KR102290381B1 - 락토바실러스 플란타룸 v135 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
락토바실러스 플란타룸 v135 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 V135 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물과 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 V135 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물과 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물에 관한 것이다.
식물성 유산균은 동물성 유산균에 비하여 영양분이 부족하고, 낮은 pH, 높은 염 농도 등의 척박한 환경에서도 강한 생존력을 보이기 때문에 장내에 안정적으로 도달할 수 있게 한다는 장점이 있다. 또한, 동물성 유산균은 배지 영양분으로 탄수화물, 단백질, 지방 등을 사용하여 장시간 발효된 이후 단백질과 지방에 의해 부패되는 균주의 수가 증가하지만, 식물성 유산균은 배지 영양분으로 탄수화물만을 사용하므로 발효 시 부패하지 않는다. 이로 인해, 국내에서는 김치 등의 식물성 발효 식품에서 분리한 유산균의 우수성을 평가한 연구결과를 지속적으로 발표하고 있다.
여러 가지 유익한 작용을 하는 미생물을 프로바이오틱스(probiotics)라고 하는데, 프로바이오틱스의 정의는 점차 확대되어 1989년 Fuller는 프로바이오티스를 “장내 균총을 개선시켜 줌으로써 숙주에게 유익한 영향을 주는 생균제제”라고 정의하였고 살아있는 미생물로서의 정립이 이루어졌지만 1999년 Salminen 등은 “숙주에 유익한 작용을 갖는 미생물 또는 미생물의 성분”으로 정의함으로써 프로바이오틱스의 범위를 사균(死菌) 및 그 균체 성분으로까지 확대시켰다. 최근 들어서는 사균 및 그 균체 성분으로까지 확대되어 정의되던 프로바이오틱스 개념에서 새로운 포스트바이오틱스(postbiotics)라는 새로운 개념이 나타났다. 포스트바이오틱스는 생균과 대사(발효)산물들을 열처리 등에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록한 형태로 균체성분과 대사(발효)산물은 직접 또는 간접적으로 장 내 면역을 조절한다고 알려져 있다(Aguilar-Toal￡ JE et al., Trends Food Sci Technol, 2018). 균체성분으로 세포질(cytoplasm), 세포벽(cell wall), 리포테이코산(lipoteichoic acid), 테이코산(eichoic acid), 펩티도글리칸(peptidoglycan), DNA 등이 있으며, 대사(발효)산물은 유기산(organic acid), 단쇄지방산(short chain fatty acid), 다당류(polysaccharides) 등을 포함하고 있다. 대표적인 부산물인 유기산은 면역세포가 집결되어 있는 파이엘판을 자극하여 면역물질이 나오게 하며 주변의 유해물질을 억제하는 작용을 한다. 포스트바이오틱스는 여러 가지 사균화 방법이 보고되고 있는데 물리적 방법으로는 기계적 파괴(mechanical disruption), 열처리(heat treatment), 감마 또는 UV 조사(gamma- or UV irradiation), 고수압(High hydrostatic pressure), 동결건조(Freeze-drying), 음파처리(Sonication)가 있으며, 화학적 방법으로는 산성 탈수활성(Acid deactivation), 효소처리(enzymatic treatment), 용매추출(solvent extract)법이 있다. 포스트바이오틱스는 heat-treated probiotics, ghost probiotics, inactivated probiotics, paraprobiotics, 유산균 사균체(乳酸菌 死菌體), 열처리 유산균(熱處理 乳酸菌), 유산균 추출물(乳酸菌 抽出物) 등 다양한 용어로 불리고 있다.
포스트바이오틱스(사균)는 프로바이오틱스(생균) 보다 다양한 장점을 가지고 있어 이미 일본, 미국 및 유럽에서는 다양한 형태로 상용화되고 있다. 프로바이오틱스는 위장관 내 물리, 화학적(위산, 담즙, 소화효소) 소화과정에 의해 대부분 사멸하여 외부환경에 의한 안정성이 떨어지고 열에 불안정하여 유통과정의 저온보관이 필요하고 이로 인한 저온보관 및 저온배송이 필요함에 따라 생산비용이 증가하게 된다. 또한 열에 불안정하여 살균처리 공정이 포함된 제품 등의 적용이 불가능하다는 단점이 발생한다. 포스트바이오틱스의 경우, 이미 균의 성장이 일어나지 못하도록 한 형태로 위장관 내 물리, 화학적 소화과정에 영향을 받지 않으며, 열에 안정하여 보관기간별 일정한 기능성을 나타내고, 저온보관 및 저온배송이 불필요함에 따라 생산비용을 절감할 수 있다. 또한 열 안정성이 있어 살균처리 공정이 포함된 제품에 적용이 가능하여 적용 제품의 다양성을 가진다. 이러한 특징으로 포스트바이오틱스는 프로바이오틱스 보다 소재 안정성이 있어 산업적 적용의 범위가 넓고, 유통과정에서 다루기가 쉽고, 일반식품에도 첨가되어 식품의 기능성을 강화하면서 면역조절 기능에서 프로바이오틱스와 동일한 효과로 건강기능식품, 식품첨가제, 의약품, 동물사료 등과 같은 기존의 유산균이 적용되어 온 분야 외에도 화장품 원료로도 적용되어 그 시장이 확대되고 있다. 또한 항생제 사용에 대한 규제가 강화되고 있기 때문에 대체제로서 활용성과 아직 사균체 제품 생산에 본격적으로 뛰어든 업체가 손에 꼽을 정도이기 때문에 시장성과 성장 가능성은 크다고 할 수 있다. 특히 일본에서는 이미 사균체 제품이 많이 출시되어 꽃가루 알러지 등 면역 관련 효능을 기반으로 홍보하고 있다. 하지만 국내는 아직 개별인정소재로 인정받은 소재가 없을 뿐 아니라 관련 제품 또한 수입에 의존하고 있다.
