CN111394276A - 一种对脑卒中具有保护作用的植物乳杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对脑卒中具有保护作用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR113菌株，植物乳杆菌AR113菌株已在2017年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13909。本发明的植物乳杆菌AR113菌株能够通过提高脑组织的抗氧化酶活性，降低氧化产物水平，激活Nrf‑ARE信号通路，调节抗氧化因子Nrf2、NQO‑1、HO‑1的相对表达量，同时下调促凋亡因子Cyt‑C、Caspase‑3和Bax的mRNA表达，上调抑凋亡因子Bcl‑2的相对表达，进而改善由于脑缺血再灌注引起的脑细胞损伤。

Description

一种对脑卒中具有保护作用的植物乳杆菌
技术领域
本发明涉及属于微生物技术领域，具体涉及一种对脑卒中具有保护作用的植物乳杆菌。
背景技术
脑卒中是多种脑血管疾病的严重表现形式，包括出血性和缺血性卒中。在我国，缺血性卒中的发病率要远高于出血性卒中，约占总数的70％。缺血性卒中发生后，尽快恢复患者脑血流是目前救治患者最有效的医疗手段之一。然而，血流再灌注会加剧细胞损伤导致病情的加重，即缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，I/R)。炎症反应、氧化应激的产生及细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的主要机制，也是卒中后患者神经功能缺损的重要原因。
益生菌作为一类对宿主有益的活性微生物，已经广泛用于肠道疾病的辅助治疗。益生菌抗炎、抗氧化、增强免疫和调节微生态等益生功能及其机制已经在各种实验中得到确证，由于菌群-肠-脑轴的存在，应用益生菌来治疗神经系统疾病也得到越来越多的关注，而益生菌对脑缺血再灌注损伤是否有减轻作用及其可能机制值得探讨。体内外实验均已证明本实验室保藏菌株植物乳杆菌AR113具有较强的抗氧化能力，能有效缓解因氧化应激导致的损伤[1,2]，且AR113具有良好的口腔应用基本特性，具备作为口腔益生菌的应用潜力。
参考文献
[1]Lin X,Xia Y,Wang G,et al.Lactobacillus plantarum AR501 Alleviatesthe Oxidative Stress of D-Galactose-Induced Aging Mice Liver by Upregulationof Nrf2-Mediated Antioxidant Enzyme Expression[J]. Journal of Food Science,2018,83(7):1990-1998.
[2]Lin X,Xia Y,Wang G,et al.Lactic Acid Bacteria With AntioxidantActivities Alleviating Oxidized Oil Induced Hepatic Injury in Mice[J].Frontiers in Microbiology,2018,9:2684.
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种对脑卒中具有保护作用的植物乳杆菌。
本发明提供了一种对脑卒中具有保护作用的植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)AR113菌株，具有这样的特征：该植物乳杆菌AR113菌株已在2017年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13909。
本发明还提供了利用植物乳杆菌AR113菌株制备对脑卒中具有保护作用的制品中的应用。
发明的作用与效果
本发明的植物乳杆菌AR113应用于I/R大鼠口腔内对其舌苔和肠道菌群均有调节作用，并对神经功能缺陷及脑损伤具有一定的保护作用，其主要原因是由于AR113具有优良的抗氧化和抗凋亡活性， AR113口腔应用后，能够调节I/R损伤导致的舌苔菌群失调，并能够维持其肠道菌群的稳态。同时AR113能够减轻I/R损伤导致的神经功能缺陷和脑细胞氧化应激损伤并对细胞凋亡有一定的改善作用。
附图说明
图1是本发明的实施例1中动物实验设计示意图；
图2是本发明的实施例2中大鼠舌苔菌群属水平组成示意图；
