 분석을 시행하였다. 그리고, PoleBioInformatiques 프로그램을 이용한 단백질 2차 구조 분석 및 EsyPred 3D 프로그램 및 pymol 프로그램을 이용하여 해당 용균성 효소의 구조를 예측하였다. 이러한 정보들을 종합하여 N-말단에 존재하는 EAD와 C-말단에 존재하는 CBD, 그리고, 그 둘을 이어주는 링커 부위의 위치를 예측하였다.

CPF_0369 유전자는 근처에 홀린 (CPF_0370) 유전자 외에 다른 파지 유전자가 발견되지 않는 것으로 보아 프로파지(prophage)의 잔유물(remnant) 부분일 것으로 추측되었다 (도 1). 도 1 은 C. perfringens ATCC 13124 CPF_0369 유전자 근처의 유전체 맵 (genome map) 모식도이다. 빨간 상자; CPF_0369 (Glycosyl hydrolase), 초록 상자; CPF_0370 (holin).

한편, CPF_0369 유전자가 코딩하는 단백질(이하 'CPF369'라 한다)은 N-말단에 글루코상드 하드롤라아제 (glucoside hydrolase) 25 family에 속하는 N-아세틸무라미다아제(N-acetylmuramidase) 도메인과 C-말단에 두 개의 반복되는 SH3_3 도메인을 가지고 있었다. CPF369 단백질은 같은 C. perfringens ATCC 13124 유전체 내에 존재하는 프로파지 라이신(lysin)인 PlyCM (CPF_0973 단백질)과 아미노산 서열이 70% 일치하였다 (도 2). 도 2는 CPF_369와 보고된 다른 C. perfringens 엔돌라이신 간의 아미노산 서열 비교이다.

한편, CPF369 단백질과 71% 일치하는 Psm은 C. perfringens 에피조말 파지인 phiSM101의 엔돌라이신으로, 실험한 대부분의 C. perfringens 균주에 강한 용균 활성을 보인다고 알려져 있다. Psm 단백질에서, C-말단의 두 개 SH3_3 도메인은 펩티도글리칸의 펩타이드 사이드 체인 (peptide side chain)을 인식하고, N-말단 촉매 도메인이 글리칸 백본 (glycan backbone)을 가수분해하는데 도움을 준다고 알려져 있다. 따라서, CPF369의 C-말단 SH3_3 영역(region)도 이와 비슷한 기능을 할 것이라 유추할 수 있었다.

Psm 단백질의 전체 구조(PDB ID: 4KRT)가 나와 있기 때문에 아미노산 서열의 비교 및 구조 정보를 통하여 CPF369의 CBD 부분을 예상할 수 있었으며, 203번 발린(valine)부터 정지코돈(stop codon)까지를 CPF369의 CBD로 예상하고 클로닝을 진행하였다 (도 3). 도 3은 (a) Pymol 프로그램을 통한 Psm 엔돌라이신의 3차 구조 분석 결과이다. EAD는 빨간색, CBD는 녹색으로 나타냄. (b) Psm 구조를 바탕으로 CPF369 단백질의 도메인 및 링커를 예측한 모식도임.

[ 실시예 3: EGFP - CPF369 _ CBD 발현 및 정제]

콜로니 PCR을 수행하여 C. perfringens ATCC 13124로부터 잠재적(putative) CBD 부위를 PCR로 증폭한 결과, 매우 높은 농도의 DNA 절편을 얻을 수 있었고, 해당 절편은 예상한 크기 (441 bp, 두 개의 제한효소 사이트 및 더미(dummy) 포함)로 확인되었다 (도 4). 도 4는 C. perfringens ATCC 13124 콜로니로부터 CPF369_CBD 유전자 PCR 증폭 결과이다 (Lane 1 : DNA 사이즈 마커, Lane 2 : CPF369_CBD (사이즈 : 441 bp)).

증폭된 PCR 산물은 'Promega' 사의 'Wizard SV Gel and PCR clean up kit'를 사용하여 정제하였다. 또한, 이 PCR 산물과 10His-pET28a::EGFP를 각각 BamHI과 HindIII로 절단하고, 접합한 후 이를 대장균(E. coli)에 형질전환(transformation)하였다. 항생제 배지에서 균이 자랐으므로, 이 재조합 플라스미드가 정상적으로 대장균에서 발현하고 있음을 확인할 수 있었다.

