CN104673805A - 坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白及其制备方法，涉及基因工程技术领域，填补了坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的空白。本发明提供的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:7所示。本发明首先通过染色体步移方法获得坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整核苷酸序列，在此基础上通过基因工程方法获得重组的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白，为后续相关实验提供基础。本发明采用原核表达系统，应用范围广，成本低廉，表达量高，研究背景清晰，技术路线成熟，并且有多种商业化的原核表达载体和表达宿主可供选择。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白及其制备方法。
背景技术
坏死梭杆菌是一种严格厌氧的革兰氏阴性多形态杆菌，主要分布于人和动物的口腔、胃肠道和泌尿生殖道，是一种条件致病菌，常引起人的急慢性咽喉炎(Lemierre’s syndrome)和牛、羊、鹿等反刍动物的腐蹄病和肝脓肿，多呈慢性经过，如果治疗不及时，会引起动物蹄部以及肝、肾等内脏器官出现脓肿、坏死等症状，进而影响动物的生产性能，给养殖业带来巨大经济损失。
获得某个特定蛋白质的方法主要有两种，第一种是通过分离纯化的方法获得天然的蛋白质，该方法适用于已知各种理化性质(如：分子量、等电点、疏水性、配体特异性等)的蛋白质，这样可以充分利用该蛋白质的理化性质，从天然材料中分离纯化出特定的蛋白质，但是对于一些未知蛋白或者理化性质未知的蛋白质来说，该方法显然不是经济有效的。第二种是通过体外重组的方法，借助于表达载体和表达宿主，获得重组的蛋白质，该方法是根据编码特定蛋白质的核苷酸序列，设计特异性引物，通过PCR扩增的方法，得到特定蛋白质的核苷酸序列，将该基因片段连接在表达载体上，转化或者转染表达宿主，在适宜的条件下进行表达，从而获得重组的特异性蛋白质。
目前已知细菌粘附宿主细胞是引起发病的首要步骤，而坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白具有粘附作用，因此初步推测血凝素相关外膜蛋白在坏死梭杆菌致病过程中起着重要的作用。目前，在GenBank中公布有坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的部分核苷酸序列，但是对坏死梭杆菌全基因组及梭菌属的其他细菌的研究较少，仍有许多基因包括血凝素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列是未知的，因此也就无法获得纯化度较高的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白。目前，迫切需要获得坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列，这样才能对其进行表达获得纯化度较高的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白。
发明内容
为了填补坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的空白，本发明提供一种坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白及其制备方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白，该蛋白的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:7所示。
进一步的，本发明的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的基因核苷酸序列通过染色体步移方法克隆得到。
本发明还提供一种坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的制备方法，该方法的条件和步骤如下：
步骤一、采用染色体步移方法对坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列进行克隆和测序
(1)根据公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列，设计引物：
SP1：5'-GCCCCGACTTTGATGTTTCCACTACT-3'，
SP2：5'-GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC-3'，
SP3：5'-CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA-3'，
SP4：5'-CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT-3'，
SP5：5'-GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC-3'，
SP6：5'-CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG-3'；
(2)以FN(AB)的基因组DNA为模板，Genome Walking kit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为上游引物，SP1为第一轮PCR的下游引物，SP2为第二轮PCR的下游引物，SP3为第三轮PCR的下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL FN(AB)的基因组DNA，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第一轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第三轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第二轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；PCR反应条件见具体实施方式实施例1中的表3；胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示；
(3)以FN(AB)的基因组DNA为模板，SP4为第一轮PCR的上游引物，SP5为第二轮PCR的上游引物，SP6为第三轮PCR的上游引物，Genome Walking kit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL FN(AB)的基因组DNA，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第一轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第三轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第二轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；PCR反应条件见具体实施方式实施例1中的表5；胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序后拼接为1023bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；
步骤二、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列的验证
(1)根据步骤一的测序结果，设计引物：
j1：5'-TAGTCGAGTGAGATGAAGCAAGCGGAG-3'，
J2：5'-CCCGCCGAGTGAGATGAAACGAGTAC-3'；
(2)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列的验证
以FN(AB)的基因组DNA为模板，j1为上游引物，SP3为下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的5'端未知序列；PCR反应体系见表4，PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:3所示；
(3)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列的验证
以FN(AB)的基因组DNA为模板，SP6为上游引物，j2为下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的3'端未知序列，PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH2O，PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后拼接为1000bp的核苷酸序列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:4所示；
(4)经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列与3'端未知序列的拼接与分析
经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列总长度为1248bp，与公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列重叠174个碱基，经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列总长度为1000bp，与公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列重叠272个碱基，根据重叠的核苷酸序列，将经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列、公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列和经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列拼接在一起，得到总长度为4247bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID NO:5所示；