유산균 사균체의 생리활성에 대해 보고된 연구들에 따르면 DSS(Dextran sulfate sodium)로 유도된 대장염을 앓고 있는 마우스의 경우 유산균 사균체를 섭취한 마우스에서 DSS 완화 효과를 보였으며 이식한 육종암세포(Sarcoma-180)의 증식이 감소되고 NK세포가 활성화됨이 보고되었다(Tadano et al., J. Japan Mibyou System association,2011). 또한 유해균의 억제 및 정장 작용에 관해서, 항생제를 투여한 마우스에서 장내 대조군에 비해 유익균은 빠르게 증식하고 유해균은 억제시키는 효능이 개시되어 있다(Simohashi et al., Medicine and biology, 2002). 아울러, 유산균 사균체의 다양한 생리활성은 사균체의 특성상 열과 pH에 영향을 받지 않아 다양한 형태의 제제로 가공이 가능한 장점이 있다(Kan, Food industry, 2001).
한편, 대한민국 등록특허 제10-2028744호에는 면역증강 활성, 항산화 활성 및 소화액 내성을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7717 균주 및 이를 포함하는 약학 조성물 및 식품 조성물에 관련된 내용이 개시되어 있으며,
대한민국 등록특허 제10-1919938호에는 대식세포 및 마우스 동물 모델에서 면역 지표인 TNF-α 및 IL-6의 생산을 유도함으로써 면역 증강 활성을 가지는, 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LM1004 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 조성물, 약학적 조성물, 건강기능식품, 사료첨가제, 기능성 음료, 및 발효제품에 관련된 내용이 개시되어 있으나, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물과 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상술한 것과 같은 문제점을 해결하고 필요한 기술을 제공하기 위하여 안출된 것으로서,
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물을 제공함에 다른 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시형태로서,
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이때, 상기 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체가 조성물 1g당 1×105cfu 내지 1×1012cfu로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 균주의 사균체는, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주를 식용배지에 접종하여 배양액을 제조하고, 배양액을 80℃ 이상의 온도로 가열한 뒤 60℃ 이하의 온도가 되도록 급속 냉각시키는 공정을 1회 이상 반복 실시하여 열처리한 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물을 제공한다.
이때, 상기 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물은, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체가 조성물 1g당 1×105cfu 내지 1×1012cfu로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물에 함유된 균주의 사균체는, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주를 식용배지에 접종하여 배양액을 제조한 뒤, 배양액을 80℃ 이상의 온도로 가열한 뒤 60℃ 이하의 온도가 되도록 급속 냉각시키는 공정을 1회 이상 반복 실시하여 열처리한 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 락토바실러스 플란타룸 V135 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 열처리 공정을 수행함에 따라 세포 독성이 없고 알코올성 간염에 의한 간 손상을 예방 및 개선하여 간염의 치료 효과를 나타내므로, 간염으로 인한 간 손상의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로서 효과가 있어 약학적 조성물 또는 식품첨가제 조성물로 사용될 수 있다.
즉, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주에 열처리를 통한 사균화는 생균의 단점(안정성, 제품 적용성 등)을 개선하여 안정하고 다양한 제품으로의 적용이 가능하면서 생균과의 동등 이상의 기능성을 보유한 소재를 제공할 수 있는 장점이 있다.
또한, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주를 열처리한 사균체는 알코올성 간염에 대한 조직학적 간 조직의 육안적 소견, 조직학적 이상소견(염증세포 침윤, 간세포 내 지방구 침윤, 동모양 혈관 확장) 감소, 간세포 손상지표인 AST, ALT 수치의 감소, 염증성 사이토카인의 생성 억제 및 간염 유발인자의 단백질 발현 감소를 유발하여 간염 예방, 개선 또는 치료의 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 플레이트 배양 사진이다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 Escherichia coli(A), Salmonella typhimurium(B), Bacillus cereus(C)에 대한 항균활성을 평가한 사진이다.
도 3은 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 항산화 활성을 평가한 그래프이다.