图3是本发明的实施例2中大鼠舌苔细菌科水平物种丰度聚类图；
图4是本发明的实施例2中大鼠舌苔菌群非度量多维尺度分析示意图；
图5是本发明的实施例2中大鼠舌苔菌群组间主要物种差异图；
图6是本发明的实施例3中大鼠肠道菌群属水平的组成图；
图7是本发明的实施例3中大鼠肠道细菌属水平主要差异物种分析示意图；
图8是本发明的实施例3中大鼠肠道菌群非度量多维尺度分析示意图；
图9是本发明的实施例3中大鼠肠道菌群组间LEfSe分析示意图；
图10是本发明的实施例4中AR113对I/R大鼠神经功能评分的影响示意图；
图11是本发明的实施例5中水迷宫实验移动轨迹示意图；
图12是本发明的实施例6中AR113对I/R大鼠脑梗死体积的影响图；
图13是本发明的实施例7中脑组织HE染色图；
图14是本发明的实施例8中AR113对I/R大鼠脑组织中SOD、 GSH-Px、CAT酶活性、MDA以及H2O2水平的影响示意图；
图15是本发明的实施例8中AR113对I/R大鼠脑组织抗氧化相关因子的调节作用示意图；
图16是本发明的实施例9中AR113对I/R大鼠脑细胞凋亡的影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
以下实施例中所涉及的主要试剂如水合氯醛(TCA)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)和4％多聚甲醛购自国药集团化学试剂公司； BCA蛋白检测试剂盒、SOD检测试剂盒、GSH-Px检测试剂盒、CAT 检测试剂盒、H2O2检测试剂盒和MDA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Trizol、反转录试剂盒和SYBR Green试剂盒购自 TaKaRa公司。实施例中采用的引物具体DNA序列信息见表1，由上海生工公司合成。细菌多样性由上海美吉生物医药科技有限公司测序。
表1荧光定量q-PCR反应扩增引物序列
Figure RE-GDA0002513270780000041
Figure RE-GDA0002513270780000051
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
实施例1：大鼠脑缺血再灌注模型制作和实验分组
大鼠脑缺血再灌注模型制作：所有大鼠术前12h禁食但不禁水，称重后腹腔注射10％水合氯醛(质量浓度)进行麻醉(3.5mL/kg)，仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭 ICA，然后近心端结扎CCA、ECA，接着在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将栓线插入到ICA，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢栓线，于缺血2h后缓慢将栓线拔出行再灌注制备脑缺血再灌注模型。
图1是本发明的实施例1中动物实验设计示意图。
将27只实验大鼠适应性饲养一周后随机分为3组，每组9只，实验设计如图1所示。假手术组(Sham组)：仅分离颈部血管，不进行栓线步骤，且实验期间每天口腔喷雾0.01MPBS溶液1ml，连续14天。缺血再灌注组(I/R组)：在时间点②即第7天利用大脑中动脉栓塞法制备缺血再灌注模型，且实验期间每天口腔喷雾0.01M PBS溶液1ml，连续14天。植物乳杆菌AR113干预组(AR113组)：造模前一周(时间段①)每天口腔喷雾AR113菌悬液(109CFU/ml)1ml，造模后给予AR113连续一周同①。
实施例2：植物乳杆菌AR113对I/R大鼠舌苔微生物群的结构调节
通过16S rDNA高通量测序技术检测L.plantarum AR113对I/R 大鼠舌苔菌群的影响。α多样性指数变化结果如表2所示，与假手术组相比，I/R大鼠舌苔菌群丰富度和多样性均呈下降趋势，且Chao 指数和Shannon指数的降低具有统计学意义(P<0.05)，表明脑缺血再灌注损伤会导致大鼠舌苔菌群结构发生迁移，菌群的丰度和多样性均显著降低。而AR113的干预明显提高了菌群的多样性，与I/R组相比，AR113作用后，大鼠舌苔菌群丰度和多样性指数虽无显著性差异，但均表现出一定的改善作用，不同程度地提高了I/R大鼠舌苔菌群的多样性。
表2大鼠舌苔菌群α多样性指数
Figure RE-GDA0002513270780000061
Figure RE-GDA0002513270780000071
注：*P<0.05vs Sham group。