利用NCBI在线工具预测4247bp核苷酸序列的开放阅读框，预测结果为4247bp核苷酸序列中含有从ATG到TAA共3372bp的开放阅读框，该坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，编码的1123个氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:7所示；
步骤三、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的分段克隆以及原核表达载体的构建
(1)根据步骤二中获得的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列，设计三对fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3：
fP1：5'-CCGGAATTCTATTCTGGTTCATTGGGTTGGATAAC-3'，
rP1：5'-CCGCTCGAGTTAGAAAATAACTCTTAGCCCT-3'，
fP2：5'-CCGGAATTCACAAGTACAGGTGGAAGTGCAACTTTA-3'，
rP2：5'-CCGCTCGAGTTTAAACTTTTCCCGTTCCTGGAT-3'，
fP3：5'-CCGGAATTCATGAATCAGGACTCAAGATTGTTCT-3'，
rP3：5'-CCGCTCGAGTTTAATCACTGGAATAAATAAAGGTTGC-3'；
分段扩增三个彼此部分重叠且覆盖坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白整个开放阅读框的基因片段p1、p2、p3；基因片段p1的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:8所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:9所示，基因片段p2的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:10所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:11所示，基因片段p3的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:12所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:13所示；
(2)以FN(AB)的基因组DNA为模板，以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增基因片段p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增基因片段p2；以fP3为上游引物，rP3为下游引物，PCR扩增基因片段p3；PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH2O，PCR扩增基因片段p1的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增基因片段p2的 PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增基因片段p3的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增结束后，取50μL PCR产物与上样缓冲液混匀，在1％琼脂糖凝胶中进行核酸电泳，电压100V，电泳30min后，在紫外凝胶成像仪下观察并切下含目的片段的凝胶条带，置于干净的EP管中，利用胶回收试剂盒胶回收目的片段，回收产物置于-20℃保存备用；结果得到大小分别为1203bp、1110bp、1182bp的特异性目的条带；
(3)重组克隆质粒的构建
将pEASYblunt simple克隆载体分别与胶回收的基因片段p1、p2、p3连接，连接体系为：1μL pEASYblunt simple克隆载体，4μL胶回收产物，25℃下连接30min；将5μL连接产物加入50μLE.coli Trans T1感受态细胞，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min，加入900μL LB液体培养基，置于37℃，200r/min震荡培养1h，4000r/min离心1min，弃掉800μL上清，将剩余的培养液混合均匀后涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，置于37℃温箱中培养12～14h；挑取单菌落接种于3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养9～12h，利用质粒提取试剂盒提取重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3，置于-20℃保存备用；
(4)重组克隆质粒的鉴定
以提取的重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3为模板，以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2；以fP3为上游引物，rP3为下游引物，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3；PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH2O，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；
以重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1为模板，PCR扩增获得大小为1203bp的目的条带；以重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2为模板，PCR扩增获得大小为1110bp的目的条带；以重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3为模板，PCR扩增获得大小为1182bp的目的条带，均与预期大小相符；
将PCR鉴定为阳性的重组克隆质粒用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，双酶切反应体系总体积为50μL，包括5μL 10×buffer，8μL阳性重组克隆质粒，1μL限制性内切酶EcoR I，1μL限制性内切酶Xho I，35μL ddH2O，37℃水浴30min，电泳观察酶切片段的大小：阳性重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1经酶切后，获得大小为3830bp和1203bp的目的条带；阳性重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2经酶切后，获得大小为3830bp和1110bp的目的条带；阳性重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3经酶切后，获得大小为3830bp和1182bp的目的条带，均与预期大小相符；
胶回收经过双酶切的基因片段p1、p2、p3，对双酶切鉴定正确的阳性重组克隆质粒进行测序，将测序结果与序列表中的SEQ ID NO:6进行比对，确认重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3中的基因片段p1、p2、p3序列正确；
(5)重组表达质粒的构建
原核表达载体pET-28a(+)和原核表达载体pET-32a(+)首先经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，双酶切反应体系总体积为50μL，包括5μL 10×buffer，8μL阳性重组克隆质粒，1μL限制性内切酶EcoR I，1μL限制性内切酶Xho I，35μL ddH2O，然后将上述经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的基因片段p1与经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的原核表达载体pET-28a(+)连接，经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的基因片段p2、p3与经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的原核表达载体pET-32a(+)连接，连接体系为：1μL原核表达载体，2μL 10×buffer，1μL T4DNA连接酶，16μL基因片段，置于16℃下连接过夜；将10μL连接产物加入100μLE.coli Trans T1感受态细胞，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min，加入900μL LB液体培养基，置于37℃，200r/min震荡培养1h，4000r/min离心1min，弃掉800μL上清，将剩余的培养液混合均匀后涂布于含相应抗生素的LB平板，置于37℃温箱中培养12～14h；挑取单菌落接种于3mL含相应抗生素的LB液体培养基中培养9～12h，利用质粒提取试剂盒提取重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3，置于-20℃保存备用；
(6)重组表达质粒的鉴定
以提取的重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3为模板，利用三对引物fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3分别扩增重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3：以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增重组表达质粒pET-28a-p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p2；以fP3为上游引物，rP3为下游引物，PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p3；PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH2O，PCR扩增重组表达质粒pET-28a-p1的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p2的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p3的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；