도 4는 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간 조직의 병리학적 변화를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 5는 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간세포 손상지표인 AST와 ALT의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간 조직의 염증성 사이토카인 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간염 유발인자의 단백질 발현 변화를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 8은 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간 조직의 염증성 단백질 발현 변화를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 Escherichia coli(A), Salmonella typhimurium(B), Bacillus cereus(C)에 대한 항균활성을 평가한 사진이다.
도 3은 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 항산화 활성을 평가한 그래프이다.
도 4는 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간 조직의 병리학적 변화를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 5는 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간세포 손상지표인 AST와 ALT의 수치 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간 조직의 염증성 사이토카인 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간염 유발인자의 단백질 발현 변화를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 8은 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간 조직의 염증성 단백질 발현 변화를 나타낸 사진 및 그래프이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물(이하, ‘약학적 조성물’이라고도 함)을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물(이하, ‘식품첨가제 조성물’이라고도 함)을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물 및 식품첨가제 조성물은 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 것으로, 알코올성 간염에 대한 조직학적 간 조직의 육안적 소견, 조직학적 이상소견(염증세포 침윤, 간세포 내 지방구 침윤, 동모양 혈관 확장) 감소, 간세포 손상지표인 AST, ALT 수치의 감소, 염증성 사이토카인의 생성 억제 및 간염 유발인자의 단백질 발현 감소를 유발하여 간염 예방, 개선 또는 치료의 효과가 높을 것으로 기대된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물은 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체가 조성물 1g당 1×105cfu 내지 1×1012cfu로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
이는, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체가 조성물 1g당 1×105cfu 미만의 농도로 포함될 경우 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료 효과를 기재하지 못할 우려가 있기 때문이며, 균 수 범위(농도)는 전임상 섭취농도를 인체적용시험을 위한 체표면적 대비 환산계와 성인체중(60㎏)을 계산하여 1×1012cfu 까지 범위로 설정하였다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물에 함유된 균주의 사균체는, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주를 식용배지에 접종하여 배양액을 제조한 뒤, 배양액을 미생물의 사멸을 유도 할 수 있는 80℃ 이상의 온도로 가열한 뒤 60℃ 이하의 온도가 되도록 급속 냉각시키는 공정을 1회 이상 반복 실시하여 열처리한 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 알코올성 간염에 대한 조직학적 간 조직의 육안적 소견, 조직학적 이상소견(염증세포 침윤, 간세포 내 지방구 침윤, 동모양 혈관 확장) 감소, 간세포 손상지표인 AST, ALT 수치의 감소, 염증성 사이토카인의 생성 억제 및 간염 유발인자의 단백질 발현 감소를 유발하여 간염을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 사용할 수 있는 질환 또는 질병은 이에 제한되는 것은 아니며, 알코올성 간염으로 야기된 질환 또는 질병은 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 사용하는 경우 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물은 알코올성 간염에 대한 조직학적 간 조직의 육안적 소견, 조직학적 이상소견(염증세포 침윤, 간세포 내 지방구 침윤, 동모양 혈관 확장) 감소, 간세포 손상지표인 AST, ALT 수치의 감소, 염증성 사이토카인의 생성 억제 및 간염 유발인자의 단백질 발현 감소를 유발하여 간염을 예방 및 개선하는 효과를 가지는 것으로, 이를 목적으로 하는 식품에 첨가될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명에 따른 식품첨가제 조성물은 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료에 사용될 수 있다.
본 발명에서 ‘식품’이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품, 건강 보조식품 및 음료를 모두 포함한다.
본 발명의 식품첨가제 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 따라 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시로 하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
락토바실러스 플란타룸 V135(L
actobacillus plantarum
V135) KCTC18796P 균주
1. 항균활성이 높은 유산균의 확보
유산균 분리를 위해 김치 시료는 가정에서 담근 김치를 사용하였으며, 각종 김치를 무균적으로 잘게 다진 다음, 이 중 1g을 취하여 멸균 생리식염수(0.85% NaCl) 9㎖에 현탁하고 단계적으로 희석하여 혼합용액 1㎖를 취하여 십진희석법으로 희석한 후 MRS 고체배지(Difco, MI, USA)에 도말하여 37℃, 48시간 배양하였다. 각 시료별 배지에서 형성된 단일 콜로니는 bromocresol purple이 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 노란색을 보이는 콜로니를 최종 선별하였다. 선별된 균주의 플레이트 배양 사진은 도 1과 같다.
선별된 균주는 항균활성을 평가하여 항균활성이 가장 뛰어난 1종의 유산균을 선발하였으며, 보관은 20% glycerol stock으로 -70℃에서 보관하였다.