图2是本发明的实施例2中大鼠舌苔菌群属水平组成示意图。
如图2所示，其中Pasteurella、unclassified_f__Neisseriaeae、Streptococcus、Muribacter、Pseudomonas、 unclassified_f__Alcaligenaceae、Klebsiella、Neisseria、Rothia、Acinetobacter、Staphylococcus、Haemophilus和Corynebacterium等13 个菌属占物种组成丰度的80％以上，为大鼠舌苔的主要菌属。
图3是本发明的实施例2中大鼠舌苔细菌科水平物种丰度聚类图。
在科水平进行物种丰度聚类分析，选取相对丰度排在前30的物种，进行物种聚类并绘制成热图来呈现群落物种组成信息，通过颜色变化来反映科水平不同物种在组间的差异丰度。大鼠舌苔菌群I/R组的Moraxellaceae、Lactobacillaceae、Bacteroidales_S24-7__group、 Bacillaceae、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Enterococcaceae、Bacteroidaceae、Flavobacteriaceae和Prevotellaceae较Sham组相对丰度降低，AR113组较I/R组的物种丰度有一定程度提高，其中， Moraxellaceae和Lactobacillaceae丰度的提高尤为明显，如图3所示。结果表明AR113的干预能够调节脑缺血再灌注损伤大鼠舌苔菌群结构，一定程度上改善了I/R后舌苔菌群的失调。
图4是本发明的实施例2中大鼠舌苔菌群非度量多维尺度分析示意图。
为了研究不同样本间菌群结构的相似性，对I/R大鼠舌苔细菌进行非度量多维尺度分析(NMDS分析，Non-metric multidimensional scaling analysis)，结果如图4所示，图中同一颜色、形状的点为同一组样本，两样本点越近，表明两样本物种组成越相似。Stress为 0.103，通常认为stress＜0.2时，其图形有一定的解释意义，可准确反映样品间的差异程度。I/R组样本与Sham组相距较远，说明I/R组的样本菌群结构与Sham组有所差异，而AR113组样本与Sham组均集中在二、三象限，点间距离近，表明AR113组与Sham组样本菌群结构相似，AR113的干预有利于重建I/R大鼠的舌苔菌群，促进舌苔微生态平衡的恢复。
为了找出造成菌群结构差异的主要物种，利用Kruskal-Wallis秩和检验方法对组间的物种丰度数据进行假设检验得到P值，从科水平对Sham-I/R组、I/R-AR113组间差异分析，见表3，发现Neisseriaceae、 Streptococcaceae在I/R组中丰度显著升高，而Bacteroidales_S24-7_group、Lactobacillaceae、Lachnospiraceae、 Prevotellaceae等物种丰度在I/R组均降低，表明脑缺血再灌注后大鼠的舌苔菌群组成丰度发生统计学变化，增加Lactobacillaceae、 Aeromonadaceae、Bacillaceae等物种丰度可能是AR113调节I/R损伤大鼠舌苔菌群紊乱的主要作用方式。
表3大鼠舌苔菌群科水平丰度差异物种
Figure RE-GDA0002513270780000081
Figure RE-GDA0002513270780000091
图5是本发明的实施例2中大鼠舌苔菌群组间主要物种差异图，其中*P<0.05,**P<0.01 vs Sham group；#P<0.05 vs I/R group，图5(a) 是Tenericutes菌属丰度对比图，图5(b)是Neisseriaceae菌属丰度对比图，图5(c)是Bacteroidales_S24-7菌属丰度对比图，图5(d) 是Lactobacillaceae菌属丰度对比图，图5(e)是Prevotellaceae菌属丰度对比图，图5(f)是Ruminococcaceae菌属丰度对比图，图5(g) 是Lactobacillus菌属丰度对比图。