以重组表达质粒pET-28a-p1为模板，PCR扩增获得大小为1203bp的目的条带；以重组表达质粒pET-32a-p2为模板，PCR扩增获得大小为1110bp的目的条带；以重组表达质粒pET-32a-p3为模板，PCR扩增获得大小为1182bp的目的条带，均与预期大小相符；
将PCR鉴定为阳性的重组表达质粒用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，双酶切反应体系总体积为50μL，包括5μL 10×buffer，8μL阳性重组克隆质粒，1μL限制性内切酶EcoR I，1μL限制性内切酶Xho I，35μL ddH2O，37℃水浴30min，电泳观察酶切片段的大小：阳性重组表达质粒pET-28a-p1经酶切后，获得大小为5369bp和1203bp的目的条带；阳性重组表达质粒pET-32a-p2经酶切后，获得大小为5900bp和1110bp的目的条带；阳性重组表达质粒pET-32a-p3经酶切后，获得大小为5900bp和1182bp的目的条带，均与预期大小相符；
胶回收经过双酶切的基因片段p1、p2、p3，对双酶切鉴定正确的阳性重组表达质粒进行测序，将测序结果与序列表中的SEQ ID NO:6进行比对，确认重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3中基因片段p1、p2、p3序列正确；
步骤四、坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的表达与纯化
(1)坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的表达
将步骤三中鉴定正确的重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3分别转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞，挑取单菌落接种于3ml含相应抗生素的LB液体培养基中，置于37℃，200r/min震荡培养过夜；取2ml经过夜培养的菌液，接种于200ml含相应抗生素的LB液体培养基中，置于37℃，200r/min震荡培养至OD600为0.5～0.8时，分别加入终浓度为1mmol/L、0.2mmol/L、0.2mmol/L的IPTG，继续震荡培养6h，4℃下、12000r/min离心 10min收集菌体；进行SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况，在聚丙烯酰氨凝胶上观察到相对分子质量为48ku、59ku、62ku的目的条带，与预期大小相符；
(2)坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的纯化
采用蒸馏水清洗泵清洗Ni柱，流速为25ml/min；采用结合缓冲液平衡柱子，流速为1ml/min；将含有上述重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的样品分别上柱，流速为1ml/min；采用5ml结合缓冲液洗涤，流速为1ml/min；采用洗脱缓冲液线性洗脱Ni柱，流速为1ml/min；固定体积收集；取少量收集液，进行SDS-PAGE分析重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的纯度；
将经Ni柱纯化后的重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3分别进行SDS-PAGE，结果表明重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3均已经得到纯化，纯度约为90％；利用BCA微定量法测得重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的浓度分别为0.98mg/ml、4.02mg/ml、2.51mg/ml。
本发明的有益效果是：
本发明首先通过染色体步移方法获得坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整核苷酸序列，在此基础上，通过基因工程的方法获得重组的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白，从而为深入研究坏死梭杆菌的致病机理和后续相关实验提供基础。
通过体外重组，获得重组蛋白，主要借助两种表达系统，即原核表达系统和真核表达系统。本发明采用的是原核表达系统，该系统的优点是应用范围广，成本低廉，表达量高，研究背景清晰，技术路线成熟，并且有多种商业化的原核表达载体和表达宿主可供选择。常见的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统等，这两种方法的优点是重组蛋白在翻译后能够经过一定的修饰，使重组蛋白在一定程度上接近目的蛋白的天然构象，但是真核表达系统的表达量往往较低，成本较高，并且对实验条件要求严格。
附图说明
图1为坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列的PCR扩增电泳图。图中：M：2K plus DNA marker；1：AP1第一轮PCR；2：AP1第二轮PCR；3：AP1第三轮PCR；4：AP2第一轮PCR；5：AP2第二轮PCR；6：AP2第三轮PCR；7：AP3第一轮PCR；8：AP3第二轮PCR；9：AP3第三轮PCR；10：AP4第一轮PCR；11：AP4第二轮PCR；12：AP4第三轮PCR。
图2为坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列的PCR扩增电泳图。图中：M：2K plus DNA marker；1：AP1第一轮PCR；2：AP1第二轮PCR；3：AP1第三轮PCR；4：AP2第一轮PCR；5：AP2第二轮PCR；6：AP2第三轮PCR；7：AP3第一轮PCR；8：AP3第二轮PCR；9：AP3第三轮PCR；10：AP4第一轮PCR；11：AP4第二轮PCR；12：AP4第三轮PCR。
图3为验证坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列的PCR扩增电泳图。图中：M：2KDNAmarker；1：空白对照；2、3：验证5'端未知序列的PCR产物。
图4为验证坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列的PCR扩增电泳图。图中：M：2KDNAmarker；1、2：验证3'端未知序列的PCR产物；3：空白对照。
图5为基因片段p1、p2、p3的PCR扩增电泳图。图中：M：2K DNAmarker；1：基因片段p1；2：基因片段p2：3：基因片段p3；4：空白对照。
图6为重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3的PCR鉴定电泳图。图中：M：2K DNA marker；1：pEASY-Blunt-simple-p1；2：pEASY-Blunt-simple-p2；3：pEASY-Blunt-simple-p3；4：空白对照。
图7为重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3的双酶切鉴定电泳图。图中：M：8KDNA marker；1：pEASY-Blunt-simple-p1；2：pEASY-Blunt-simple-p2；3：pEASY-Blunt-simple-p3。
图8为重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3的PCR鉴定电泳图。图中：M：2KDNAmarker；1：pET-28a-p1；2：pET-32a-p2；3：pET-32a-p3；4：空白对照。
图9为重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3的双酶切鉴定电泳图。图中：M：8KDNAmarker；1：pET-28a-p1；2：pET-32a-p2；3：pET-32a-p3。
图10为重组表达质粒pET-28a-p1表达产物的SDS-PAGE分析的结果图。图中：M：蛋白质分子量标准；1：pET-28a空载体对照；2：pET-28a-p1诱导前；3：pET-28a-p1诱导后。
图11为重组表达质粒pET-32a-p2表达产物的SDS-PAGE分析的结果图。图中：M：蛋白质分子量标准；1：pET-32a空载体对照；2：pET-32a-p2诱导前；3：pET-32a-p2诱导后。
图12为重组表达质粒pET-32a-p3表达产物的SDS-PAGE分析的结果图。图中：M：蛋白质分子量标准；1：pET-32a空载体对照；2：pET-32a-p3诱导前；3：pET-32a-p3诱导后。
图13为纯化产物pET-28a-P1、pET-32a-P2和pET-32a-P3的SDS-PAGE分析的结果图。图中：M：蛋白质分子量标准；1：纯化产物pET-28a-P1；2-3：纯化产物pET-32a-P2；4-5：纯化产物pET-32a-P3。
图14为重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的Western blot分析的结果图。图中：M：蛋白质分子量标准；1：重组蛋白pET-28a-P1；2、3：重组蛋白pET-32a-P2；4、5：重组蛋白pET-32a-P3。
图15为经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列与3'端未知序列的拼接与分析示意图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
实验材料：
细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；Genome Walking kit、pMD18-T vector cloning kit均购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Axygen公司；限制性内切酶EcoR I和Xho I均购自大连宝生物公司，HisTap HP购自GE公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自SIGMA公司产品；坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)AB型菌株，简称FN(AB)，由中国农业科学院特产研究所保存；E.coli Trans T1感受态细胞、pEASY-Blunt Cloning Kit、TransStart FastPfu DNAPolymerase、E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞、pEASY blunt simple cloning kit均购自北京全式金生物技术有限公司；原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)均由中国农业科学院特产研究所保存；除上述试剂以外的其他试剂均为国产分析纯。