2. 김치로부터 분리한 유산균의 유전학적 동정
분리 균주의 유전학적 동정을 위하여 MRS 액체배지에 접종한 다음 37℃에서 24시간 2차 계대 배양하여 배양액 2㎖를 4,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 0.85% NaCl로 3회 세척하였다. 세척 후, 리소자임(lysozyme, 10㎎/㎖) 0.5㎖를 첨가하여 37℃, 1시간 동안 처리하였다. 단백질 분해효소인 프로테아제 K(Protease K) 20㎕와 10% SDS(sodium dodecyl sulfate) 25㎕를 첨가한 후, 60℃ 항온수조(water bath)에서 30분 처리한 후 RNA 분해효소인 RNase 1㎕를 첨가하여 37℃, 1시간 처리하였다. 동량의 페놀(Phenol)-클로로포름(Chloroform)-이소아밀 알콜(Isoamyl alcohol)을 25:24:1의 비율로 첨가하여 현탁한 후, 14,000rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 상층액만 취한 다음, 이와 같은 과정을 2회 반복하였다. 상층액 양의 1/2배 양의 3M 암모늄 아세테이트(ammonium acetate, pH 4.8)와 2배 양의 100% alcohol을 첨가하고 -20℃에서 1시간 정치하였다. 3,000rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리 하여 세포 침전물을 확인하고, 상등액을 완전히 제거한 후에 70% ethanol 1㎖/ℓ를 넣고 다시 3,000rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리 하였다. 상층액 제거 후에 건조시키고 TE 버퍼나 증류수로 현탁하여 DNA를 분리하였다. 미생물의 16S rRNA를 증폭하기 위해 정방향 프라이머(27f) : (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3' ; 서열번호 2)와 역방향 프라이머(1492r) : (5'- GGT TAC CTT TGT TAC GAC TT -3' ; 서열번호 3)를 사용하였다. PCR 프리믹스(Bioneer, Cat No. K-2012)에 증류수 17㎕, 정방향 프라이머 1㎕, 역방향 프라이머 1㎕, DNA 1㎕를 첨가하여 혼합한 후 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃에서 1분, 62℃에서 40초, 72℃에서 40초로 30회를 반복하였으며, 72℃에서 7분으로 반응을 종료하였다. PCR 반응 산물을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)로 전기영동을 실시하여 확인하였다. 최종 염기서열을 분석하고 이를 데이터베이스와 비교하여 유산균주를 동정한 결과, 본 발명에 의해 분리된 균주는 락토바실러스 플란타룸으로 나타났으며, 상기 유산균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2019년 12월 03일자로 기탁하였다(KCTC18796P).
락토바실러스 플란타룸 V135(L
actobacillus plantarum V1
35) KCTC18796P 균주의 식품첨가제 조성물로서 활용 특성 분석
1. 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 내산성 평가
유산균이 장내 도착하기 위해서는 섭취 후 pH 2인 위를 통과하여야 한다. 이러한 극한의 조건을 견뎌내는 내산성 조사하기 위하여 락토바실러스 플란타룸 V135 균주를 MRS 액체배지(MRS broth medium; Difco, USA)에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 원심분리(4,000×g, 4℃, 5min)하여 Phosphate-buffered saline(PBS, pH7)에 2번 세척하였고, PBS로 균을 OD600 = 1.0(108~109cfu/㎖)으로 조정하여 사용하였다. 유산균 희석액 1㎖를 9㎖ PBS(pH 2와 7)에 첨가 후, 진탕한 뒤 37℃에서 배양하였다. 배양 초기부터 시간별(0hour, 30min, 1hour, 3hour)로 샘플링한 후 MRS 액체배지로 희석하고 MRS 고체배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양 후 평판배지 위의 집락 수를 계수하여 생균수를 측정하였으며 그 결과는 하기 표 1과 같다.
하기 표 1에 나타나 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸 V135 균주는 생리적 활성보다 낮은 pH 2에서도 생존 균수의 감소가 적어 내산성이 우수함을 확인하였다.
| 구분 | 생균수 (cfu/㎖) | |||
| 0 h | 30 min | 1 h | 3 h | |
| pH 7 | 6.30 × 107 | 8.10 × 107 | 5.37 × 107 | 5.20 × 107 |
| pH 2 | 6.50 × 107 | 4.64 × 107 | 4.46 × 107 | 4.91 × 106 |
2. 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 내담즙성 평가
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 내담즙성을 평가하였다. 장관 내 담즙산염 농도가 0.1% 내외임을 감안하여 담즙산염(Porcine bile salts)농도가 각각 0, 1, 3%가 되도록 MRS 액체배지를 제조하였다. 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 V135 균주를 멸균된 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 담즙산염이 함유된 MRS 액체배지에 0.1%(v/v)씩 접종하였다. 접종 후 37℃에서 배양하면서 0, 0.5, 1, 3시간 뒤 시료를 채취한 후에 멸균된 MRS 액체배지에 희석하고 MRS 평판배지에 도말한 다음 37℃에서 48시간동안 배양한 후, 평판배지 위의 집락 수를 계수하여 생균수를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었으며, 락토바실러스 플란타룸 V135 균주는 장내 실제 농도와 유사한 1% 뿐만 아니라 더 높은 3%에서도 적정 균수를 유지하였기 때문에 락토바실러스 플란타룸 V135 균주는 담즙에 의한 사멸이 없이 인체나 동물의 장 내에서도 충분히 생존할 수 있음을 확인 할 수 있는 근거가 될 수 있다.