选取在三组中均有影响作用且丰度变化明显的物种进一步绘制柱形图进行组间显著性分析，如图5所示。门水平上，I/R组Tenericutes 丰度显著降低(P＜0.01)，AR113组较I/R组有所升高，但升高无统计学差异；科水平上，I/R损伤显著降低了Bacteroidales_S24-7_group、 Lactobacillaceae、Prevotellaceae和Ruminococcaceae丰度，Neisseriaceae丰度却显著增加。该结果与第三章人类脑卒中患者舌苔菌群结构的变化基本一致，Prevotellaceae、Ruminococcaceae等物种丰度的降低是脑损伤后共同特征，I/R大鼠舌苔菌群变化再一次证实了脑损伤后舌苔菌群的失调。属水平上，AR113的作用可显著升高由于I/R损伤降低的Lactobacillus丰度(P＜0.05)。菌群差异分析结果充分表明了AR113可以调节I/R大鼠舌苔菌群，缓解因I/R损伤导致的菌群失调。
实施例3：植物乳杆菌AR113对I/R大鼠肠道微生物群的结构调节
本实施例研究AR113的摄入对I/R大鼠粪便样品中肠道菌群的影响。α多样性指数变化如表4所示，与假手术相比，I/R大鼠肠道菌群的丰富度指数(ACE、Chao)和多样性指数(Shannon、Simpson)均显著降低，表明I/R损伤后大鼠肠道菌群结构多样性降低，AR113的干预能明显提高由于I/R损伤导致的肠道菌群多样性的降低，表明 AR113能一定程度上调节I/R大鼠的肠道菌群，起到改善作用。
表4大鼠肠道菌群α多样性指数
Figure RE-GDA0002513270780000101
Figure RE-GDA0002513270780000111
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs Sham group；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vsI/R group。
图6是本发明的实施例3中大鼠肠道菌群属水平的组成图。
如图6所示，Lactobacillus、norank_f__Bacteroidales_S24-7_group、Ruminococcaceae_UCG-014、Prevotellaceae_Ga6A1_group、 Bacteroides、unclassified_f__Lachnospiraceae、Prevotellaceae_UCG-001 等物种是大鼠肠道菌群的主要组成部分。其中，Lactobacillus是三组大鼠的最主要菌属，样本中相对丰度最高，尤其在I/R大鼠中明显富集，丰度高达52.60％，但在假手术和AR113组中丰度较低，分别为 26.16％，12.33％。Lactobacillus丰度增加可能起到自身免疫系统调节的作用。
图7是本发明的实施例3中大鼠肠道细菌属水平主要差异物种分析示意图，图7(a)是Lactobacillus菌属丰度对比图，图7(b)是菌属丰度对比图，图7(c)是Blautia菌属丰度对比图，图7(d)是 Allobaculum菌属丰度对比图，图7(e)是 Lachnospiraceae_NK4A136_grou菌属丰度对比图，图7(f)是 Ruminococcaceae_UCG-005菌属丰度对比图。
为了研究组间具有显著性差异的肠道菌群物种，从属水平对三组大鼠物种的相对丰度进行差异比较，结果如图7所示，与假手术组相比，I/R大鼠肠道菌群Lactobacillus、Bacteroides、Blautia、Allobaculum 丰度显著增加，而Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcaceae_UCG-005的丰度呈现明显下降趋势， Lachnospiraceae、Ruminococcaceae菌科是健康肠道的标志物种。 AR113作用后能够调节I/R损伤导致的肠道菌群失调，减少 Lactobacillus、Bacteroides、Blautia、Allobaculum，增多Lachnospiraceae_NK4A136_group和Ruminococcaceae_UCG-005丰度是AR113调节I/R导致的脑损伤小鼠肠道菌群紊乱的主要作用方式。
图8是本发明的实施例3中大鼠肠道菌群非度量多维尺度分析示意图。
大鼠肠道菌群β多样性分析，采用非度量多维尺度分析，根据 UnweightedUnifrac算法计算大鼠样本肠道菌群物种信息，与舌苔微生物相比，肠道微生物的组内相似性更高。Stress值为0.034，小于 0.05，表明所给样品的差异程度具有代表性，在图中能精确地被反映。排除I/R组个别样本后，三组样本点排列集中，均很好地聚成三类，不同处理会造成大鼠肠道菌群完全不同的结构组成，如图8所示。I/R 组样本点与假手术和AR113组距离均较远，说明I/R损伤后，大鼠肠道菌群发生了明显改变，AR113组样本点与假手术样本点分别分布在第二、三象限，菌群的结构存在差异，但均位于图形的左半部分，表明两组又具有一定的相似性。NMDS分析结果表明，I/R损伤后大鼠肠道菌群异常改变，而AR113的作用能够调节失调的肠道菌群，使其向假手术组样本更加靠拢，对菌群的结构组成有一定的恢复作用。
