KR100606649B1 - 항산화 효과를 갖는 발효유 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항산화 효과를 갖는 발효유 제조방법에 관한 것으로서, 하이드록시 라디칼 소거작용과 금속이온 흡착능이 높은 Lactobacillus.casei KCTC 3260을 사용하고, 로즈마리 추출물을 첨가함으로서 항산화 효과를 높인 건강지향형 항산화 발효유를 얻을 수 있도록 하기위한 것이다.
항산화, 발효유, 유산균, 활성산소, 균주, 로즈마리
Description
도 1은 로즈마리 추출물 첨가량에 따른 발효유의 항산화 효과를 비교한 그래프.
도 2는 배양시간별 유산균수의 변화 그래프.
본 발명은 각종 질병의 원인으로 알려진 활성산소를 소거함으로써 지질과산화 억제 작용을 갖는 Lactobacillus. casei KCTC 3260을 이용한 항산화 발효유 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 산소는 각종 물리적, 화학적 및 환경적 요인에 의하여 다양한 활성산소로 전환된다. 인체는 항산화 방어벽에 문제가 생겨 활성산소가 축적될 경우 산화적 스트레스가 야기되며, 세포 구성성분에 손상을 주어 노화는 물론 뇌졸중 등 각종 질병을 초래하게 된다.
항산화제에 대한 연구는 1969년 McCord와 Fridovich가 superoxide radical을 소거하는 효소인 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD;Super Oxide Dismutase)를 발견한 것을 계기로 생체 내 활성산소의 발생, in vivo에서 독성 및 방어.소거 메커니즘 등에 관하여 관심을 갖게 되면서 본격적으로 시작되었다. 주로 식품첨가물로서의 항산화제 개발을 위한 연구에서 최근에는 활성산소가 각종 질병 및 노화 등에 직접적인 원인으로 작용한다는 사실이 밝혀지면서 노화억제 및 질병치료제로서의 항산화제를 찾으려는 연구로 전환되고 있다.
지금까지 개발되어 사용되고 있는 항산화제로는 tert-butylhydroxytoluene(BHT), tert-butylhydroxyanisol(BHA) 등과 같은 합성 항산화제, α-tocopherol, vitamin C, carotenoids, flavonoids, 탄닌 등과 같은 일부 천연항산화제 및 SOD와 같은 항산화효소이다. 그런데 이들 항산화제는 독성, 저활성 및 용도의 한계성 등으로 인하여 사용에 제한을 받고 있다. 따라서 보다 안전하고 강한 항산화제를 천연물 또는 미생물 대사산물로부터 얻고자하는 연구가 활발하게 진행 중에 있다. 항산화제의 대상은 지질과산화 생성 억제물질에서 생체 내에서 산화적 피해의 직접적인 원인이 되는 free radical 및 활성산소 생성 자체를 억제하는 예방적 항산화물질로 확산되고 있으며, SOD와 같은 고분자물질과 합성항산화제에서 실용성이 크고 안전한 저분자 천연항산화제로 연구의 방향이 전환되고 있다. 또한 산화적 손상 및 이로부터 유발되는 갖가지 질병으로부터 생물을 보호하기 위한 방어기구로서 천연항산화물질들의 규명과 항산화 방어 메커니즘 및 이들 항산화제들의 유전자발현 및 세포조절에 대하여 연구가 진행되고 있다.
국내에서의 천연으로부터 항산화제 탐색은 1992년부터 시작되어 미생물 대사산물 등 다양한 새로운 항산화물질에 대한 연구가 본격적으로 시작되었다. 현재 항염증제, 뇌신경세포보호제, 피부노화방지제 및 식품첨가물의 개발을 목적으로 연구가 이루어지고 있다.
Hydroperoxide는 지질산화의 1차 산물로서 독성이 강하고 DNA를 손상시킬 수 있다. 또한 Malondialdehyde는 지질산화의 2차 산물로서 반응성이 크며 단백질과 DNA 같은 생체분자 손상의 원인으로 활성산소에 의한 지질과산화를 방지하기 위해서는 활성산소를 소거하는 것이 가장 효과적이다.
유산균은 세포내 산화적 스트레스를 줄이기 위하여 효소적 그리고 비효소적 항산화방어벽이 존재하여 다양한 메커니즘으로 활성산소를 제거한다. Lactobacillus sp. SBT 2028은 체내 활성산소 축적을 감소시켜 주며(Kaizu et. al., 1993), Ahotupa 등(1996)은 lactobacillus GG가 in vitro에서 지질산화를 억제하였다고 보고하였으며, 비피도박테리아(Bifidobacteria). longum, Lactobacillus. acidophilus는 28～48%의 지질과산화 억제 효과를 나타내었다(Lin and Chang, 2000). 오스까 세이야꾸 가부시키가이샤 등은 Lactobacillus. plantarum ATCC14431로 발효시킨 catalase 활성을 갖는 항산화 발효물을 제조하였다(KR 10-1995-0700078).