한편, 단백질 발현은 대장균(E. coli) BL21(DE3) 클론을 LB 배지에 접종, 37℃, 220 rpm에서 OD₆₀₀ 값이 0.7이 될 때까지 키운 후, 0.5 mM IPTG를 넣어주고 18℃에서 20시간 동안 진탕배양함으로써 이루어졌다.

이 발현 조건에서 대장균(E. coli) BL21(DE3) 클론을 50 mL 배양 후, 대장균 균체를 원심분리 (21,330×g, 1 min, 4℃)를 통해 가라앉히고, 다시 이를 라이시스 버퍼 (lysis buffer; 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 200 mM NaCl) 5 mL에 재현탁한 후, 소니케이션을 통하여 라이시스(lysis) 시켰다. 라이시스 후, 원심분리 (21,330×g, 60 min, 4℃)를 통해 불용성 단백질을 제거하였고, 이후 다른 단백질들과 함께 섞여있는 엔돌라이신을 Ni-NTA 레진(Qiagen)에 4℃에서 1시간 가량 배양한 뒤, 이를 Biorad 사의 Poly-prep 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 레진에 결합하지 않은 단백질을 제거하였다.

또한, 20 mM 이미다졸(imidazole) 용액을 컬럼에 통과시켜 비특이적(non-specific)으로 결합한 단백질을 제거하였고, 마지막으로 250 mM 이미다졸 용액이 포함된 라이시스 버퍼를 통과시켜 레진에 결합한 것으로 예상되는 EGFP_CPF369_CBD 융합단백질을 용출시켰다.

이렇게 얻어진 단백질의 농도는 Bradford assay를 통해 확인하였고, 정제도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였다 (도 5). 도 5는 Ni-NTA 크로마토그래피를 이용하여 정제된 EGFP-CPF369_CBD 단백질을 보여준다 (사이즈: 45.4 kDa).

한편, 농도와 정제도가 우수하게 나온 엔돌라이신을 'GE healthcare' 사의 'PD miditrap G-25 kit'를 이용해 스토리지 버퍼 (storage buffer; 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 50% glycerol)로 버퍼 교환 후, 최종적으로 약 2.4 mg/ml의 높은 농도를 갖는 단백질 스탁(stock)을 -20℃에서 보관하였다.

[ 실시예 4: CPF369 _ CBD 의 C. perfringens 결합 확인]

본 발명의 서열번호 1에 기재된 CPF369_CBD가 실제 세포벽에 결합하는지 여부를 판별하기 위해, EGFP-CPF369_CBD 세포벽 결합 어세이를 수행하였다. 먼저, 어세이를 수행할 박테리아 C. perfringens를 OD₆₀₀ 값이 1.0이 될 때까지 키운 후, 해당 박테리아 균체를 1 mL 원심분리 (21,330×g, 1 min, 4℃)를 통해 가라앉히고, 다시 반응버퍼(Phosphate Buffered Saline, PBS) 200 ㎕에 재현탁하였다. 여기에 상기 실시예 3에서 수득한 EGFP-CPF369_CBD를 400 nM이 되도록 넣어주고, 상온에서 5분간 반응시켰다.

반응 후, 박테리아 균체를 원심분리 (21,330×g, 1 min, 4℃)로 가라앉힌 후, PBS 500 ㎕로 세척하였으며, 총 세 차례 세척 과정을 반복함으로써 균체에 붙지 않은 잔여 EGFP-CPF369_CBD 및 비특이적으로(non-specific) 결합한 단백질을 제거하였다.

세척 과정 후, 다시 박테리아 균체를 가라앉히고, PBS 20 ㎕로 재현탁하여 얼음에 박아둠으로써 시료의 준비를 마쳤다. 각 시료들은 여기 파장 (excitation wavelength) 485 nM, 방출 파장 (emission wavelength) 535 nM 인 EGFP 형광 필터가 달린 형광현미경에서 관찰되었으며, 현미경의 노출 시간을 조정하며 CPF369_CBD의 결합 여부를 판별하였고, 결합 세기도 간접적으로 파악하였다.