图9是本发明的实施例3中大鼠肠道菌群组间LEfSe分析示意图，图9(a)是假手术组与I/R组比较分析示意图，图9(b)是AR113 组与I/R组比较分析示意图。
对三组样本进行LefSe分析，由LDA分布柱状图可知，I/R组较 Sham组乳杆菌属(Lactobacillus)乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌目(Lactobacillales)杆菌纲(Bacilli)，拟杆菌属(Bacteroides) 拟杆菌科(Bacteroidaceae)，Allobaculum，Blautia，Eubacterium菌属丰度升高，为I/R相关的肠道物种，如图9(a)所示，AR113作用后可以升高拟杆菌门(Bacteroidetes)，螺旋菌门(Spirochaetae)，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)，瘤胃菌科(Ruminococcaceae)，螺旋体科(Spirochaetaceae)，Rikenellaceae，Prevotella_9， Lachnospiraceae_NK4A136_group丰度，如图9(b)所示。本研究结果显示，益生菌AR113的干预能够明显提高健康相关物种的丰度，改善疾病状态下的动物肠道菌群变化。综合大鼠舌苔与肠道菌群的变化发现，脑缺血再灌注(I/R)损伤后会导致大鼠舌苔和肠道菌群的紊乱，AR113的口腔应用可以不仅可以调节舌苔菌群结构组成，还能促进大鼠的肠道微生物平衡。
实施例4：植物乳杆菌AR113对I/R大鼠神经功能评分的影响
行为学实验分两次测定，参照表5的Longa评分标准进行神经功能缺损评分。第一次为造模后次日，目的是鉴定造模是否成功(1-3 分入组)并剔除造模失败的大鼠。在造模7天后再次测定四组大鼠神经功能缺陷程度，评分采用双盲法，三人独立测定，结果取平均值。
表5 Longa评分标准
Figure RE-GDA0002513270780000141
图10是本发明的实施例4中AR113对I/R大鼠神经功能评分的影响示意图，图10(a)为造模后24hAR113对I/R大鼠神经功能评分的影响示意图，图10(b)为造模后7dAR113对I/R大鼠神经功能评分的影响示意图。
行为学检测是评价脑缺血损伤神经功能障碍的常用手段，按照 Longa评分标准，测定各组大鼠神经功能缺陷结果。造模后24h时间点显示，如图10(a)所示，模型组大鼠神经功能评分较假手术组明显升高(P<0.001)，说明MCAO诱导的I/R大鼠模型造模成功，而造模前连续一周的AR113给药没有明显改善I/R大鼠的神经功能缺陷。造模后7天时间点显示，连续14天AR113的口腔干预能减轻I/R 大鼠的神经功能缺陷，具有统计学意义(P<0.05)，提示AR113的干预对I/R大鼠的神经功能缺陷具有一定的改善作用，如图10(b) 所示。
实施例5：植物乳杆菌AR113对I/R大鼠认知障碍的影响
水迷宫实验是用于评估大鼠学习与记忆能力的常用工具之一。水迷宫试验设置直径为1.6m的圆形水池，可移动圆形平台的直径为10 cm，水池中水位高度高出圆形平台3cm，整个圆形水池按顺时针方向分为4个象限，可移动圆形平台置于第1个象限。平台搜索实验持续4天，第1天，将大鼠投入没有平台的水池中，使其自由游行2min 来适应水环境。自第2天起，每天进行一次平台搜索实验，将圆形平台放在第一象限固定位置进行训练，先将大鼠置于平台上30s，使其知道有平台可以逃生，然后将大鼠头朝池壁，从第1象限开始，依次投入水中让其进行平台搜索实验，自大鼠入水算起，每次搜索持续 90s，如果在90s内大鼠找到平台，则该时间为大鼠在该象限进行平台搜索的潜伏期，如果90s内大鼠没有找到平台，则将其引导至平台，休息30s后重新置于水中让其寻找平台，直至在90s内找到平台为止，时间记为潜伏期。每个象限的平台搜索结束后，将大鼠置于平台休息30s后再开始下一个象限的实验。四个象限所记潜伏期的平均值为当天该只大鼠的潜伏期。该期间，大鼠正常饲养。
图11是本发明的实施例5中水迷宫实验移动轨迹示意图，图11 (a)为假手术组的水迷宫实验移动轨迹示意图，图11(b)I/R组的水迷宫实验移动轨迹示意图，图11(c)AR113干预组的水迷宫实验移动轨迹示意图。