| 구분 | 생균수 (cfu/㎖) | |||
| 0 h | 30 min | 1 h | 3 h | |
| Oxgall 0% | 5.54 × 106 | 5.04 × 106 | 3.68 × 106 | 3.19 × 107 |
| Oxgall 1% | 4.91 × 106 | 4.72 × 106 | 5.31 × 106 | 1.80 × 107 |
| Oxgall 3% | 5.41 × 106 | 7.30 × 106 | 5.55 × 106 | 1.99 × 107 |
3. 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 공응집능 평가
유산균의 항염 작용에 있어 유산균이 장내에 점착하면서 장내 병원성 유해세균과의 응집력이 매우 중요한 요인이다. 본 발명에서는 지시균으로 대장균(Escherichia coli), 대장균(Escherichia coli O157), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 장티푸스(Salmonella typhimurium) 균주를 사용하였다. 배양 배지로 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 대장균을 각각 MRS 액체배지와 Nutrient 액체배지(Difco; USA)를 사용하였다. 락토바실러스 플란타룸 V135 균주를 전 배양한 배양액을 OD600 = 1.0(108~109cfu/㎖)으로 조정하여 새로운 5㎖ MRS 배지에 1% 접종한 뒤, 24시간 배양하고 원심분리(4,000×g, 4℃, 5min)하여 세포를 회수하였다. 병원성 균은 배양배지로 전배양한 후 OD600 = 0.1으로 조정하여 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 사용하였다. 이를 PBS 완충용액에 다시 현탁하여 생균수를 1.0×108cfu/㎖로 조정하였다. 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 유해균 현탁액 각각 2㎖씩 혼합하고 10초간 교반한 후 37℃에서 5시간 동안 정치 보관하면서 각 시간별(0hour, 5hour)로 공응집능을 조사하였다. 공응집능은 Kos 등의 방법(2003)에 따라 하기 [계산식 1]로 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.
[계산식 1]
| 구분 |
Escherichia
coli |
Escherichia coli O157 |
Salmonella
typhimurium |
Staphylococcus
aureus |
| 공 응집능 (%) | 74% | 56% | 41% | 72% |
상기 표 3에 나타난 바와 같이 실험에 사용한 유해균 모두 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와의 응집률이 높았다. 특히, 락토바실러스 플란타룸 V135 유산균과 대장균의 응집률이 74%로 장관 흡착능의 우수성을 보였다.
락토바실러스 플란타룸 V135(L
actobacillus plantarum V1
35) KCTC18796P 균주의 사균체
락토바실러스 플란타룸 V135 균주 사균체의 제조방법은 하기와 같다.
락토바실러스 플란타룸 V135 균주를 식용배지에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하여 배양액을 제조하였다. 정지기(Stationary phase)로 세포 증식이 최고로 도달하고 다량의 대사산물을 포함하고 있는 시기에 상기 배양액을 100℃로 1차 가열(살균)하고 50℃ 이하로 급속냉각하였다. 완전한 사균화를 위하여 다시 100℃로 2차 가열(살균)하고 50℃ 이하로 급속냉각하여 열처리 유산균(이하, ‘사균체’이라고 함)을 제조하였다. 이후 상기 사균체에 부형제로 덱스트린, 말토덱스트린, 포도당 등의 부형제(또는 보호제)를 혼합하여 분무건조하여 분말화 하였다. 이때, 분무건조의 입구 온도는 180℃, 출구온도는 100℃ 이하로 하여 분무건조하였다.
락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 및 상기의 사균체의 약학적 조성물로서의 활용 특성 분석
락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 상기 실시예 3에서 제조된 사균체에 대한 유해균 항균활성, 항산화 효과 및 알코올성 간염 개선 효과를 평가하였다.
1. 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 항균활성
신규의 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 사균체에 대한 항균 활성은 agar well diffusion assay를 이용하여 확인하였다. 식품 유해균인 Escherichia coli O157, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus를 대상으로 NB(Nutrient broth) 배지에서 24시간 이상 배양한 후 균액을 영양한천배지(Nutrient argar)에 1㎖를 분주하여 건조 하였다. 이후 멸균 상태의 biopsy punch(Stiefel Biopsy Punch; Stiefel Laboratories, Research Triangle Park, NC, USA)를 이용하여 well을 만들었다. 각 well에 대조구(a)와 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체(b)를 각 well당 100㎕씩 분주하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후, well 주위에 형성된 저해환을 확인하여 항균황성의 유무를 확인하였으며, 그 결과는 하기 도 2와 같다.
도 2에 도시된 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸 V135 균주는 Escherichia coli O157, Salmonella typhimurium 및 Bacillus cereus에 대한 높은 항균활성을 보였으며 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 사균체 또한 3종의 균주에 대한 항균활성이 높은 것으로 확인되었다.