EGFP-CPF369_CBD를 호스트 균주인 C. perfringens 균주와 결합시켰을 때, 녹색 형광이 균체 모양으로 보임에 따라 CPF369_CBD가 C. perfringens 세포벽에 결합 가능함을 알 수 있었다 (도 6). 도 6은 C. perfringens에 대한 CPF369_CBD 결합 어세이 결과이다. 왼쪽; 광학현미경 사진, 오른쪽; 형광현미경 사진.

한편, 여러 종류의 C. perfringens 균주에 대해 CBD 결합 어세이를 수행해 본 결과, EGFP-CPF369_CBD는 실험에 사용한 5개 C. perfringens 균주에 모두 결합 가능하였으나, 같은 클로스트리디움(Clostridium) 속(genus)에 속하는 C. indolis와 C. histobutyricum에는 결합하지 못했다. 또한, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Enterococcus, E. coli 등 다른 속 박테리아에 대해서도 결합하지 않았다 (표 2, 도 7). 도 7은 CPF369_CBD가 C. perfringens 외에 다른 박테리아에는 결합하지 못하는 것을 확인한 결과이다. 왼쪽; 광학현미경 사진, 오른쪽; 형광현미경 사진.

CPF369_CBD의 결합 스펙트럼

Species	CPF369_CBD
C. perfringens ATCC 13124	○
C. perfringens FD1	○
C. perfringens H3	○
C. perfringens H9	○
C. perfringens ATCC 3642	○
C. indolis ATCC 25771	-
C. Histobutyricum ATCC 19401	-
B. cereus ATCC 14579	-
B. subtilis ATCC 23857	-
S. aureus ATCC 29213	-
L. monocytogenes EGDe	-

이는 CPF369_CBD가 매우 특이적으로 C. perfringens에 결합할 수 있음을 보여주는 것이며, 현미경의 노출 시간을 줄여도 녹색 형광이 선명하게 관찰되는 것으로 보아, 강한 결합 친화도를 가지고 있을 것으로 예상되었다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Clostridium perfringens cell wall binding polypeptide, bioprobe for detection of Clostridium perfringens <130> AP-2015-0006 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Clostridium perfringens ATCC 13124 <400> 1 Val Lys Asn Asn Phe Lys Leu Tyr Asn Ala Thr Thr Lys Asn Val Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Leu Asn Thr Arg Glu Lys Gly Glu Ile Asp Ser Lys Ile Ile 20 25 30 Gly Lys Ile Pro Ala Gly Glu Lys Phe Met Ile Lys Trp Val Asp Ser 35 40 45 Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Ile Glu Tyr Lys Asn Ile Thr Gly Tyr 50 55 60 Val Ser Ser Lys Tyr Val Glu Lys Phe Gln Met Ala Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Val Ser Asp Phe Leu Asn Val Arg Glu Arg Gly Thr Thr Asp Ser Lys 85 90 95 Val Val Ala Ile Ile Asp Asp Gly Glu Ile Phe Arg Ile Asp Trp Val 100 105 110 Asp Ser Asp Tyr Ile Gly Trp Tyr Arg Ile Thr Thr Lys Tyr Gly Lys 115 120 125 Asn Gly Phe Val Lys Ala Asp Phe Val Lys Lys Ile 130 135 140

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것으로써, 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)에는 결합하고, 클로스트리디움 인돌리스 (Clostridium indolis), 클로스트리디움 히스토부티리쿰 (Clostridium histobutyricum), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)에는 결합하지 않는 특성을 가진 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 세포벽 결합 폴리펩타이드.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 포함하되,
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)에는 결합하고, 클로스트리디움 인돌리스 (Clostridium indolis), 클로스트리디움 히스토부티리쿰 (Clostridium histobutyricum), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)에는 결합하지 않는 특성을 지는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 매개체.
제2항에 있어서,
상기 검출용 매개체는,
GFP(Green Fluorescent Protein) 또는 EGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)가 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 검출용 매개체.
제2항 또는 제3항의 검출용 매개체를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 검출 키트.