水迷宫实验结果显示，同Sham组相比，I/R损伤大鼠逃避潜伏期时间明显增长，一定时间内穿越平台次数减少，AR113干预组能够改善大鼠的认知功能障碍，缩短逃避潜伏期，增加平台穿越次数，见表6。如图11所示，运动模式显示了不同组大鼠所遵循的运动轨迹，图中清晰地表明，I/R组大鼠总是沿着墙游泳，用了更多的时间去搜索平台，相反，AR113组大鼠能更快地定位平台，表现明显优于I/R 组大鼠。本研究表明L.plantarumAR113的口腔干预能够改善大鼠脑缺血再灌注后的记忆损伤。
表6各组大鼠学习记忆能力比较
Figure RE-GDA0002513270780000161
注：*P<0.05vs Sham group；#P<0.05vs I/R group。
实施例6：植物乳杆菌AR113对I/R大鼠脑梗死体积的影响
图12是本发明的实施例6中AR113对I/R大鼠脑梗死体积的影响图，图12(a)是各组脑组织TTC染色代表性图片，图12(b) 是各组大鼠脑梗死体积比，其中***P<0.001 vs Shamgroup；#P<0.05 vs I/R group。
TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)可溶于水，但被正常组织细胞线粒体内的脱氢酶还原后会形成深红色的脂溶性光敏感成分，其染色效果与线粒体脱氢酶的活性有密切关系。因此，采用TTC染色，正常组织被染成深红色，而缺血坏死组织因为脱氢酶活性丧失，TTC不能被还原，故不被染色，呈苍白色，如图12(a)所示。TTC染色结果表明，假手术组未见异常，脑组织均被染成鲜艳的深红色，但I/R 组可见明显梗死灶，与假手术组相比，脑梗死体积百分比显著增加(P<0.001)，而AR113的口腔干预能显著降低I/R大鼠的脑梗死体积(P<0.05)，表明L.plantarum AR113对I/R模型导致的大鼠脑梗死体积降低具有一定的积极作用，如图12(b)所示。
实施例7：I/R大鼠脑组织细胞形态学改变
图13是本发明的实施例7中脑组织HE染色(×200)示意图，图13(a)为假手术组的脑组织HE染色示意图，图13(b)为I/R组的脑组织HE染色示意图，图13(c)AR113组的脑组织HE染色示意图。
脑缺血再灌注后神经细胞不可逆损伤是造成学习记忆障碍的主要原因，对各组大鼠脑组织进行HE染色，结果如图13所示。假手术组大鼠镜下神经元细胞组织结构清晰，胞质均质染色，如图13(a) 所示，I/R组大鼠神经元细胞损伤严重，炎性细胞浸润，大量红细胞溢出，组织水肿，细胞间质颜色变浅，表选出明显的病理学改变，如图13(b)所示，AR113干预组细胞形态较为完整，少量炎性细胞浸润，如图13(c)所示。与模型组相比，AR113的干预能明显改善脑缺血再灌注引起的神经细胞损伤，维护脑组织完整性。
实施例8：植物乳杆菌AR113对I/R大鼠脑细胞氧化应激的影响
图14是本发明的实施例8中AR113对I/R大鼠脑组织中SOD、 GSH-Px、CAT酶活性、MDA以及H2O2水平的影响示意图，其中*P<0.05,***P<0.001vs Sham group；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs I/R group。
图15是本发明的实施例8中AR113对I/R大鼠脑组织抗氧化相关因子的调节作用示意图。
对I/R大鼠脑组织进行抗氧化酶活性及氧化产物检测，结果如图 14所示。I/R大鼠脑组织中SOD、GSH-Px及CAT活性较假手术组均显著降低(P<0.05；P<0.001)，而氧化产物MDA和H2O2水平明显升高(P<0.05；P<0.001)；与I/R组相比，AR113作用后，SOD、 GSH-Px及CAT活性均明显升高同时降低了氧化产物的表达(MDA， P<0.05；H2O2，P<0.001)。对大鼠脑组织提取RNA进行qPCR检测抗氧化相关因子mRNA相对表达量，结果表明AR113的干预能不同程度地提高Nrf-ARE通路相关基因的mRNA水平，抗氧化酶基因表达水平与活性变化趋势基本一致，如图15所示，表明L.plantarum AR113可以通过激活Nrf2信号通路，调节下游关键抗氧化酶的基因表达，提高I/R大鼠脑组织抗氧化酶活性，减轻缺血再灌注导致的氧化应激损伤，增强机体抗氧化能力。
实施例9：植物乳杆菌AR113对I/R大鼠脑细胞凋亡的影响