实施例1 坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列的克隆
1、引物的设计与合成
根据GenBank中公布的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列(公布号AF529887.1)，利用Primer Premier 5.0设计六条用于扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列的引物SP1、SP2、SP3、SP4、SP5和SP6，设计引物所遵循的原理是：引物长度为22～26nt，GC含量45～55％，Tm值60～70℃。引物序列如表1所示，以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1
| 引物名称 | 引物序列5'→3' |
| SP1 | GCCCCGACTTTGATGTTTCCACTACT |
| SP2 | GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC |
| SP3 | CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA |
| SP4 | CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT |
| SP5 | GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC |
| SP6 | CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG |
2、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列的克隆与测序
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取FN(AB)的基因组DNA，以提取的FN(AB)的基因组DNA为模板，Genome Walking kit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为上 游引物，SP1为第一轮PCR的下游引物，SP2为第二轮PCR的下游引物，SP3为第三轮PCR的下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的5'端未知序列。上述的染色体步移方法的具体操作过程参见Genome Walking kit说明书，PCR反应体系如表2所示，PCR反应条件如表3所示。
表2
表3
利用胶回收试剂盒胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，将PCR鉴定为阳性的菌液，送吉林省库美生物科技 有限公司测序。
结果如图1所示：以FN(AB)基因组DNA为模板，经过三轮PCR扩增，胶回收得到约1200bp的条带，经过测序，可以拼接为1248bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
3、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列的克隆与测序
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取FN(AB)的基因组DNA，以提取的FN(AB)的基因组DNA为模板，SP4为第一轮PCR的上游引物，SP5为第二轮PCR的上游引物，SP6为第三轮PCR的上游引物，Genome Walking kit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的3'端未知序列。上述的染色体步移方法的具体操作过程参见Genome Walking kit说明书，PCR反应体系如表4所示，PCR反应条件如表5所示。
表4
表5
利用胶回收试剂盒胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，将PCR鉴定为阳性的菌液，送吉林省库美生物科技有限公司测序。
结果如图2所示：以FN(AB)基因组DNA为模板，经过三轮PCR扩增，胶回收得到约1000bp的条带，经过测序，可以拼接为1023bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中的序列2所示。
实施例2 坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列的验证
1、引物的设计与合成
根据实施例1的测序结果，利用Primer Premier 5.0设计两条用于验证实施例1获得的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列的引物j1和j2，引物序列如表6所示，以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表6
| 引物名称 | 引物序列5'→3' |
| j1 | TAGTCGAGTGAGATGAAGCAAGCGGAG |
| j2 | CCCGCCGAGTGAGATGAAACGAGTAC |
2、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列的验证
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取FN(AB)的基因组DNA，以提取的FN(AB)的基因组DNA为模板，j1为上游引物，SP3为下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的5'端未知序列；PCR反应体系如表7所示，PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；利用胶回收试剂盒胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，将PCR鉴定正确的菌液，送吉林省库美生物科技有限公司测序。
结果如图3所示：以FN(AB)的基因组DNA为模板，用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增，胶回收1248bp的条带，经过测序，可以拼接为1248bp的核苷酸序列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列如序列表中的序列3所示。使用高保真酶进行验证的目的是为了保证核苷酸序列的准确性，同时，经过验证的核苷酸序列也是为了保证后续实验(蛋白表达和继续延伸)的顺利进行。
3、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列的验证
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取FN(AB)的基因组DNA，以提取的FN(AB)的基因组DNA为模板，SP6为上游引物，j2为下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的3'端未知序列；PCR反应体系如表7所示，PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；利用胶回收试剂盒胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，将PCR鉴定正确的菌液，送吉林省库美生物科技有限公司测序。
结果如图4所示：以FN(AB)的基因组DNA为模板，用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增，胶回收1000bp的条带，经过测序，可以拼接为1000bp的核苷酸序列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中的序列4所示。使用高保真酶进行验证的目的是为了保证核苷酸序列的准确性，同时，经过验证的核苷酸序列也是为了保证后续实验(蛋白表达和继续延伸)的顺利进行。
表7
| 试剂 | 体积(μL) |
| FN(AB)的基因组DNA | 2 |
| 上游引物(10μmol/L) | 2 |
| 下游引物(10μmol/L) | 2 |
| 5×TransStartFastPfuBuffer | 10 |
| dNTPsMixture(2.5mmol/Leach) | 5 |
| 高保真的FastPfuDNA聚合酶 | 1 |
| ddH2O | 28 |
| 总体积 | 50 |
4、经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列与3'端未知序列的拼接与分析如图15所示
已知序列即为GenBank中公布的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列(公布号AF529887.1)。经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列总长度为1248bp，该5'端未知序列与已知序列重叠174个碱基，经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列总长度为1000bp，该3'端未知序列与已知序列重叠272个碱基，根据重叠的核苷酸序列，可以将经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列、已知序列和经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列拼接在一起，得到总长度为4247bp的核苷酸序列，该核苷酸序列如序列表中的序列5所示。利用NCBI在线工具预测4247bp核苷酸序列的开放阅读框(ORF)，预测结果为4247bp核苷酸序列中含有从ATG到TAA共3372bp的开放阅读框(ORF)，该坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列如序列表中的序列6所示，编码1123个氨基酸，该坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列编码的氨基酸序列如序列表中的序列7所示。
实施例3 坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的分段克隆以及原核表达载体的构建