상기의 특허는 주로 균주 배양물의 SOD나 catalase 활성에 대한 결과로서 균주자체의 항산화 효과나 직접적인 활성산소 소거 활성에 대한 결과는 나타나 있지 않다.
이에 본 발명에서는 이 문제를 감안하여 균주 자체가 지질과산화 억제를 통한 높은 항산화 작용을 나타낼 수 있는 항산화발효유 제조 방법을 제공토록 하는데 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 hydroxy radical 소거능과 ferrous ion 제거능이 높은 항산화 유산균 락토바실러스(이하, "Lactobacillus"라 표기함). casei KCTC 3260을 사용하여 발효유를 제조하고 또한 발효유의 항산화 효과를 높이기 위하여 허브 추출물로서 특히 로즈마리 추출물을 첨가한다.
<항산화 효과 측정>
먼저, 다음의 방법으로 유산균의 항산화 효과를 측정하였으며 이를 표 1에 나타내었다.
유산균을 MRS 배지에 혐기자(anaerobic jar)를 사용하여 혐기적 조건에서 37℃, 48시간 배양한 후 원심분리(8,000rpm, 20분)하여 균체를 모은다. 이 균체를 0.1M phosphate buffer(pH 7.0)에 2회 세척 후 109cfu/㎖이 되도록 하였다.
본 발명에서는 지질로서 linoleic acid를 사용하여 항산화 효과를 측정하였다(M. Y. Lin and F. J. Chang, 2000, Digestive Disease and Science 45(8):1617-1622). Linoleic acid(Sigma, 99%) 0.1㎖과 tween 20 0.2㎖, 증류수 19.7㎖을 혼합하여 linoleic acid emulsion을 만든다. 0.02M phosphate buffer(pH 7.0) 0.5㎖과 linoleic acid emulsion 1㎖ 그리고 0.01% FeSO4 0.2㎖, 0.56mM H2O2 0.2㎖과 유산균(cell) 0.4㎖을 혼합하여 37℃ water bath에서 6시간 배양한다. 배양액 2㎖을 취하여 4% TCA 용액 0.2㎖, 0.8% TBA 용액 2㎖, 0.4% BHT 0.2㎖과 혼합하고 100℃에서 30분간 가열 후 빠르게 냉각한다. Butanol 2㎖을 가하여 추출하고 상층액을 532㎚에서 측정하여 다음의 식으로 항산화 효과(지질과산화억제)를 나타낸다.
항산화 효과(%)=[1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도] × 100
| 균 주 | 항산화 효과(%) |
| Lactobacillus.brevis KCTC 3498 | - |
| Lactobacillus. casei KCTC 3109 | 5.34 |
| Lactobacillus. casei KCTC 3260 | 36.91 |
| Lactobacillus. acidophilus LA100 | 18.36 |
각 균주의 항산화 효과를 측정한 결과 상기 [표 1]에서와 같이 Lactobacillus. casei KCTC 3260의 항산화 효과는 36.91%이었다.
<Hydroxy radical 및 ferrous ion 소거능 측정>
또한 항산화 효과가 높은 유산균의 항산화 메커니즘을 구명하기 위하여 ferrous ion 소거능(Amanati dou 등, 2001, FMES Microbiology Letters, 203(11):87-94)과 hydroxy radical 소거능(Kullisaar 등, 2002, Int. J. Food Microbiol. 72(3):215-224)을 측정하였다(표 2).
유산균의 항산화 효과는 주로 SOD나 세포내 Mn농도에 대하여 다루어져 왔으나 SOD가 온도에 민감하여 열에 의하여 활성이 소실되며 인체내에서 약한 활성을 나타내기 때문에 최근에는 hydroxy radical을 제거할 수 있는 열에 안정한 비효소적 항산화물질에 대한 관심이 증가하고 있다. Hydroxy radical은 가장 반응력이 강한 활성산소로 인체에 가장 큰 손실을 주는 라디칼로 알려져 있다. superoxide radical 보다 반응성이 커 매우 빠르게 세포구성성분인 당, 아미노산, 인지질, DNA 염기 그리고 유기산과 반응하여 세포의 성질, 효소작용 그리고 유전적 안전성을 잃게 된다. 또한 metal ion은 지질과산화를 개시할 수 있고 free radical을 생성하는데 ferrous ion이 가장 반응성이 크다. 유산균 내 chelator는 metal ion을 포집하 여 산화 촉진을 억제하는 것으로 알려져 있다.