图16是本发明的实施例9中AR113对I/R大鼠脑细胞凋亡的影响示意图，图16(a)是细胞凋亡相关因子mRNA水平示意图，图 16(b)是脑组织的TUNEL染色结果示意图(×200)，其中**P<0.01, ***P<0.001vs Sham group；#P<0.05,##P<0.01vs I/R group。
继发性神经细胞凋亡可能是引起脑缺血再灌注损伤的重要病理基础，也是脑缺血再灌注损伤的主要体现，凋亡是缺血半暗带区域细胞损伤主要方式，如果采取合理措施，该部分机体损伤是可以避免的。 TUNEL染色是检测细胞凋亡的一种方法，细胞凋亡时，基因组DNA 断裂，暴露的3'-OH在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的dUTP，从而通过荧光显微镜观察。对I/R大鼠脑组织进行TUNEL 染色，观察神经细胞凋亡情况(阳性细胞呈绿色荧光)，结果如图 16(a)所示，与假手术组相比，I/R组大鼠脑组织神经细胞凋亡数量明显增多，而AR113组较I/R组凋亡细胞状况明显有所改善。
线粒体呼吸链变化是当前细胞凋亡研究的主要方向，细胞色素C (cytochromeCyt-C)是呼吸链中的一种基本成分，也是线粒体调控细胞凋亡的启动因子。Cyt-C从线粒体释放到胞质后激活Caspase，引发级联反应，从而导致细胞凋亡。Bcl-2蛋白家族可以调控Cyt-C 的释放，促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2通过调节线粒体膜通道来调控Cyt-C的释放。通过qPCR实验检测凋亡相关基因的mRNA 相对表达量，结果如图16b所示，I/R大鼠脑组织细胞促凋亡相关因子Cyt、Caspase-3和Bax的mRNA水平均较假手术组上调，其中Cyt、Bax mRNA水平的升高差异具有统计学意义(P<0.001；P<0.01)，而抑制细胞凋亡因子Bcl-2的mRNA水平在I/R组中显著降低 (P<0.01)，表明MCAO诱导的I/R模型会引起大鼠脑细胞凋亡而加重细胞损伤。与模型组相比，AR113的干预会明显下调促凋亡因子 (Cyt、Caspase-3和Bax)的mRNA水平(P<0.01；P<0.05；P<0.01)，上调抑凋亡因子Bcl-2的mRNA表达(P<0.05)。本结果表明AR113 干预能够抑制脑缺血再灌注引起的细胞凋亡，从而起到对其损伤的保护作用。
实施例的作用与效果
根据实施例1至实施例9可知，采用脑中动脉栓塞法(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)建立大鼠局灶性脑缺血模型，于缺血2h后再灌注制备I/R模型来探究口腔应用益生菌对脑缺血再灌注损伤大鼠是否有保护作用及其可能机制，从而获得有效数据，为益生菌用于脑卒中的干预治疗提供理论基础。
此外，由上述实施例可知，使用植物乳杆菌AR113干预脑缺血再灌注(I/R)模型大鼠口腔，能够明显调节I/R大鼠舌苔菌群失衡和改善其脑损伤程度，并对其肠道菌群具有调节作用。此外，AR113 作用后可以显著改善I/R大鼠神经功能缺陷，提高学习记忆能力。本发明表明AR113通过提高脑组织的抗氧化酶活性，降低氧化产物水平，激活Nrf-ARE信号通路，调节抗氧化因子Nrf2、NQO-1、HO-1 的相对表达量，同时下调促凋亡因子Cyt-C、Caspase-3和Bax的mRNA 表达，上调抑凋亡因子Bcl-2的相对表达，进而改善由于脑缺血再灌注引起的脑细胞损伤。
综上，本发明的植物乳杆菌AR113应用于I/R大鼠口腔内对其舌苔和肠道菌群均有调节作用，并对神经功能缺陷及脑损伤具有一定的保护作用，其主要原因是由于AR113具有优良的抗氧化和抗凋亡活性，AR113口腔应用后，能够调节I/R损伤导致的舌苔菌群失调，并能够维持其肠道菌群的稳态。同时AR113能够减轻I/R损伤导致的神经功能缺陷和脑细胞氧化应激损伤并对细胞凋亡有一定的改善作用。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种对脑卒中具有保护作用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR113菌株，其特征在于：所述植物乳杆菌AR113菌株已在2017年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13909。
2.利用权利要求1所述的植物乳杆菌AR113菌株制备对脑卒中具有保护作用的制品中的应用。
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