1、引物的设计与合成
根据实施例2中获得的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列(如序列表中的序列6所示)，利用Primer Premier 5.0设计三对用于分段扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的引物fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3，分段扩增三个彼此部分重叠且覆盖坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白整个开放阅读框(ORF)的基因片段p1、p2、p3，基因片段p1的核苷酸序列如序列表中的序列8所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的序列9所示，基因片段p2的核苷酸序列如序列表中的序列10所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的序列11所示，基因片段p3的核苷酸序列如序列表中的序列12所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的序列13所示。三对引物fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3的序列如表8所示，上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表8
2、基因片段p1、p2、p3的PCR扩增
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取FN(AB)的基因组DNA，以提取的FN(AB)的基因组DNA为模板，利用三对引物fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3分别扩增基因片段p1、p2、p3：以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增基因片段p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增基因片段p2；以fP3为上游引物，rP3为下游引物，PCR扩增基因片段p3；PCR反应体系如表9所示，PCR反应条件如表10所示；PCR扩增结束后，取50μL PCR产物与适量上样缓冲液混匀，在1％琼脂糖凝胶中进行核酸电泳，电压100V，电泳30min后，在紫外凝胶成像仪下观察并切下含目的片段的凝胶条带，置于干净的EP管中，利用胶回收试剂盒胶回收目的片段，回收产物置于-20℃保存备用。
表9
| 试剂 | 体积(μL) |
| 模板 | 2 |
| 上游引物(10μmol/L) | 2 |
| 下游引物(10μmol/L) | 2 |
| 5×TransStartFastPfuBuffer | 10 |
| dNTPsMixture(2.5mmol/Leach) | 5 |
| 高保真的FastPfuDNA聚合酶 | 1 |
| ddH2O | 28 |
| 总体积 | 50 |
表10
| 基因片段 | 预变性 | 变性 | 退火 | 延伸 | 循环 | 延伸 |
| p1 | 95℃3min | 94℃30s | 60℃30s | 72℃40s | 30 | 72℃10min |
| p2 | 95℃3min | 94℃30s | 62℃30s | 72℃40s | 30 | 72℃10min |
| p3 | 95℃3min | 94℃30s | 60℃30s | 72℃40s | 30 | 72℃10min |
结果如图5所示，以FN(AB)的基因组DNA为模板，用三对引物fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3分别进行PCR扩增，得到与预期大小相符的目的条带，在图5所示的电泳图中可见大小分别约为1203bp、1110bp、1182bp的特异性目的条带。
3、重组克隆质粒的构建
将pEASYblunt simple克隆载体分别与胶回收的基因片段p1、p2、p3连接，连接体系为：1μL pEASYblunt simple克隆载体，4μL胶回收产物，25℃下连接30min；将5μL连接产物加入50μLE.coli Trans T1感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min，迅速加入900μL LB液体培养基，置于37℃，200r/min震荡培养1h，4000r/min离心1min，弃掉800μL上清，将剩余的培养液混合均匀后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，置于37℃温箱中培养12～14h；挑取单菌落接种于3mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养9～12h，利用质粒提取试剂盒提取重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3，分别置于-20℃保存备用。
4、重组克隆质粒的鉴定
以提取的重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3为模板，利用三对引物fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3分别扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3：以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2；以fP3为上游引物，rP3 为下游引物，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3；PCR反应体系如表9所示，PCR反应条件如表11所示。
表11
PCR扩增结果如图6所示：以重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1为模板，PCR扩增获得大小约为1203bp的目的条带；以重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2为模板，PCR扩增获得大小约为1110bp的目的条带；以重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3为模板，PCR扩增获得大小约为1182bp的目的条带，均与预期大小相符。
将PCR鉴定为阳性的重组克隆质粒用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，双酶切反应体系如表12所示，37℃水浴30min，电泳观察酶切片段的大小，结果如图7所示：阳性重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1经酶切后，获得大小约为3830bp和1203bp的目的条带；阳性重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2经酶切后，获得大小约为3830bp和1110bp的目的条带；阳性重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3经酶切后，获得大小约为3830bp和1182bp的目的条带，均与预期大小相符。
利用胶回收试剂盒胶回收经过双酶切的基因片段p1、p2、p3，将双酶切鉴定正确的阳性重组克隆质粒，送吉林省库美生物科技有限公司测序。将测序结果与序列表中的序列6进行比对，可以确认重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3中的基因片段p1、p2、p3序列正确。
表12
| 试剂 | 体积(μL) |
| 10×buffer | 5 |
| 阳性重组克隆质粒 | 8 |
| 限制性内切酶EcoRI | 1 |
| 限制性内切酶XhoI | 1 |
| ddH2O | 35 |
| 总体积 | 50 |
5、重组表达质粒的构建
原核表达载体pET-28a(+)和原核表达载体pET-32a(+)首先经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，双酶切反应体系如表12所示，然后将上述经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的基因片段p1与经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的原核表达载体pET-28a(+)连接，经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的基因片段p2、p3与经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的原核表达载体pET-32a(+)连接，连接体系为：1μL原核表达载体，2μL 10×buffer，1μL T4DNA连接酶，16μL基因片段，置于16℃下连接过夜；将10μL连接产物加入100μLE.coli Trans T1感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min，迅速加入900μL LB液体培养基，置于37℃，200r/min震荡培养1h，4000r/min离心1min，弃掉800μL上清，将剩余的培养液混合均匀后涂布于含有相应抗生素的LB平板，置于37℃温箱中培养12～14h；挑取单菌落接种于3mL含有相应抗生素的LB液体培养基中培养9～12h，利用质粒提取试剂盒提取重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3，分别置于-20℃保存备用。
6、重组表达质粒的鉴定
以提取的重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3为模板，利用三对引物fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3分别扩增重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3：以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增重组表达质粒pET-28a-p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p2；以fP3为上游引物，rP3为下游引物，PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p3；PCR反应体系如表9所示，PCR反应条件如表13所示。
表13
