KR102577986B1 - 혈중 암모니아 수치 저하능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 신경세포 보호용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈중 암모니아 수치 저하능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 체내에서 암모니아 제거 효능을 가지고 있어 혈중 암모니아 수치를 저하시킴으로써 신경세포 보호기능을 갖는 단일 균주 또는 이와 상리공생 관계인 균주 조합 및 이를 포함하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다.
상기 혈중 암모니아 수치를 저하시킴으로써 신경세포 보호기능을 갖는 균주는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 및 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 균주 및 조성물은 신경 독성물질인 암모니아 제거능이 우수하므로 신경세포 보호 효능을 가지게 되어, 고암모니아혈증 및 이로 인한 신경계 질환의 예방 또는 치료제로 널리 이용될 수 있다.

Description

혈중 암모니아 수치 저하능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 신경세포 보호용 조성물{Microorganism for Lowering Blood Ammonia Level and Composition for Protecting Neuronal Cells Containing the same}
본 발명은 혈중 암모니아 수치 저하능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 체내에서 암모니아 제거 효능을 가지고 있어 혈중 암모니아 수치를 저하시킴으로써 신경세포 보호기능을 갖는 단일균주 또는 이와 상리공생 관계인 균주 조합(Symbiotic Pair) 및 이를 포함하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다.
우리 인체에서는 음식물로 섭취한 단백질의 대사가 끊임없이 일어나며, 단백질의 분해과정에서 암모니아가 생성된다. 암모니아는 매우 강력한 신경독성 물질이기 때문에, 간의 요소 회로 (urea cycle)를 통해 요소로 바뀐 후 소변으로 배출된다. 하지만 간 기능에 이상이 있어 체내 암모니아 수치가 비정상적으로 높아지면, 강한 신경독성 암모니아는 치매, 파킨슨병 등과 같은 퇴행성신경계 질환이나 뇌졸중, 혼수, 바로 의식이 없어져 사망에 이르게 되는 뇌증 (encephalopathy) 등과 같은 다양한 신경계 질환의 원인물질로 작용하게 된다.
현재까지 체내 암모니아를 제거하려는 다양한 방법들이 개발되어 왔다. 혈액 암모니아 제거를 위한 방법으로 혈액 투석, 혈장 제거, 장세척 등이 실시되고 있으나, 이들은 체내 암모니아 수치가 매우 높은 위급상황에서 증상을 완화시키는 효과가 있을 뿐, 치료 효과가 미미한 실정이다. 또한, 락툴로스(Lactulose), 락티톨(Lactitol), 자일로바이오스(xylobiose) 등 비흡수성 당류, 네오마이신(Neomycin), 파로마이신(Paromycin), 리팍시민(Rifaximin) 등 비흡수성 항생제, 그리고 체내 암모니아 배출 촉진을 위한 아르기닌(Arginine), 소듐 벤조에이트(Sodium benzoate), 소듐 페닐아세테이트(Sodium phenylacetate) 등이 약물로 사용되고 있으나, 부작용 대비 효과가 미흡하다. 또한 유전자 변형 미생물 균주를 이용하여 고암모니아혈증을 완화시키려는 기술들도 개발되었으나(WO/2016/090343, WO/2016/200614. US9487764, US9688967), 이들은 모두 실제 장내에 정착하지 못하여, 체내에서 암모니아 수치를 저하시키지 못하였기에, 체내 암모니아를 효율적으로 제거하는 기술 개발이 요구되고 있다.
사람의 장에서는 영양분이 장 내강(內腔)에서 모세혈관과 림프관으로 이동하여 흡수된다. 영양분과 달리, 대사산물의 경우는 장 내강에서 장 모세혈관/림프관 또는 장 모세혈관/림프관에서 장 내강으로, 즉 양방향으로 이동한다. 양 쪽으로 이동 가능한 대사산물 중 특히 체외배출이 중요한 대사산물이 암모니아이다. 장은 암모니아 수송에서 매우 중요한 기관으로, 암모니아는 장 내강에서 수동 확산(passive diffusion)과 RhBG 같은 특정 운반자를 통해 장 모세혈관/림프관으로 흡수된다. 그러다가 장 내강에서 암모니아 수치가 낮아지면, 화학적 평형을 유지하기 위해 암모니아가 장 모세혈관/림프관에서 장 내강으로 이동하게 된다.
암모니아는 아미노산 대사과정의 부산물로 체내에서 필연적으로 생성되는 신경 독성물질로, 혈중 암모니아 수치가 높아지면 각종 신경계 질환이 발병되지만, 혈중 암모니아를 효율적으로 낮출 수 있는 치료법은 아직 개발되지 않았다.
기존에 비흡수성 당류, 비흡수성 항생제, 그리고 체내 암모니아 배출 촉진물질들이 약물로 사용되고 있으나, 이들은 부작용 대비 효과가 미흡하다. 유전자 조작된 미생물을 이용하여 혈중 암모니아 수치를 낮추는 치료제로 개발하는 시도들은 모두 성공하지 못했는데, ① 투여된 단일 종의 미생물로는 그 미생물 주변 암모니아를 제거하는 기능이 제한적이고 또한 ② 단일 종의 미생물이 장내에서 효율적으로 정착 및 성장하지 못하는 문제가 있었다.