2. 락토바실러스 플라타룸 V135 사균체의 항산화 활성
신규의 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 사균체에 대한 항균 활성은 DPPH radical 소거능 측정법을 이용하여 확인하였다. 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 사균체는 0.5, 1, 5, 10%의 농도가 되도록 멸균수에 녹여 실험에 사용하였다. DPPH 용액은 DMSO에 녹여 0.4mM의 농도로 제조하였다. DPPH radical 소거능은 시료 50㎕와 DPPH 용액 50㎕ 혼합하여 상온에서 10분간 반응한 후 분광광도계를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 50㎕의 멸균수를 첨가하여 반응 후 얻은 흡광도 값을 사용하였다. 양성 대조구로는 항산화제로 잘 알려진 ascorbic acid를 사용하여 락토바실러스 플란타룸 V135 균주의 사균체의 항산화 활성을 비교하였다. DPPH 라디칼 소거활성(%)은 하기의 [계산식 2]로 계산하였으며, 그 결과는 하기 도 3과 같다.
[계산식 2]
DPPH 라디칼 소거활성(%) = (B-A)/B × 100
(A: 시료의 흡광도, B: 대조구의 흡광도)
DPPH 라디칼 소거활성(%)을 측정한 결과, 하기 도 3에 도시된 바와 같이 락토바실러스 플라타룸 V135 사균체는 0.5, 1, 5, 10, 20%에서 각각 14.5, 27.6, 89.2, 94.3, 94.5%의 DPPH 라디칼 소거능(항산화능)을 나타내는 것으로 확인되었다. 양성 대조구로 사용된 ascorbic acid에서는 0.001, 0.01%에서 각각 2.14, 38.4%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. 따라서 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체는 뛰어난 DPPH 소거능을 가져 항산화 활성을 보유한 것으로 확인되었다.
이러한 결과는 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체는 높은 항균활성 및 항산화 효과를 나타내면서 균주가 가지는 단점인 소재의 안전성, 외부환경(내산성, 내담즙성) 및 열에 대한 안정성 부분을 보완한 사균체의 약학적 조성물 및 식품첨가제 조성물로서의 활용가능성을 보이는 결과이다.
3. 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 알코올성 간염 개선 효과
< 실험군 설정 및 시료 투여 >
(주)오리엔트바이오(Seongnam, Korea)로부터 공급 받은 5주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 일주일 동안 설치류 사육실에서 적응시킨 후 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 개체만 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 22±3℃, 습도 50±5%에서 명/암 주기는 12시간으로 유지하고 식이와 물을 자유롭게 공급하여 1주일간 기본식이로 적응시켰다. 순화기간 중 건강하다고 판정된 마우스에 한하여 무작위법을 이용하여 군 분리하였다.
군 분리는 하기 표 4에서와 같이, 정상대조군(NC), 알코올성 간염 유발 시험대조군(EtOH), 양성대조군(ursodeoxycholic acid 50 mg/kg/day for 10 days, p.o.)(PC), 락토바실러스 플란타룸 V135 균주 저농도(4×109cfu/g) 125㎎/㎏/day 투여군(LP-L), 락토바실러스 플란타룸 V135 균주 고농도(4×109cfu/g) 250㎎/㎏/day 투여군(LP-H), 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체 저농도(4×109cfu/g) 125㎎/㎏/day 투여군(HLP-L) 및 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체 고농도(4×109cfu/g) 250㎎/㎏/day 투여군(HLP-H)과 같이 분리하였으며, 총 7군으로 군당 8마리씩 구성하여 실험을 진행하였다.
| 실험군 | 실험물질 | 투여용량 | 동물 수 |
| NC | DW | - | 8 |
| EtOH | EtOH | - | 8 |
| PC | EtOH + ursodeoxycholic acid | 50 ㎎/㎏/day | 8 |
| LP-L | EtOH + L. plantarum V135 균주 | 125 ㎎/kg/day | 8 |
| LP-H | EtOH + L. plantarum V135 균주 | 250 mg/kg/day | 8 |
| HLP-L | EtOH + L. plantarum V135 사균체 | 125 ㎎/kg/day | 8 |
| HLP-H | EtOH + L. plantarum V135 사균체 | 250 mg/kg/day | 8 |
NC와 EtOH군은 DW를 매일 1회씩 총 10일 동안 경구투여 하였으며, PC, LP-L, LP-H, HLP-L, HLP-H군은 각각의 시험물질을 매일 1회씩 총 10일 동안 경구투여 한 후, 마지막 시험물질 투여 60시간(2.5일) 전부터 12시간 간격으로 60% 알코올을 10㎖/㎏을 경구투여 하여 알코올성 간염을 유발시켰다. 마지막 알코올 투여 4시간 뒤 마우스를 희생시켜 심장채혈 및 간 조직을 적출하였다.