| 重组表达质粒 | 预变性 | 变性 | 退火 | 延伸 | 循环 | 延伸 |
| pET-28a-p1 | 95℃3min | 94℃30s | 60℃30s | 72℃40s | 30次 | 72℃10min |
| pET-32a-p2 | 95℃3min | 94℃30s | 62℃30s | 72℃40s | 30次 | 72℃10min |
| pET-32a-p3 | 95℃3min | 94℃30s | 60℃30s | 72℃40s | 30次 | 72℃10min |
PCR扩增结果如图8所示：以重组表达质粒pET-28a-p1为模板，PCR扩增获得大小约为1203bp的目的条带；以重组表达质粒pET-32a-p2为模板，PCR扩增获得大小约为1110bp的目的条带；以重组表达质粒pET-32a-p3为模板，PCR扩增获得大小约为1182bp的目的条带，均与预期大小相符。
将PCR鉴定为阳性的重组表达质粒用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，双酶切反应体系如表12所示，37℃水浴30min，电泳观察酶切片段的大小，结果如图9所示：阳性重组表达质粒pET-28a-p1经酶切后，获得大小约为5369bp和1203bp的目的条带；阳性重组表达质粒pET-32a-p2经酶切后，获得大小约为5900bp和1110bp的目的条带；阳性重组表达质粒pET-32a-p3经酶切后，获得大小约为5900bp和1182bp的目的条带，均与预期大小相符。
利用胶回收试剂盒胶回收经过双酶切的基因片段p1、p2、p3，将双酶切鉴定正确的阳性重组表达质粒，送吉林省库美生物科技有限公司测序。将测序结果与序列表中的序列6进行比对，可以确认重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3中基因片段p1、p2、p3序列正确。
上述结果说明已经成功克隆并构建了重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3。
实施例4 坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的表达与纯化
1、坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的表达
将实施例3中鉴定正确的重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3分别转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞，挑取生长良好的单菌落接种于3ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，置于37℃，200r/min震荡培养过夜；取2ml经过夜培养的菌液，接种于200ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，置于37℃，200r/min震荡培养至OD600为0.5～0.8(最佳OD600为0.6)时，分别加入终浓度为1mmol/L(对应重组表达载体pET-28a-p1)、0.2mmol/L(对应重组表达载体pET-32a-p2)、0.2mmol/L(对应重组表达载体pET-32a-p3)的IPTG，继续震荡培养6h，4℃下、12000r/min离心10min收集菌体；分别另取20ml菌液于4℃下、12000r/min离心10min收集菌体，加入2ml PBS缓冲液重悬菌体，超声裂解菌体，4℃下、12000r/min离心30min，分别收集上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE分析目的蛋白(重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3)的表达情况，结果如图10、图11和图12所示，在聚丙烯酰氨凝胶上可以观察到分子质量约为48ku、59ku、62ku的目的条带，与预期大小相符。
2、坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的纯化
由于原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)自身带有六个组氨酸标签，这样可以利用Ni柱在AKTApurifier仪器上纯化重组血凝素相关外膜蛋白。首先采用蒸馏水清洗泵清洗Ni柱，流速为25ml/min；采用结合缓冲液平衡柱子，流速为1ml/min；将含有上述重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的样品分别上柱，流速为1ml/min；采用5ml结合缓冲液洗涤，流速为1ml/min；采用洗脱缓冲液线性洗脱Ni柱，流速为1ml/min；固定体积收集；取少量收集液，进行SDS-PAGE分析重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的纯度。
将经过Ni柱纯化后的重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3分别进行SDS-PAGE，结果表明重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3均已经得到纯化，纯度约为90％，如图13所示；利用BCA微定量法测得重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的浓度分别为0.98mg/ml、4.02mg/ml、2.51mg/ml。
实施例5 坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的免疫原性鉴定
利用Western blot检测方法对实施例4中获得的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的免疫原性进行鉴定，具体操作过程如下：
分别取少量的重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3，与适量上样缓冲液混匀后，进行SDS-PAGE，当溴酚蓝泳动至凝胶底部时，停止电泳，取下凝胶，将凝胶、硝酸纤维素膜(NC膜)和滤纸在转膜缓冲液中浸湿，由正极至负极依次按照滤纸、硝酸纤维素膜(NC膜)、凝胶、滤纸的顺序进行叠放，小心排出气泡，接通电源，恒流60mA转移40min。
转膜结束后，将硝酸纤维素膜(NC膜)浸入封闭液(3g牛血清白蛋白溶于100ml TBST缓冲液)中，4℃下封闭过夜；采用TBST缓冲液振荡洗涤3次，每次5min，以100倍稀释的小鼠抗坏死梭杆菌血清作为一抗，室温孵育1h；采用TBST缓冲液振荡洗涤3次，每次5min，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体作为二抗，按照1:10000比例稀释后，室温孵育1h；采用TBST缓冲液振荡洗涤3次，每次5min，加入适量的TMB显色液，显色5～10min，出现明显条带后，用蒸馏水洗涤，终止显色。
结果如图14所示：重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3均能够与小鼠抗坏死梭杆菌血清反应，表明获得的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白具有良好的免疫原性。
实施例6 截短重组血凝素相关外膜蛋白的抗原性检测
1、免疫动物
实验兔为新西兰白化兔，公兔，重4斤，购自长春市亿斯实验动物技术有限公司。实验兔经隔离观察一周，挑选精神状态良好的实验兔，随机分为四组，每组2只，第一组接种重组蛋白pET-28a-P1，第二组接种重组蛋白pET-32a-P2，第三组接种重组蛋白pET-32a-P3，第四组为对照组。免疫程序如下：第1天首免，第21天二免，第26天采血进行血清抗体效价检测，免疫剂量为500ug/只，1mL/只，首免使用弗氏完全佐剂，二免之后使用弗氏不完全佐剂，免疫方式为背部皮下分点注射。
2、血清抗体效价检测
采用双向琼脂扩散法检测血清抗体效价，具体操作过程如下：采用无菌生理盐水配制浓度为15g/L的琼脂胶，煮沸溶解后，在平皿上倾注3mm厚的琼脂薄层，凝固后在琼脂平板上打孔，孔径为3mm，孔距约为3mm，呈梅花型排列，中央孔加入50ul重组蛋白，四周孔分别加入50ul抗血清，抗血清依次按1:2、1:4、1:8、1:16、1:32稀释，放置湿盒中，37℃孵育24h，琼脂中各自扩散的抗原和相对应的抗体可在浓度比例适当处形成可见的沉淀线，根据沉淀线的有无进行血清抗体效价检测。
琼脂平板在37℃孵育24h后，观察各孔之间沉淀线的有无。结果显示，重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3免疫实验兔血清中抗体效价分别为1:32、1:16、1:16，表明获得的重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3能够诱导实验兔产生高效价抗体，说明截短重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3具有良好的抗原性。
Claims (3)
1.坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白，其特征在于，该蛋白的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:7所示。
2.根据权利要求1所述的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白，其特征在于，该蛋白的基因核苷酸序列通过染色体步移方法克隆得到。
3.制备如权利要求1所述的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下：
步骤一、采用染色体步移方法对坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列进行克隆和测序
(1)根据公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列，设计引物：
SP1：5'-GCCCCGACTTTGATGTTTCCACTACT-3'，
SP2：5'-GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC-3'，
SP3：5'-CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA-3'，
SP4：5'-CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT-3'，
SP5：5'-GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC-3'，