이에 본 연구자들은 상기 문제를 해결하기 위하여 노력한 결과,'암모니아를 효과적으로 제거하는 장내 미생물 균주들 중에서 서로 성장을 촉진시켜주는 상리공생 (相利共生, Symbiotic) 관계에 있는 균주들을 섞어서 만든 상리공생 조합(symbiotic pair)'은 상호간에 성장을 촉진시키는 긍정적 상호작용으로 인해, 장내에 매우 효율적으로 정착되고 증식하면서 암모니아를 효과적으로 제거하므로, 결국 혈중 암모니아 수치를 획기적으로 낮출 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 암모니아를 효과적으로 제거하는 균주들을 이용하여 포유동물의 혈중 암모니아 수치를 감소시킴으로써 신경세포 보호능을 가지는 단일균주 또는 이와 상리공생 관계인 균주 조합을 포함하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈중 암모니아 수치를 감소시킴으로써 신경세포 보호능을 가지는 단일균주 또는 이와 상리공생 관계인 균주 조합 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하여, 고암모니아혈증 및 이로 인한 신경계 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포유동물의 혈중 암모니아 수치를 감소시킴으로써 신경세포 보호능을 갖는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 균주로서, 상기 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) JBD301(KCTC 12606BP), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) JBD400(KACC 81122BP), 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus) JBD401(KACC 81052BP), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) JBD402(KACC 81121BP), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) JBD406(KACC 81123BP), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JBD410(KCTC 11515BP) 및 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis) JBD411(KACC 81053BP) 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 포유동물의 혈중 암모니아 수치를 감소시킴으로써 신경세포 보호능을 갖는 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 균주로서, 상기 균주는 스트렙토코커스 루브네리(S. lubneri) JBD420(KACC 81124BP), 스트렙토코커스 루테티엔시스(S. lutetiensis) JBD421(KACC 81054BP), 스트렙토코커스 아우스트랄리스(S. australis) JBD422(KACC 81055BP), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) JBD423(KACC 81056BP), 스트렙토코커스 베스티부라리스(S. vestibularis) JBD424(KACC 81057BP), 스트렙토코커스 생구이니스(S. sanguinis) JBD425(KACC 81058BP), 스트렙토코커스 파라생구이니스(S. parasanguinis) JBD426(KACC 81059BP) 및 스트렙토코커스 갈리나세우스(S. gallinaceus) JBD427(KACC 81060BP) 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 혈중 암모니아 수치 저하능을 갖는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 균주, 혈중 암모니아 수치 저하능을 갖는 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 균주 및 상기 균주들의 배양물로 구성된 군에서 선택되는 1 이상을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 신경세포 보호용 조성물은 고암모니아혈증 및 이로 인한 신경계 질환의 예방 또는 치료능을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 균주 및 조성물은 신경 독성물질인 암모니아 제거능이 우수하므로 신경세포 보호 효능을 가지게 되어, 고암모니아혈증 및 이로 인한 신경계 질환의 예방 또는 치료제로 널리 이용될 수 있다.
도 1 및 2는 본 발명의 실험예 1에 따라 방사성 동위원소로 표지된 암모니아를 쥐의 혈액내 주사한 후, 각 시간별로 쥐의 혈액, 위, 소장, 대장, 소변, 대변의 암모니아(14NH4와 15NH4) 수치를 LC-MS/MS로 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라 스크리닝하여 발굴된 균주 또는 상리공생 조합 균주들을 섭취한 동물에서 고암모니아혈증을 유도한 후 혈중 암모니아의 농도를 측정한 결과이다 (1: 대조군, 2:JBD301, 3:JBD301+JBD421, 4:JBD301+JBD422, 5:JBD401, 6:JBD401+JBD421, 7:JBD401+JBD424, 8:JBD410, 9:JBD410+JBD421, 10:JBD410+JBD424, 11:JBD411, 12:JBD411+JBD421, 13: JBD411+JBD424).
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따라 스크리닝하여 발굴된 균주 또는 상리공생 조합 균주들을 섭취한 동물에서 고암모니아혈증을 유도한 후 뇌조직 내 암모니아의 농도를 측정한 결과이다 (1: 대조군, 2:JBD301, 3:JBD301+JBD421, 4:JBD301+JBD422, 5:JBD401, 6:JBD401+JBD421, 7:JBD401+JBD424, 8:JBD410, 9:JBD410+JBD421, 10:JBD410+JBD424, 11:JBD411, 12:JBD411+JBD421, 13:JBD411+JBD424).
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따라 스크리닝하여 발굴된 균주 또는 상리공생 조합 균주들을 섭취한 동물에서 고암모니아혈증을 유도한 후 혈액(A)과 뇌조직(B) 암모니아의 농도를 측정한 결과이다 (a:대조군, b:JBD400, c:JBD400+JBD420, d:JBD402, e:JBD402+JBD421, f:JBD406, g:JBD406+JBD420).
도 6의 A는 본 발명에 따른 [JBD411+JBD421] 섭취군과 [JBD301+JBD422] 섭취군 동물에서 고암모니아혈증을 유도한 후 뇌조직 내에서 caspase-9/DAPI 염색비율을 측정하여 신경세포 사멸정도를 측정한 결과이며, B는 [JBD411+JBD421] 섭취군과 [JBD301+JBD422] 섭취군 동물에서 고암모니아혈증을 유도한 후 뇌조직 내에서 caspase 9/DAPI 염색하여 신경세포 사멸정도를 나타내는 대표 이미지이다 (a: 무처리 대조군, b:고암모니아혈증, c:고암모니아혈증+[JBD411+JBD421], d:고암모니아혈증+[JBD301+JBD422]).
신경 독성물질인 암모니아의 체내 축적으로 신경계 질환 발병 시, 물리적인 혈액 투석 방법이나 암모니아 흡수저해 약물들이 사용되고 있으나 효과적인 치료가 어려운 실정이다. 또한 이들 치료법은 신경 독성물질인 체내 암모니아를 발병 이전에 감소 또는 조절하는 예방이 불가능하다는 문제가 있다.
본 발명에서는 기존 암모니아 제거 기술들의 한계를 인지하고, 암모니아를 제거하는 기능이 우수한 장내 미생물을 이용하여 체내 암모니아를 감소시키면, 신경계 질환을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예측하였다. 신경 독성물질인 암모니아는 질소 화합물의 체내 대사 과정의 부산물로, 장 내강에서 장 모세혈관/림프관으로 흡수된 후 간에서 요소로 바뀌어 소변으로 배출되게 된다. 영양분과는 달리, 암모니아는 장 내강에서 장 모세혈관/림프관 또는 장 모세혈관/림프관에서 장 내강으로, 즉 양방향으로 이동이 가능하다.
따라서, 본 발명에서는 장 내강의 암모니아를 제거하면 체내 암모니아가 화학적 평형을 유지하기 위해 장 내강으로 이동하게 되므로, 체내 암모니아 수치가 감소하게 된다는 사실에 착안하여 암모니아를 제거하는 장내 미생물의 섭취시 체내 암모니아를 감소시켜 신경계 질환의 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 확인하고자 하였다.