< 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 알코올에 의한 간 조직의 병리학적 변화 관찰 >
적출한 간 조직을 10% formalin에 고정 후 파라핀 블록을 제작하였고, 5㎛ 두께로 절편을 만들어 슬라이드를 제작하였다. H&E(Hematoxylin & Eosin) 용액으로 염색을 실시한 후, 광학현미경을 사용하여 관찰하였으며, 염증세포 침윤, 지방구 침윤 및 동모양 혈관 확장 소견을 점수화하였다. 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간 조직의 병리학적 변화를 관찰한 결과는 하기 도 4와 같다.
도 4에 도시된 바와 같이, 알코올성 간염 유발 시험대조군(EtOH)은 간 조직에 염증세포의 침윤, 지방구 침윤 및 동모양혈관 확장 소견이 관찰되었으며, 락토바실러스 플란타룸 V135 균주(LP), 상기 균주의 사균체(HLP)는 농도 의존적으로 모두 알코올로 유도된 임상적 소견을 유의적으로 감소시키는 것으로 확인되었다. 특히 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체(HLP)는 락토바실러스 플란타룸 V135 균주(LP)에 비해 알코올로 유도된 임상적 소견을 더욱 더 감소시키는 경향을 보였다.
< 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 알코올에 의한 혈청의 AST, ALT 농도 관찰 >
혈청의 aspartate aminotransferase(AST)와 alanine aminotransferase(ALT) 효소 활성을 상업용 측정 키트를 이용하여 측정하였다. 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간세포 손상지표인 AST와 ALT의 수치 변화를 관찰한 결과는 하기 도 5와 같다.
도 5에 도시된 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸 V135 균주(LP), 상기 균주의 사균체(HLP)는 알코올에 의해 증가된 혈청 ALT와 AST의 농도를 농도 의존적으로 감소시키는 경향을 보이는 것으로 확인되었다. 특히 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체 고농도군(HLP-H)은 알코올성 간염 유발 시험대조군(EtOH) 대비 유의적인 혈청 ALT, AST 감소를 보였으며, 양성대조군(PC) 보다도 뛰어난 효과를 보였다.
< 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 알코올에 의한 간 조직의 염증성 사이토카인 유전자 발현 관찰 >
TRIzol 용액을 사용하여 간 조직의 total RNA를 추출하고, 260㎚와 280㎚에서 흡광도를 측정하여 RNA 농도와 순도를 확인하였다. Total RNA 100ng으로부터 Prime Script RT 용액 키트를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR은 SYBR Premix Ex Taq를 사용하여 thermal cycler에서 수행하였으며, 반응조건은 95℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분을 총 40회 수행하였다. GAPDH를 대조 유전자로 하여 염증성 사이토카인인 IL-1β와 IL-6의 상대적인 발현 정도를 계산하였으며, 사용한 primer sequence는 interleukin-1β(IL-1β) 및 interleukin-6(IL-6)이다. 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간 조직의 염증성 사이토카인 발현 변화를 관찰한 결과는 하기 도 6과 같다.
도 6에 도시된 바와 같이, IL-1β의 발현은 락토바실러스 플란타룸 V135 균주(LP)와 사균체(HLP)군 모두 알코올성 간염 유발 시험대조군(EtOH) 대비 유의적으로 감소하였으나, IL-6는 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체에서만 유의적인 감소를 보이는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체가 락토바실러스 플란타룸 V135 균주(LP) 대비 동등성 이상의 사이토카인 발현을 억제함을 나타낸다.
< 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 알코올에 의한 간 조직의 MAPK/AP-1 signaling 및 염증성 신호 단백질 발현 관찰 >
과도한 간세포의 apoptosis는 알코올에 의해 유발되는 간 질환의 현저한 병리적 특징으로 급성 및 만성 간염을 비롯한 간 질환에서 간세포 apoptosis에 중요한 역할을 한다. 간 세포의 apoptosis는 간 기능 장애, 섬유증/간경화 및 종양 형성을 비롯한 여러 형태의 병적인 간 손상을 유도한다. 따라서 apoptotic activity와 anti-apoptotic acitivity 사이의 균형은 간 질환의 진행에서 중추적인 역할을 담당하며 간 질환 치료의 표적이 된다. mitogen-activated protein kinase(MAPK)는 여러 가지 외부자극(알코올, 스트레스 등)에 의해 세포의 apoptosis에 관여하는데, extracellular signal-regulated kinas(ERK), c-Jun N-terminal kinase(JNK/SAPK), p38 kinase로 구성되어 있으며, 전사조절인자들을 인산화함으로써 다양한 유전자들의 발현을 조절한다.