항산화 효과가 높은 Lactobacillus. casei KCTC 3260은 hydroxy radical 소거능이 70.51%, ferrous ion 흡착능은 42.72%로서 다른 균주에 비해 높았으며 본 특허에서 사용한 균주에서는 SOD 활성이 측정되지 않았다. 따라서 Lactobacillus. casei KCTC 3260이 나타내는 항산화 작용은 주로 hydroxy radical소거와 ferrous ion 흡착작용에 의한 것으로 생각된다.
| 균 주 | Hydroxy radical 소거능(%) | Ferrous ion 흡착능(%) |
| Lactobacillus.brevis KCTC 3498 | - | - |
| Lactobacillus.casei KCTC 3109 | - | - |
| Lactobacillus.casei KCTC 3260 | 70.51 | 42.72 |
| Lactobacillus.acidophilus LA100 | 56.62 | 34.13 |
이하에서 항산화 발효유를 제조하기 위한 방법을 상세하게 설명하고자 한다.
각각의 유산균을 12% skim milk에 2회 계대 배양한 후 106~7cfu/㎖의 농도로 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후 항산화 효과를 측정하였다(표 3). Lactobacillus. casei KCTC 3260으로 배양한 발효유의 항산화 효과는 79.98%로서 대조구의 37.33% 보다 2.14배 증가하였고 9.9×108 cfu/㎖의 균수를 포함하였다.
| 발효유 | 항산화효과(5) | PH |
| 대조군 | 37.33 | |
| Lactobacillus.casei KCTC 3260 | 79.98 | 5.0 |
| Lactobacillus.casei KCTC 3109 | - | 6.0 |
| Lactobacillus.brevis KCTC 3498 | - | 6.3 |
| Lactobacillus.casei 01 | 63.71 | 4.3 |
| Lactobacillus.acidophilus LA100 | 55.77 | 4.4 |
허브는 치료효과로서 맛과 향기 그리고 색채를 지닌 향신료로서 가치를 지니는 식물을 의미하며 카테친, 비타민 C, 및 다양한 미량원소 등과 같은 항산화 성분을 다수 함유하기 때문에 높은 첨가 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
허브 추출물은 분쇄한 허브 20g에 50% 에탄올 500㎖을 첨가하여 50℃에서 18시간 추출 후 여과 및 건조하여 제조하였다.
허브 추출물 첨가 발효유 제조는 다음과 같이 실시하였다. 12% 탈지유에 0.001~0.5%(v/w) 허브 추출물을 첨가하고 105℃에서 20분간 살균하였다. 살균된 탈지유를 냉각시킨 후 Lactobacillus. casei KCTC 3260를 107 cfu/ml 농도로 접종하여 pH 4～5가 될때까지 배양 후 항산화 효과를 측정하였다(표 4). 항산화 효과가 높은 허브 추출물을 첨가한 발효유의 항산화 효과가 대조구에 비하여 증가하였으며 특히 로즈마리 추출물 첨가구에서 항산화 효과가 높았다. 허브 중 특히 로즈마리는 라디칼 제거능이 높은 것으로 보고된 바 있다(Dorman 등, 2003, Food Chemistry 83:255-262).
| 허 브 | 허브 추출물의 항산화 효과(%) | 0.5% 허브 추출물 첨가 발효유의 항산화 효과(%) | PH |
| 대조구 | - | 75.82 | 4.88 |
| 로즈마리 (Rosmarinus offinalis) | 81.55 | 91.0 | 5.11 |
| 타임 (Thymus vulgaris) | 80.09 | 88.82 | 5.23 |
| 레몬밤 (Melissa officinalis) | 68.37 | 83.28 | 5.0 |
| 세인트존스워트 (Hypericum perforatum) | 69.1 | 76.55 | 5.05 |
| 라벤다 (Lavandula angustifolia) | 46.74 | 75.91 | 5.08 |
항산화 발효유를 제조하기 위하여 첨가되는 로즈마리 추출물의 적정 첨가량을 정하기 위하여 0.001~0.5% 까지 로즈마리 추출물을 첨가하여 발효유를 제조하고 항산화 효과를 측정하였다. 0.05% 이상 첨가구에서는 항산화 효과가 증가하지 않았으므로 탈지유에 대하여 0.05%의 로즈마리 추출물을 첨가하는 것이 바람직하며, 항산화 효과는 91.87% 이었다(그림 1).
또한 첨가하는 로즈마리 추출물 첨가가 유산균의 성장에 미치는 영향을 측정하기 위하여 0.5%의 로즈마리추출물을 첨가 후 72시간까지 배양하면서 6시간 간격으로 유산균수를 측정하였다. 그 결과 로즈마리 첨가가 유산균의 성장에 저해를 주지 않았으며 30시간 배양 이상에서 대조구는 유산균수가 저하된 반면 로즈마리 첨가구에서는 유산균수가 저하되지 않았다(그림 2).
이상에서 살펴본 바와같은 본 발명에 의해 제조된 건강지향형 발효유는, Lactobacillus.casei KCTC 3260을 사용하고 로즈마리 추출물을 첨가하여 배양함으로서 91.87%의 높은 항산화 효과를 나타낼 수 있게됨을 알 수 있다.
Claims (4)
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- 허브로서 로즈마리 추출물을 첨가하고 Lactobacillus.casei KCTC 3260으로 발효시킨 것을 특징으로 하는 항산화 발효유 제조방법.
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