또한 본 발명에서는 암모니아 제거능이 우수한 균주들이면서 상호 성장촉진 효과를 가지는 상리공생 균주(Symbiotic partner) 조합을 사용할 경우 암모니아 제거능이 증대된다는 것을 확인하고자 하였다. 미생물은 단세포 생명체라는 특징 때문에 유전자가 다세포 생명체에 비해 매우 작다. 실제로 각 세균의 평균 유전체 크기는 포유동물에 비해 1/1,000에 불과하다. 미생물은 자신의 유전체로만으로는 주변 환경에 민첩하게 적응하여 번식하는데 한계가 있어 대다수 미생물들은 서로 공생하면서 생활하는 것을 선호한다. 본 가설에 근거하여 본 발명자들은 먼저 인체 유래 장내 미생물들을 초고속 방법으로 검색하여 암모니아 제거능이 우수한 후보 균주들을 발굴한 후, 이 후보 균주들의 상리공생 균주(Symbiotic partner)를 발굴하여 상리공생 조합(Symbiotic pair)에 기초하여 각 미생물들을 급이한 결과, 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 암모니아 제거 균주와 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 암모니아 제거 균주의 특정한 상리공생 조합(Symbiotic pair)이 현저히 우수한 암모니아 제거능을 가질 수 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명에서는 (1) in vitro 스크리닝 방법으로 암모니아 제거능이 우수한 균주들 및 이들과 상호 성장촉진 효과를 가지는 상리공생 균주(Symbiotic partner)들을 발굴하였으며, (2) 암모니아 제거능이 우수한 상리공생 조합(Symbiotic pair)을 사용할 경우 숙주의 체내 암모니아 농도를 획기적으로 감소시키고, (3) 암모니아 제거 균주들의 상리공생 조합(Symbiotic pair)이 혈중 암모니아를 낮춤으로써 숙주의 신경세포를 보호하여 고암모니아혈증 및 이로 인한 신경계 질환의 예방 및 치료효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 포유동물의 체내에서 암모니아를 감소시킴으로써 신경세포 보호능을 갖는 균주에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 신경세포 보호능을 갖는 균주는 포유동물의 장관계(gastrointestinal tract) 유래 미생물로, 체내 암모니아 농도를 감소시켜 신경세포 보호능을 갖는 장내 미생물이라면 특별한 제한없이 모두 포함할 수 있으며, 특히 상리공생 조합(Symbiotic pair)으로 우수한 효과를 가지는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 및 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.)을 예시할 수 있다.
상기 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.)은 락토바실러스 코리니포미스(L. coryniformis), 락토바실러스 액시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 아밀로보러스(L. amylovorus), 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 람노수스(L. rhamnosus) 등을 예시할 수 있고, 상기 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.)은 스트렙토코커스 루브네리(S. lubneri), 스트렙토코커스 루테티엔시스(S. lutetiensis), 스트렙토코커스 아우스트랄리스(S. australis), 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans), 스트렙토코커스 베스티부라리스(S. vestibularis), 스트렙토코커스 생구이니스(S. sanguinis), 스트렙토코커스 파라생구이니스(S. parasanguinis), 스트렙토코커스 갈리나세우스(S. gallinaceus) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
더욱 상세하게 상기 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) JBD301(KCTC 12606BP), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) JBD400(KACC 81122BP), 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus) JBD401(KACC 81052BP), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) JBD402(KACC 81121BP), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) JBD406(KACC 81123BP), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JBD410(KCTC 11515BP) 및 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis) JBD411(KACC 81053BP) 균주로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 균주는 스트렙토코커스 루브네리(S. lubneri) JBD420(KACC 81124BP), 스트렙토코커스 루테티엔시스(S. lutetiensis) JBD421(KACC 81054BP), 스트렙토코커스 아우스트랄리스(S. australis) JBD422(KACC 81055BP), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) JBD423(KACC 81056BP), 스트렙토코커스 베스티부라리스(S. vestibularis) JBD424(KACC 81057BP), 스트렙토코커스 생구이니스(S. sanguinis) JBD425(KACC 81058BP), 스트렙토코커스 파라생구이니스(S. parasanguinis) JBD426(KACC 81059BP) 및 스트렙토코커스 갈리나세우스(S. gallinaceus) JBD427(KACC 81060BP) 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 신경세포 보호능을 갖는 균주는 파마바이오틱스 균주로써, 기존 신경세포 보호 조성물과 비교시 다음과 같은 4가지 장점이 있다.
첫째, 천연 장내 미생물 조성으로 화학물질 기반의 치료제들의 부작용 문제가 전무하고 안전성이 탁월하면서도 효과적이다. 둘째, 장내 미생물은 체내로 흡수되지 않고 장 내강(內腔)에 머무르면서 군락을 형성하여 작용하기 때문에, 체내 흡수 및 대사되는 기존 의약품들과 달리, 장기간 복용시에도 부작용 우려가 전혀 없어 안전성이 탁월하다. 셋째, 혈액 투석이나 장세척과 달리 치료가 용이하면서도 효과적이다. 넷째, 체내에서 끊임없이 생성되는 신경 독성물질인 암모니아를 안전하게 제거할 수 있어, 신경세포를 보호하여 신경계 질환 및 신경계 관련 질환을 예방할 수 있다.
상기 신경계 질환 및 신경계 관련 질환으로는 고암모니아혈증, 뇌독성, 신경독성, 신경손상, 호흡성 알카리혈증, 혼수상태, 구토, 발작, 간질환, 뇌발달장애, 정신지체, 발육부진, 뇌증(encephalopathy) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 혈중 암모니아 수치 저하능을 갖는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 균주, 혈중 암모니아 수치 저하능을 갖는 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 균주 및 상기 균주들의 배양물로 구성된 군에서 선택되는 1 이상을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다.
상기 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 균주 및 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 균주는 상호 성장촉진 효과를 가지는 상리공생 균주 조합(Symbiotic pair)인 것이 바람직하다.