간 조직을 RIPA buffer에 넣고 균질화한 후, 15분간 14,000rpm에서 상층액을 분리하였다. 이렇게 얻어진 시료의 단백질 농도는 protein assay를 이용하여 정량하였다. 간 조직 균질 용액 50㎍을 2×loading buffer와 혼합하여 95℃에서 5분간 끓여준 후 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF지로 옮긴 후, Ponceasu S 용액 염색으로 확인하였다. 이 후, TBS-T 용액에 희석한 5% 탈지분유 용액에 2시간 이상 처리하였다. 1차 항체는 phophorylated-SAPK/JNK(p-SAPK/JNK), SAPK/JNK, phosphorylated-Erk, Erk, phosphorylated-p38 MAPK, p38 MAPK, c-Jun, c-Fos, phosphorylated-nuclear factor kappa B(p-NFκB), NFκB, iNOS, COX-2를 1 : 500~1,000의 비율로 희석하여 사용하였다. TBS-T 용액으로 충분히 세척한 후 2차 항체로 goat anti-rabbit IgG(H+L)-horse radish peroxidase conjuge를 1 : 5,000의 비율로 희석하여 반응시켰다. ECL 용액으로 반응시킨 뒤, chemiluminescence image system을 이용하여 밴드의 진하기를 정량하였다. 인산화된 단백질의 발현 수준은 해당 단백질의 전체 단백질 발현 수준을 기준으로 상대적인 값으로 계산하였다. 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간염 유발인자의 단백질 발현 변화를 관찰한 결과는 하기 도 7과 같다.
도 7에 도시된 바와 같이, 간 세포의 apoptosis와 관련한 단백질 발현을 평가한 결과, 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체(HLP)의 투여는 알코올에 의한 간 세포 apoptosis 관련 단백질 인자의 발현이 모두 농도 의존적으로 감소하는 것으로 확인되었으며. 락토바실러스 플란타룸 V135 균주(LP) 대비 동등성 이상의 단백질 발현 감소를 보였다.
< 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체의 알코올에 의한 간 조직의 p65NF-κB 단백질 발현 관찰 >
알코올과 같은 자극에 의해 염증반응의 전사인자인 nuclear factors-κB(NF-κB)를 활성화시키며, 그 결과 inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(C0X-2)를 발현시켜 과량의 nitric oxide(NO)와 PGE2를 생성하여 염증을 일으킨다. 알코올 투여로 간 손상을 유발한 쥐에서 락토바실러스 플란타룸 V135 균주와 사균체에 의한 간 조직의 염증성 단백질 발현 변화를 관찰한 결과는 하기 도 8과 같다.
도 8에 도시된 바와 같이, 염증관련 인자인 NF-κB, iNOS 및 C0X-2의 간 조직 내 단백질 발현을 확인한 결과, 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체(HLP)의 투여는 알코올에 의한 간 조직의 염증성 관련 단백질 인자 발현이 모두 농도 의존적으로 감소하였으며, 락토바실러스 플란타룸 V135 균주(LP) 대비 동등성 이상의 단백질 발현 감소를 보이는 것으로 확인되었다.
이러한 결과를 종합할 때, 상기와 같은 결과는 락토바실러스 플란타룸 V135 사균체가 알코올로 유도된 간 세포의 apoptosis와 염증 억제를 통해 간 세포의 손상을 억제할 수 있음을 설명할 수 있다.
결론적으로, 상기 실시예 1 내지 4의 실험 결과를 통해, 락토바실러스 플란타룸 V135 균주 또는 상기 균주의 사균체는 알코올성 간염에 대한 육안적 간 손상, 병리학적 변화 및 염증성 사이토카인 생성을 억제하여 간염 예방, 개선 또는 치료의 효과가 있기 때문에 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 또는 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물로 사용될 수 있는 장점이 있으며, 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC 균주에 열처리를 통한 사균화는 생균의 단점(안정성, 제품 적용성 등)을 개선하여 안정하고 다양한 제품으로의 적용이 가능하면서 생균과의 동등 이상의 기능성을 보유한 소재를 제공할 수 있는 장점이 있다.
이상, 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않으며, 여러 가지 다양한 형태로 변형될 수 있고, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 많은 변형이 가능함이 명백하다. 또한, 청구범위의 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.
Claims (6)
- 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은,
락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체가 조성물 1g당 1×105cfu 내지 1×1012cfu로 포함되는 것을 특징으로 하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 균주의 사균체는,
락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주를 식용배지에 접종하여 배양액을 제조하고, 배양액을 80℃ 이상의 온도로 가열한 뒤 60℃ 이하의 온도가 되도록 급속 냉각시키는 공정을 1회 이상 반복 실시하여 열처리한 것임을 특징으로 하는 알코올성 간염의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물. - 락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물.
- 청구항 4에 있어서,
상기 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물은,
락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주 또는 상기 균주의 사균체가 조성물 1g당 1×105cfu 내지 1×1012cfu로 포함되는 것을 특징으로 하는 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물. - 청구항 4에 있어서,
상기 균주의 사균체는,
락토바실러스 플란타룸 V135(Lactobacillus plantarum V135) KCTC18796P 균주를 식용배지에 접종하여 배양액을 제조한 뒤, 배양액을 80℃ 이상의 온도로 가열한 뒤 60℃ 이하의 온도가 되도록 급속 냉각시키는 공정을 1회 이상 반복 실시하여 열처리한 것임을 특징으로 하는 알코올성 간염의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물.
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