SP6：5'-CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG-3'；
(2)以FN(AB)的基因组DNA为模板，Genome Walking kit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为上游引物，SP1为第一轮PCR的下游引物，SP2为第二轮PCR的下游引物，SP3为第三轮PCR的下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL FN(AB)的基因组DNA，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第一轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第三轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第二轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；PCR反应条件见表1；胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示；
表1
(3)以FN(AB)的基因组DNA为模板，SP4为第一轮PCR的上游引物，SP5为第二轮PCR的上游引物，SP6为第三轮PCR的上游引物，Genome Walking kit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL FN(AB)的基因组DNA，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第一轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第三轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第二轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq，1μL浓度为100pmo/μL的上游引物，1μL浓度为10pmo/μL的下游引物，33.5μLddH2O；PCR反应条件见表2；胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序后拼接为1023bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；
表2
步骤二、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列的验证
(1)根据步骤一的测序结果，设计引物：
j1：5'-TAGTCGAGTGAGATGAAGCAAGCGGAG-3'，
J2：5'-CCCGCCGAGTGAGATGAAACGAGTAC-3'；
(2)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列的验证
以FN(AB)的基因组DNA为模板，j1为上游引物，SP3为下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的5'端未知序列；PCR反应体系见表4，PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:3所示；
(3)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列的验证
以FN(AB)的基因组DNA为模板，SP6为上游引物，j2为下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的3'端未知序列，PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPsMixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH2O，PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coli Trans T1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后拼接为1000bp的核苷酸序列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:4所示；
(4)经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列与3'端未知序列的拼接与分析
经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列总长度为1248bp，与公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列重叠174个碱基，经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列总长度为1000bp，与公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列重叠272个碱基，根据重叠的核苷酸序列，将经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列、公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列和经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列拼接在一起，得到总长度为4247bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID NO:5所示；
利用NCBI在线工具预测4247bp核苷酸序列的开放阅读框，预测结果为4247bp核苷酸序列中含有从ATG到TAA共3372bp的开放阅读框，该坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，编码的1123个氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:7所示；
步骤三、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的分段克隆以及原核表达载体的构建
(1)根据步骤二中获得的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列，设计三对fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3：
fP1：5'-CCGGAATTCTATTCTGGTTCATTGGGTTGGATAAC-3'，
rP1：5'-CCGCTCGAGTTAGAAAATAACTCTTAGCCCT-3'，
fP2：5'-CCGGAATTCACAAGTACAGGTGGAAGTGCAACTTTA-3'，
rP2：5'-CCGCTCGAGTTTAAACTTTTCCCGTTCCTGGAT-3'，
fP3：5'-CCGGAATTCATGAATCAGGACTCAAGATTGTTCT-3'，
rP3：5'-CCGCTCGAGTTTAATCACTGGAATAAATAAAGGTTGC-3'；
分段扩增三个彼此部分重叠且覆盖坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白整个开放阅读框的基因片段p1、p2、p3；基因片段p1的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:8所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:9所示，基因片段p2的核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO:10所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:11所示，基因片段p3的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:12所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:13所示；
(2)以FN(AB)的基因组DNA为模板，以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增基因片段p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增基因片段p2；以fP3为上游引物，rP3为下游引物，PCR扩增基因片段p3；PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStartFastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH2O，PCR扩增基因片段p1的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增基因片段p2的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增基因片段p3的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增结束后，取50μL PCR产物与上样缓冲液混匀，在1％琼脂糖凝胶中进行核酸电泳，电压100V，电泳30min后，在紫外凝胶成像仪下观察并切下含目的片段的凝胶条带，置于干净的EP管中，利用胶回收试剂盒胶回收目的片段，回收产物置于-20℃保存备用；结果得到大小分别为1203bp、1110bp、1182bp的特异性目的条带；
(3)重组克隆质粒的构建
将pEASYblunt simple克隆载体分别与胶回收的基因片段p1、p2、p3连接，连接体系为：1μL pEASYblunt simple克隆载体，4μL胶回收产物，25℃下连接30min；将5μL连接产物加入50μLE.coli Trans T1感受态细胞，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min，加入900μLLB液体培养基，置于37℃，200r/min震荡培养1h，4000r/min离心1min，弃掉800μL上清，将剩余的培养液混合均匀后涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，置于37℃温箱中培养12～14h；挑取单菌落接种于3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养9～12h，利用质粒提取试剂盒提取重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3，置于-20℃保存备用；