상기 신경세포 보호용 조성물은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) JBD301(KCTC 12606BP), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) JBD400(KACC 81122BP), 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus) JBD401(KACC 81052BP), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) JBD402(KACC 81121BP), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) JBD406(KACC 81123BP), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JBD410(KCTC 11515BP) 및 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis) JBD411(KACC 81053BP) 균주로 구성된 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 균주 및 스트렙토코커스 루브네리(S. lubneri) JBD420(KACC 81124BP), 스트렙토코커스 루테티엔시스(S. lutetiensis) JBD421(KACC 81054BP), 스트렙토코커스 아우스트랄리스(S. australis) JBD422(KACC 81055BP), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) JBD423(KACC 81056BP), 스트렙토코커스 베스티부라리스(S. vestibularis) JBD424(KACC 81057BP), 스트렙토코커스 생구이니스(S. sanguinis) JBD425(KACC 81058BP), 스트렙토코커스 파라생구이니스(S. parasanguinis) JBD426(KACC 81059BP) 및 스트렙토코커스 갈리나세우스(S. gallinaceus) JBD427(KACC 81060BP) 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 균주를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 신경세포 보호용 조성물은 약학 조성물 또는 기능성 식품으로 이용될 수 있다.
상기 약학 조성물 또는 기능성 식품에 함유된 균주 또는 상기 균주의 배양물은 체내 암모니아 농도 즉 혈중 암모니아 농도를 최대 90% 이상 낮출 수 있으며, 상기 체내는 혈액, 위, 소장, 대장, 두뇌 등을 예시 할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물 또는 기능성 식품은 특별히 제한되지 않으나 103~1012 cfu/g의 균주를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 체내 암모니아 농도를 감소시켜 신경세포 보호능을 갖는 균주 또는 상기 균주의 배양물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서,“기능성 식품”은 식품 본래 목적 외에 특정한 기능성이 부가된 식품으로, 건강식품, 건강기능성식품, 식이보조제 등을 모두 포함한다. 본 발명의 기능성 식품이 목적하는 기능성은 신경세포 보호기능이다.
상기 기능성 식품은 유제품 (우유, 두유, 가공우유), 발효유 (액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 음료 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상기 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 기능성 식품 중, 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물 또는 기능성 식품은 암모니아 제거능이 있는 균주를 함유하고 있으므로, 이를 섭취시 숙주에서의 체내 암모니아를 줄여줄 수 있으므로, 신경세포보호 기능성을 가지며 신경계 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명의 기술사상은 포유동물이 섭취시 숙주 체내의 암모니아 농도를 감소시켜, 신경세포보호 기능을 가지는 균주라면 모두 적용될 수 있는 것으로, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
[실험 및 실시 예]
이하 구체적인 실험예를 통해 이 발명이 기본 원리 및 계념을 설명하고, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실험 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실험 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 혈중 암모니아가 장 내강을 거쳐 체외로 배출됨으로써 혈중 암모니아가 감소하는지 여부를 확인하는 실험
소화된 영양분은 장 내강에서 모세혈관과 림프관을 통해 사람의 장으로 흡수되지만, 사람의 대사산물들은 장 내강에서 장 모세혈관/림프관 또는 장 모세혈관/림프관에서 장 내강으로, 즉 양방향으로 이동하기도 한다. 특히 체내 대사과정 부산물로 생성되는 암모니아는 친수성과 소수성 둘 다의 특성을 가지고 있어, 장 내강과 장 모세혈관/림프관 사이를 수동 확산(passive diffusion)으로 서로 이동할 수 있을 것이라 본 발명자들은 추정하였다. 즉, 장 내강에서 암모니아 수치를 낮추면, 화학적 평형을 유지하기 위해 체내 혈중 암모니아는 장 모세혈관/림프관에서 장 내강 쪽으로 암모니아가 이동하고, 이는 궁극적으로 혈중 암모니아 수치를 감소시키는 결과로 이어지게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 방사성 동위원소로 표지된 암모니아를 혈액내 주사하여 이 암모니아가 실제로 장내로 이동하여 체외로 배출되는지 동물실험으로 확인하였다. 먼저 0.9% 생리식염수에 10mg/mL 농도로 녹인 15NH4Cl를 250 mg/kg of body weight 용량으로 마우스 꼬리에 각각 정맥 주사하였다. 일정 시간 후 쥐 혈액, 위, 소장, 대장, 소변, 대변을 회수하여 각 샘플에 존재하는 암모니아(14NH4와 15NH4)를 LC-MS/MS로 측정하였다(도 1 및 2).
위 실험은 마우스 체내에 정맥 주사된 혈중 암모니아 15NH4는 소화기관으로 이동한 후 대변과 소변으로 체외 배출되는 것을 보여준다. 즉, 이 실험결과는 소화기관인 장 내강 암모니아를 제거하면, 혈중 암모니아가 장 내강으로 이동하게 되므로, 혈중 암모니아 수치를 떨어트릴 수 있다는 것을 입증하고 있다.
실험예 2: Lactobacillus 유산균과 상리공생 관계에 있는 장내미생물 발굴
Lactobacillus는 사람이 섭취하는 대표적인 유산균으로, 사람의 건강에 이로운 다양한 기능이 있다. 그 중 하나가 암모니아를 제거하는 기능이다. 하지만 일반 Lactobacillus 균주들의 경우 혈중 암모니아를 떨어트리는 기능은 매우 제한적이어서, 실제로 Lactobacillus를 혈중 암모니아 제거 목적으로는 사용하지 못하고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 암모니아 제거 기능이 우수한Lactobacillus를 발굴하고 이와 상리공생 관계에 있는 미생물을 발굴하여, 이 미생물들을 암모니아 제거 기능이 있는 Lactobacillus와 같이 조합한 상리공생 조합(symbiotic pair)으로 만들어서, 혈중 암모니아 수치와 두뇌 암모니아 수치를 효과적으로 낮출 수 있는 가능성을 탐색해 보기로 하였다.
이에, 본 발명자들은 Gut Microbiota Bank (www.gutmicrobiotabank.com)에 구축되어 있는 다양한 종의 장내미생물들을 Lactobacillus 균주와 공동 배양하는 실험을 진행하였다. 본 발명자들은 먼저 L. acidophilus를 MRS media에서 37 ℃/무산소 조건에서 24시간 배양한 후, 0.1 OD600 신선한 MRS 배지로 희석하였다. 희석된 L. acidophilus를 96 well plate의 각 well에 150μL씩 분주한 후, 이 well에 다양한 종류의 장내미생물들을 24 시간 배양액 10μL 씩 첨가하였다. 이 혼합미생물 배양액을 37 ℃/혐기조건에서 2시간 배양 후, OD600을 측정하여 각 장내미생물이 L. acidophilus의 성장에 어떠한 영향을 미치는지를 측정하였다. 본 발명자들은 장내미생물 307종(Species)을 L. acidophilus와 공동 배양하면서 성장률을 측정하였고, 표 1은 단지 그 실험의 일부만을 나타낸 것이다. 이 실험 결과 값은, Streptomyces 속에 속하는 미생물들은 L. acidophilus와 상리공생 관계에 있다는 것을 잘 나타내고 있다. 표 1에서 기술한 실험을 Lactobacillus 속 다양한 species 즉 L. amylovorus, L. casei, L. paracasei, L. fermentum, L. plantarum, L. reuteri, L. crispatus, L. gallinarum, L. ultunensis, L. intestinalis, L. kalixensis, L. jensenii, L. delbruecki, L. bulgaricus, L. iners, L. johnsonii, L. gasseri, L. gastricus, L. vaginalis, L. oris, L. antri, L. amylophilus, L. bifermentans, L. dextrinicus, L. farciminis, L. alimentarius, L. collinoides, L. brevis, L. parabuchneri, L. kefiri, L. buchneri, L. lindneri, L. fructivorans, L. sakei, L. graminis, L. coryniformis, Pediococcus acidilactici, L. pantheri, L. rhamnosus, L. zeae, L. casei, L. mali, L. saerimneri, L. salivarius, L. agilis, L. ruminis 등과 같이 배양한 후 성장률을 측정한 결과, 표 1에서와 같이 상위 값들이 모두 Streptococcus species에 속하였다 (* 표시). 이 결과는 Lactobacillus 와 Streptococcus의 상리공생 관계(Symbiotic relationship)을 보여주는 것이다.
L. acidophilus JBD410과 공동 배양된 장내미생물 OD600 측정값
Collinsella stercoris 0.46 ± 0.06
Enorma massiliensis 0.38 ± 0.07
Actinomyces israelii 0.35 ± 0.12
Mobiluncus mulieris 0.38 ± 0.09
Bifidobacterium scardovii 0.33 ± 0.05
Bifidobacterium longum 0.37 ± 0.02
Staphylococcus capitis 0.38 ± 0.05
Staphylococcus cohnii 0.42 ± 0.04
Bacillus cereus,Bacillus 0.44 ± 0.07
Clostridium clostridioforme 0.34 ± 0.05
* Streptococcus downei 0.71 ± 0.09*
* Streptococcus constellatus 0.45 ± 0.11*
* Streptococcus sangunis 0.51 ± 0.10*
* Streptococcus ratti 0.63 ± 0.13*
* Streptococcus thermophilus 0.87 ± 0.15*
* Streptococcus sanguis 0.64 ± 0.11*
* Streptococcus sobrinus 0.56 ± 0.12*
Clostiridium oroticum 0.37 ± 0.09
Coprobacillus catenaformis 0.39 ± 0.04
Anaerococcus vaginalis 0.35 ± 0.06
Anaerococcus tetradius 0.42 ± 0.08
Alistipes finegoldii 0.37 ± 0.05
Porphyromonas somerae 0.38 ± 0.08
Prevotella nigrescens 0.39 ± 0.02
Ewingella americana 0.34 ± 0.03
Aeromonas enteropelogenes 0.41 ± 0.05
Campylobacter rectus 0.39 ± 0.04
실험예 3: 암모니아 제거능이 우수한 Lactobacillus 및 Streptococcus 균주 스크리닝 우수한 신경세포 보호능을 갖는 상리공생 조합(Symbiotic pair)을 찾기 위한 스크리닝 실험은 다음과 같이 수행되었다. (주) 지니스 기업부설연구소와 부설 Gut Microbiota Bank (www.gutmicrobiotabank.com)에 보관된 인간 장내 미생물 균주 라이브러리(library) 중 Lactobacillus 및 Streptococcus 대상으로 in vitro 암모니아 제거능을 스크리닝하였다. 이를 위해 MRS broth 250 ㎕을 96-well plate에 넣은 후 시험 균주를 접종하고 혐기배양하여 얻어진 fresh culture를 MRS agar에 접종한 후 37℃로 혐기배양하였다. 48시간 배양한 후 MRS agar에서 자라난 콜로니(colony)들을 MRS broth에 접종한 후 37℃에서 혐기 배양하였다. OD600 값이 0.45~1인 배양액 500㎕을 에펜도르프 튜브에 옮긴 후 ammonium hydroxide (30 ㎍/mL) 10 ㎕를 첨가하고 37℃에서 30분간 혐기배양한 후 7,000 rpm으로 5분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 얻어냈다. 상층액 속의 암모니아 양은 Ammonia Assay Kit AA0100(Sigma-Aldrich)를 이용하여 흡광도를 측정한 후 이를 암모니아 농도로 계산하였다. 그 결과, 락토바실러스 및 스트렙토코커스 균주들 중, S. lubneri JBD420, S. lutetiensis JBD421, S. australis JBD422, S. mutans JBD423, S. vestibularis JBD424, S. sanguinis JBD425, S. parasanguinis JBD426, S. gallinaceus JBD427과 L. reuteri JBD301, L. reuteri JBD400, L. amylovorus JBD401, L. plantarum JBD402, L rhamnosus JBD406, L. acidophilus JBD410, L. coryniformis JBD411를 우수한 암모니아 제거 균주들로 발굴하였다.