(4)重组克隆质粒的鉴定
以提取的重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3为模板，以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2；以fP3为上游引物，rP3为下游引物，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3；PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH2O，PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；
以重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1为模板，PCR扩增获得大小为1203bp的目的条带；以重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2为模板，PCR扩增获得大小为1110bp的目的条带；以重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3为模板，PCR扩增获得大小为1182bp的目的条带，均与预期大小相符；
将PCR鉴定为阳性的重组克隆质粒用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，双酶切反应体系总体积为50μL，包括5μL 10×buffer，8μL阳性重组克隆质粒，1μL限制性内切酶EcoR I，1μL限制性内切酶Xho I，35μL ddH2O，37℃水浴30min，电泳观察酶切片段的大小：阳性重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1经酶切后，获得大小为3830bp和1203bp的目的条带；阳性重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p2经酶切后，获得大小为3830bp和1110bp的目的条带；阳性重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p3经酶切后，获得大小为3830bp和1182bp的目的条带，均与预期大小相符；
胶回收经过双酶切的基因片段p1、p2、p3，对双酶切鉴定正确的阳性重组克隆质粒进行测序，将测序结果与序列表中的SEQ ID NO:6进行比对，确认重组克隆质粒pEASY-Blunt-simple-p1、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt-simple-p3中的基因片段p1、p2、p3序列正确；
(5)重组表达质粒的构建
原核表达载体pET-28a(+)和原核表达载体pET-32a(+)首先经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，双酶切反应体系总体积为50μL，包括5μL 10×buffer，8μL阳性重组克隆质粒，1μL限制性内切酶EcoR I，1μL限制性内切酶Xho I，35μL ddH2O，然后将上述经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的基因片段p1与经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的原核表达载体pET-28a(+)连接，经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的基因片段p2、p3与经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切的原核表达载体pET-32a(+)连接，连接体系为：1μL原核表达载体，2μL 10×buffer，1μL T4DNA连接酶，16μL基因片段，置于16℃下连接过夜；将10μL连接产物加入100μLE.coli Trans T1感受态细胞，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min，加入900μL LB液体培养基，置于37℃，200r/min震荡培养1h，4000r/min离心1min，弃掉800μL上清，将剩余的培养液混合均匀后涂布于含相应抗生素的LB平板，置于37℃温箱中培养12～14h；挑取单菌落接种于3mL含相应抗生素的LB液体培养基中培养9～12h，利用质粒提取试剂盒提取重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3，置于-20℃保存备用；
(6)重组表达质粒的鉴定
以提取的重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3为模板，利用三对引物fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3分别扩增重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3：以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增重组表达质粒pET-28a-p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p2；以fP3为上游引物，rP3为下游引物，PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p3；PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL浓度为2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μLddH2O，PCR扩增重组表达质粒pET-28a-p1的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p2的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；PCR扩增重组表达质粒pET-32a-p3的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环，72℃延伸10min；
以重组表达质粒pET-28a-p1为模板，PCR扩增获得大小为1203bp的目的条带；以重组表达质粒pET-32a-p2为模板，PCR扩增获得大小为1110bp的目的条带；以重组表达质粒pET-32a-p3为模板，PCR扩增获得大小为1182bp的目的条带，均与预期大小相符；
将PCR鉴定为阳性的重组表达质粒用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，双酶切反应体系总体积为50μL，包括5μL 10×buffer，8μL阳性重组克隆质粒，1μL限制性内切酶EcoR I，1μL限制性内切酶Xho I，35μL ddH2O，37℃水浴30min，电泳观察酶切片段的大小：阳性重组表达质粒pET-28a-p1经酶切后，获得大小为5369bp和1203bp的目的条带；阳性重组表达质粒pET-32a-p2经酶切后，获得大小为5900bp和1110bp的目的条带；阳性重组表达质粒pET-32a-p3经酶切后，获得大小为5900bp和1182bp的目的条带，均与预期大小相符；
胶回收经过双酶切的基因片段p1、p2、p3，对双酶切鉴定正确的阳性重组表达质粒进行测序，将测序结果与序列表中的SEQ ID NO:6进行比对，确认重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3中基因片段p1、p2、p3序列正确；
步骤四、坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的表达与纯化
(1)坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的表达
将步骤三中鉴定正确的重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3分别转化E.coliBL21(DE3)pLysS感受态细胞，挑取单菌落接种于3ml含相应抗生素的LB液体培养基中，置于37℃，200r/min震荡培养过夜；取2ml经过夜培养的菌液，接种于200ml含相应抗生素的LB液体培养基中，置于37℃，200r/min震荡培养至OD600为0.5～0.8时，分别加入终浓度为1mmol/L、0.2mmol/L、0.2mmol/L的IPTG，继续震荡培养6h，4℃下、12000r/min离心10min收集菌体；进行SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况，在聚丙烯酰氨凝胶上观察到相对分子质量为48ku、59ku、62ku的目的条带，与预期大小相符；
(2)坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的纯化
采用蒸馏水清洗泵清洗Ni柱，流速为25ml/min；采用结合缓冲液平衡柱子，流速为1ml/min；将含有上述重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的样品分别上柱，流速为1ml/min；采用5ml结合缓冲液洗涤，流速为1ml/min；采用洗脱缓冲液线性洗脱Ni柱，流速为1ml/min；固定体积收集；取少量收集液，进行SDS-PAGE分析重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的纯度；
将经Ni柱纯化后的重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3分别进行SDS-PAGE，结果表明重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3均已经得到纯化，纯度约为90％；利用BCA微定量法测得重组蛋白pET-28a-P1、pET-32a-P2、pET-32a-P3的浓度分别为0.98mg/ml、4.02mg/ml、2.51mg/ml。
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| CN103805532A (zh) * | 2013-06-14 | 2014-05-21 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种坏死梭杆菌重组omp蛋白及制备方法 |
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