실시예 1: 상리공생 관계를 이용하여 암모니아 제거능이 증폭된 '암모니아 저하제 미생물 신약' 개발
상기 실험예 2~3에서 암모니아 제거능 스크리닝을 통해 선별된 암모니아 제거 균주들을 대상으로 in vitro 단일 균주 또는 상리공생 조합으로 암모니아 제거능 실험을 수행하였다. 이를 위해 MRS agar에서 자라난 Streptococcus 후보 균주들과 Lactobacillus 후보 균주들을 MRS broth에 접종한 후 37℃에서 co-culture 혐기 배양하였다. OD600 값이 0.45~1 사이까지 배양된 후 Streptococcus 군 균주의 배양액 250㎕과 Lactobacillus 군 균주의 배양액 250㎕에 ammonium hydroxide (30 ㎍/mL) 10 ㎕를 첨가하고 37℃에서 30분간 혐기배양한 후 7,000 rpm으로 5분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 얻어냈다. 암모니아 양은 Ammonia Assay Kit를 이용하여 흡광도를 측정하고, 이를 암모니아 농도로 계산하였다. ammonium hydroxide만 첨가되고 무접종 배지를 대조군으로 하여 각 시험군의 암모니아 농도를 대조군의 %로 계산하고, 그 결과를 표 2~5에 나타내었다.
　 ammonia conc. (mM) % of control
control MRS 103.6 100
JBD411 28.6 27.61
JBD421 29.7 28.67
JBD411+JBD421* 3.3 3.19
JBD422 36.4 35.14
JBD411+JBD422 9.5 9.17
JBD423 22.3 21.53
JBD411+JBD423 92.6 89.38
JBD424 84.1 81.18
JBD411+JBD424 28.1 27.12
JBD425 87.7 84.65
JBD411+JBD425 84.1 81.18
JBD426 31.9 30.79
JBD411+JBD426 9.4 9.07
JBD427 37.1 35.81
JBD411+JBD427 49.1 47.39
표 2에서 L. coryniformis JBD411 균주의 경우, 단일 균주로 급이시 대조군의 27%까지 암모니아를 감소시켰으나, 상리공생 조합인 [JBD411+JBD421], [JBD411+JBD422], [JBD411+JBD426]에서는 대조군의 3.19%, 9.17%, 9.07% 수준까지 현저히 감소되어, 매우 우수한 암모니아 제거능을 보였다(*표시).
　 ammonia conc. (mM) % of control
control MRS 103.6 100.0
JBD410 33.2 32.0
JBD421 29.7 28.7
JBD410+JBD421 20 19.3
JBD422 36.4 35.1
JBD410+JBD422 13.3 12.8
JBD423 22.3 21.5
JBD410+JBD423 44.2 42.7
JBD424 84.1 81.2
JBD410+JBD424 17.9 17.3
JBD425 87.7 84.7
JBD410+JBD425 32.4 31.3
JBD426 31.9 30.8
JBD410+JBD426 15.8 15.3
JBD427 37.1 35.8
JBD410+JBD427* 12.5 12.1
표 3에서 L. acidophilus JBD410 균주의 경우, 단일 균주로 급이시 대조군의 32%까지 암모니아를 감소시켰으나, 상리공생 조합인 [JBD410+JBD422], [JBD410+JBD427]에서는 대조군의 12.8%과 12.1%까지 현저히 감소되어 매우 우수한 암모니아 제거능을 보였다(*표시).
　 ammonia conc. (mM) % of control
control MRS 103.6 100
JBD401 39.4 38.03
JBD421 29.7 28.67
JBD401+JBD421* 8.5 8.20
JBD422 36.4 35.14
JBD401+JBD422 14.7 14.19
JBD423 22.3 21.53
JBD401+JBD423 50.4 48.65
JBD424 84.1 81.18
JBD401+JBD424 9.8 9.46
JBD425 87.7 84.65
JBD401+JBD425 72.3 69.79
JBD426 31.9 30.79
JBD401+JBD426 28.9 27.9
JBD427 37.1 35.81
JBD401+JBD427 34.2 33.01
표 4에서 L. amylovorus JBD401 균주의 경우, 단일 균주로 급이시는 대조군의 38%까지 암모니아를 감소시켰으나, 상리공생 조합인 [JBD401+JBD421], [JBD401+JBD422], [JBD401+JBD424]에서는 각각 대조군의 8.2%, 14.19%, 9.46%까지 현저히 감소되어 매우 우수한 암모니아 제거능을 보였다(*표시).
　 ammonia conc. (mM) % of control
control MRS 103.6 100
JBD301 27.2 26.25
JBD421 29.7 28.67
JBD301+JBD421 17.4 16.80
JBD422 36.4 35.14
JBD301+JBD422* 8.5 8.25
JBD423 22.3 21.53
JBD301+JBD423 20.1 19.45
JBD424 84.1 81.18
JBD301+JBD424 42.0 40.54
JBD425 87.7 84.65
JBD301+JBD425 37.9 36.58
JBD426 31.9 30.79
JBD301+JBD426 27.3 26.35
JBD427 37.1 35.81
JBD301+JBD427 22.8 22.01
표 5에서 L. reuteri JBD301 균주의 경우, 단일 균주로 급이시 대조군의 26%까지 암모니아를 감소시켰으나, 상리공생 조합인 [JBD301+JBD421], [JBD301+JBD422], [JBD301+JBD423]에서는 각각 대조군의 16.8%, 8.25%와 19.45%까지 감소되어, 매우 우수한 암모니아 제거능을 보였다(*표시). 또한 (주)지니스 기업부설연구소 및 Gut Microbiota Bank에서 추가적으로 스크리닝을 계속한 결과, 기발굴된 JBD 균주들만큼 우수한 암모니아 제거능을 가지는 락토바실러스 및 상리공생 조합으로 암모니아 제거능이 향상되는 스트렙토코커 스 후보균주들이 추가로 발굴되었다. 이에 추가로 발굴된 균주들 역시 상기 실험예와 같은 방법으로 암모니아 제거능 실험을 수행한 결과는 다음과 같다.
Classification Ammonia
(% of control)		 NH4 reduction
control MRS 100 -
L. reuteri JBD400 35.4 ++
[L. reuteri JBD400 + S. rubneri JBD420] * 11.6 +++++
L. plantarum JBD402 37.8 ++
[L. plantarum JBD402 + S. lutetiensis JBD421] 26.7 +++
L. rhamnosus JBD406 40.5 ++
[L. rhamnosus JBD406 + S. rubneri JBD420] 18.0 +++++
표 6에서 L. reuteri JBD400, L. plantarum JBD402, L. rhamnosus JBD406 균주의 경우, 단일 균주로 급이시 각각 대조군의 35%, 37%, 40%까지 암모니아를 감소시켰으나, 상리공생 조합인 [JBD400+JBD420], [JBD402+JBD421], [JBD406+JBD420]에서 각각 대조군의 11.6%, 26.7%와 18.0% 수준까지 감소되어 매우 우수한 암모니아 제거능을 보였다(*표시). 실시예 2: 암모니아 제거능을 갖는 균주의 동정 및 기탁
실시예 1에서 암모니아 제거능이 우수한 것으로 확인된 Lactobacillus 균주들에 대해 정밀한 16S rRNA 유전자 분석을 수행하였다. 이를 위해 MRS 배지에서 혐기 배양한 균주 배양액에서 DNA를 추출한 후, 16s rDNA 증폭을 위하여 PCR에서 95℃ 5분 동안 denaturation시킨 다음, 95℃ 30초, 52℃ 45초, 72℃ 2분 조건으로 30회 증폭시킨 후 72℃에서 10분 처리한 후, 시퀀싱하여 확인하였다. PCR 프라이머로는 universal primers(서열번호 1 및 2)를 사용하였다.
[서열번호 1] 27 F: 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3'
[서열번호 2] 1492 R: 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T- 3'
시퀀싱으로 확인된 균주들의 16s rDNA sequence로 NCBI GenBank, DNA data bank of Japan, European Nucleotide Archive를 검색한 결과, 락토바실러스 아밀로보러스(L. amylovorus) JBD401 균주(KACC 81052BP)와 락토바실러스 코리니포미스(L. coryniformis) JBD411균주(KACC 81053BP)는 신규한 종으로 확인되어, 2017년 8월 25일자로 국립농업과학원 생물자원센터에 기탁하였다.
또한, 실시예 1에서 암모니아 제거능이 우수한 것으로 확인된 Streptococcus 균주들에 대해서도 정밀한 16S rRNA 유전자 분석을 위와 같은 방법으로 수행하였다. 시퀀싱으로 확인된 균주들의 16s rDNA sequence로 NCBI GenBank, DNA data bank of Japan, European Nucleotide Archive를 검색한 결과, 스트렙토코커스 루테티엔시스(S. lutetiensis) JBD421 균주(KACC 81054BP), 스트렙토코커스 아우스트랄리스(S. australis) JBD422 균주(KACC 81055BP), 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans) JBD423 균주(KACC 81056BP), 스트렙토코커스 베스티부라리스(S. vestibularis) JBD424 균주(KACC 81057BP), 스트렙토코커스 생구이니스(S. sanguinis) JBD425 균주(KACC 81058BP), 스트렙토코커스 파라생구이니스(S. parasanguinis) JBD426 균주(KACC 81059BP), 스트렙토코커스 갈리나세우스(S. gallinaceus) JBD427 균주(KACC 81060BP)는 신규한 종으로 확인되어, 2017년 11월 30일자로 국립농업과학원 생물자원센터(KACC)에 기탁하였다.
또한 추가로 발굴된 락토바실러스 루테리(L. reuteri) JBD400(KACC 81122BP), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) JBD402(KACC 81121BP), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) JBD406(KACC 81123BP), 스트렙토코커스 루브네리(S. lubneri) JBD420(KACC 81124BP) 역시 신종임을 확인하고 2020년 7월 7일자로 국립농업과학원 생물자원센터(KACC)에 기탁하였다.
실시예 3: 암모니아 제거능을 갖는 균주의 동물실험을 통한 신경세포보호 보호능 평가
암모니아 제거능 스크리닝을 통해 얻어진 후보 균주들의 신경세포보호 효능을 평가하기 위해 동물실험을 수행하였다. 동물실험을 위한 균체 분말을 준비하기 위해 후보 균주들의 MRS 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 후 여기에 탈지분유와 설탕을 10%씩 첨가하여 동결건조시켜 준비하였다.
모든 동물실험은 동물관리 및 이용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정에 따라 수행하였다. 4주령의 ICR mice 수컷 열 마리씩 우리(cage)에 넣고 처음 1주일 동안 사료 (10% fat; D12450B; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA)와 물을 자유 급이하였다. 실험기간 동안 12시간 간격으로 밤낮 조명을 바꾸었으며 온도는 22℃, 습도는 55 ± 5%로 일정하게 유지하였다. 일주일 후 쥐들을 무작위로 분리하여 대조군 또는 실험군으로 나누었다. 대조군에는 일반 사료를 급이 하였고, 실험군은 암모니아 제거 균주들을 단일 분말 또는 상리공생 조합으로 하여 1×107 CFU/day로 7일간 추가 급이하였다. 마지막 날 쥐의 꼬리정맥에 15NH4Cl를 100 mg/kg 용량으로 주사하여 고암모니아혈증(Hyperammonemia)을 유도하였다. 1시간 후에 혈액을 회수하고 두뇌를 분리하였다. 혈액은 원심분리 후 상층액을 모아 암모니아 농도를 측정하고, 그 결과를 표 7 및 도 3에 나타내었다.
No　 Strain Ammonia in blood (㎍/ml) % of Control
1 Control 5.32±0.97 100.0
2 JBD301 2.69±1.06 50.6
3 JBD301+JBD421 0.88±0.64 16.5*
4 JBD301+JBD422 0.79±0.72 14.8*
5 JBD401 2.91±0.59 54.7
6 JBD401+JBD421 0.75±0.25 14.1*
7 JBD401+JBD424 0.43±0.24 8.1*
8 JBD410 2.49±0.34 46.8
9 JBD410+JBD421 1.27±0.32 23.9
10 JBD410+JBD424 1.19±0.42 22.4
11 JBD411 2.26±0.32 42.5
12 JBD411+JBD421 0.37±0.11 7.0*
13 JBD411+JBD424 0.84±0.46 15.8
표 7과 도 3에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 JBD301, 락토바실러스 JBD401, 락토바실러스 JBD410, 락토바실러스 JBD411 균주를 섭취시킨 쥐의 혈액 암모니아는 대조군의 42% ~ 50% 수준으로 감소하였다. 시험관 실험에서와 같이 in vivo 동물실험에서도 락토바실러스/스트렙토코커스 상리공생 조합(symbiotic pair)에서 혈액 내 암모니아 제거능이 훨씬 우수하였는데, [JBD301+JBD421], [JBD301+JBD422], [JBD411+JBD421], [JBD401+JBD424] 섭취군에서 혈액 내 암모니아가 대조군에 비해 80~90% 이상 감소하였음을 확인할 수 있었다.또한 뇌 조직 내 암모니아의 정량분석을 위해서, 분리된 뇌를 분쇄하여 원심분리 후 상층액을 모아 암모니아 농도를 측정하고, 그 결과를 표 8 및 도 4에 나타내었다.
No　 Strain Ammonia in brain (㎍/g) % of Control
1 Control 2.65±0.56 100.0
2 JBD301 1.35±0.33 50.9
3 JBD301+JBD421 0.64±0.46 24.2
4 JBD301+JBD422 0.26±0.47 9.8*
5 JBD401 1.00±0.46 37.7
6 JBD401+JBD421 0.42±0.23 15.8
7 JBD401+JBD424 0.38±0.24 14.3*
8 JBD410 1.74±0.63 65.7
9 JBD410+JBD421 0.43±0.19 18.1*
10 JBD410+JBD424 1.05±0.64 39.6
11 JBD411 1.55±0.20 58.5
12 JBD411+JBD421 0.22±0.18 8.3*
13 JBD411+JBD424 0.65±0.54 24.5
표 8 및 도 4에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 JBD301, 락토바실러스 JBD401, 락토바실러스 JBD410, 락토바실러스 JBD411 균주를 섭취시 뇌 조직 내 암모니아 농도가 대조군의 16% ~ 65% 수준으로 감소하였다. 뇌 조직 암모니아 제거능 역시 락토바실러스/스트렙토코커스 상리공생 조합(symbiotic pair)이 훨씬 우수하였는데, [JBD301+JBD422], [JBD401+JBD424], [JBD410+JBD421], [JBD411+JBD421] 섭취군에서 뇌조직 내 암모니아가 대조군에 비해 80~90% 이상 감소하였음을 확인할 수 있었다. 또한, 추가로 발굴된 락토바실러스 JBD400, 락토바실러스 JBD402, 락토바실러스 JBD406 및 이들 각각과 상리공생하는 스트렙토코커스 JBD420, 스트렙토코커스 JBD421 균주를 발굴한 후 이들에 대해서도 역시 상기 기술한 것과 같은 방법으로 in vivo 동물실험을 통한 신경세포보호 보호능 평가를 수행한 후 혈액과 뇌조직에서 암모니아 측정 결과를 도 5에 나타내었다. 마찬가지로, 락토바실러스 균주와 스트렙토코커스 균주 단일배양보다는 상리공생(Symbiotic pair)의 조합에서 우수한 암모니아 제거능을 나타냈다. 특히 가장 우수한 [JBD400+JBD420] 섭취군의 경우 대조군에 비해 혈액과 뇌조직 내 암모니아 80% 이상 감소했음을 확인할 수 있었다.
암모니아 제거 균주의 신경세포보호 보호능을 이미지 분석하기 위해서 cryotome (Thermo Scientific)으로 뇌 조직 단편을 준비하여 DAPI로 염색 후 caspase 키트 (FLICA™, Fluorescent-Labeled Inhibitor of Caspases)로 분석 및 fluorescence microscope (Nikon)로 관찰하고, 그 결과 일부를 표 9 및 도 6에 나타내었다.
No　 Strain Caspase 9-stain /DAPI stain
Mean % HA Control
1 Control 0.0371 5.06
2 HA 0.7325 100.00
3 HA + [JBD411+JBD421] 0.1196 16.32
4 HA + [JBD301+JBD422] 0.2158 29.46
표 9 및 도 6에 나타난 바와 같이, 정상 대조군(a)에 비해 고암모니아혈증 대조군(b)에서는 카스파제 9(caspase 9) 염색된 세포의 비율이 DAPI 염색된 정상세포에 비해 현저히 증가한 것으로 보아 암모니아 신경독성으로 인해 apoptosis가 일어났음을 알 수 있었다. 그러나 [JBD411+JBD421]을 섭취시킨 실험군(c)에서는 고암모니아혈증 대조군에 비해 카스파제 9(caspase 9) 염색된 세포의 비율이 80% 이상 감소하였고, [JBD301+JBD422]을 섭취시킨 실험군(d)에서는 고암모니아혈증 유도군에 비해 카스파제 9(caspase 9) 염색된 세포의 비율이 70% 이상 감소하였음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 균주들은 포유동물의 체내에서 암모니아를 감소시킬 수 있으므로 고암모니아혈증을 예방하거나 치료할 수 있고, 신경세포 보호능이 있으므로, 신경계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
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Claims (3)

  1. 스트렙토코커스 루테티엔시스(S. lutetiensis) JBD421(KACC 81054BP), 스트렙토코커스 아우스트랄리스(S. australis) JBD422(KACC 81055BP), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) JBD423(KACC 81056BP), 스트렙토코커스 파라생구이니스(S. parasanguinis) JBD426(KACC 81059BP) 및 스트렙토코커스 갈리나세우스(S. gallinaceus) JBD427(KACC 81060BP) 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 혈중 암모니아 수치를 감소시킴으로써 신경세포 보호능을 갖는 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 균주.
  2. 제1항의 혈중 암모니아 수치 저하능을 갖는 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 신경세포 보호용 조성물은 고암모니아혈증 및 이로 인한 신경계 질환의 예방 또는 치료능을 갖는 것을 특징으로 하는 신경세포 보호용 조성물.
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