CN111601896A - 含异硫氰酸酯的十字花科产物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由十字花科(Brassicaceae)材料生产含异硫氰酸酯的产物的方法和用于该方法的乳酸菌。本发明还涉及通过这样的方法由十字花科材料生产的含异硫氰酸酯的产物。

Description

含异硫氰酸酯的十字花科产物及其制备方法
技术领域
本发明涉及由十字花科材料生产含异硫氰酸酯的产物的方法和用于该方法的乳酸菌。本发明还涉及通过这样的方法由十字花科(Brassicaceae)材料生产的含异硫氰酸酯的产物。
背景技术
十字花科家族成员富含芥子油苷，其可通过黑芥子酶转化为异硫氰酸酯，其已被注意到对一些类型的癌症具有有益作用(Moktari等人，2017；Capuano等人，2017；Kim和Park等人，2016)。例如，已经发现萝卜硫素在患有2型糖尿病的肥胖患者中减少肝脏葡萄糖产生并改善葡萄糖控制(Axelsson等人，2017)。然而，许多十字花科家族成员在收获后是高度易腐的，如果产物储存不好，营养的质量和数量迅速下降。
十字花科植物经常被处理以增加可以导致营养损失的贮存期。延长贮存期的主要方法有热处理、冷冻、气调储存和添加化学防腐剂，这些方法也会引起化学成分的不希望的变化。
这些方法可导致芥子油苷的损失或降低黑芥子酶将芥子油苷转化成异硫氰酸酯的能力。例如，常规的西兰花处理/保存涉及在冷冻前烫漂以使质量降解酶(如脂氧化酶)失活。过氧化物酶失活通常用作烫漂的充分性的指示。使过氧化物酶失活的条件导致黑芥子酶失活，因此所得产物没有异硫氰酸酯(Dosz和Jeffery，2013)。
因此，仍然需要生产包括植物营养物(如异硫氰酸酯)的十字花科产物的改进方法。
发明内容
本发明人已经开发了由十字花科材料制备含异硫氰酸酯的产物的方法。
在一个方面，本发明提供了由十字花科材料制备含异硫氰酸酯的产物的方法，其包括：
i)对十字花科材料进行预处理以提高黑芥子酶对芥子油苷的接近性；
ii)用乳酸菌发酵由步骤i)获得的材料以形成含异硫氰酸酯的产物。
在一个实施方案中，预处理包括以下中的一种或多种：
i)加热；
ii)浸渍；
iii)微波处理；
iv)暴露于高频声波(超声)；或
v)脉冲电场处理
其中在预处理期间十字花科材料的温度不超过约75℃。
在一个实施方案中，预处理降低了表皮特异硫蛋白(ESP)活性，同时维持内源黑芥子酶活性。
在一个实施方案中，预处理包括加热和浸渍十字花科材料，并且其中在预处理期间十字花科材料的温度不超过约75℃。在一个实施方案中，加热发生在浸渍之前或其中加热和浸渍同时发生。在一个实施方案中，预处理包括将十字花科材料加热至约50℃至约70℃的温度，然后浸渍。在一个实施方案中，十字花科材料被浸渍，使得该十字花科材料的至少约80％具有约2mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中加热。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约10倍的异硫氰酸酯。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约12倍的异硫氰酸酯。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约14倍的异硫氰酸酯。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约16倍的异硫氰酸酯。
在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约2倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。
在一个实施方案中，乳酸菌分离自西兰花和/或乳酸菌缺乏黑芥子酶活性。
在一个方面，本发明提供了由十字花科材料制备含异硫氰酸酯的产物的方法，其包括：
i)对十字花科材料进行预处理以提高黑芥子酶对芥子油苷的接近性；和
ii)酸化由步骤i)获得的材料，形成含异硫氰酸酯的产物。
在一个方面，本发明提供了由西兰花材料制备含异硫氰酸酯的产物的方法，所述方法包括用乳酸菌肠膜明串珠菌和/或植物乳杆菌发酵所述材料以形成含异硫氰酸酯的产物，其中所述方法任选地包括预处理所述西兰花材料以提高黑芥子酶对芥子油苷的接近性。
在一个方面，本发明提供了由十字花科材料制备含异硫氰酸酯的产物的方法，所述方法包括用从西兰花中分离的乳酸菌肠膜明串珠菌和/或植物乳杆菌发酵所述材料以形成含异硫氰酸酯的产物，其中所述方法任选地包括预处理十字花科材料以提高黑芥子酶对芥子油苷的接近性。
在一个方面，本发明提供了分离的乳酸菌菌株，其选自：
i)2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1；和
ii)2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2。
在一个方面，本发明提供了分离的乳酸菌菌株，其选自：
i)2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1；
ii)2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2；
iii)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
iv)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
v)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
vi)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
vii)2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
在一个方面，本发明提供了一种用于生产含异硫氰酸酯的产物或包括乳酸菌的益生菌的起子培养物，所述乳酸菌选自以下中的一种或多种或全部：
i)2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1；
ii)2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2；
iii)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
iv)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
v)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
vi)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
vii)2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
在一个实施方案中，起子培养物包括浓度至少约108cfu/mL的乳酸菌。
在一个方面，本发明提供了一种益生菌组合物，其包括选自以下中的一种或多种或全部的乳酸菌：
i)2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1；
ii)2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2；
iii)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
iv)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
v)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
vi)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
vii)2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
在一个方面，本发明提供了通过本文所述的方法获得的含异硫氰酸酯的产物。
在一个方面，本发明提供了通过本文所述的方法可获得的含异硫氰酸酯的产物。
在一个方面，本发明提供了一种含异硫氰酸酯的十字花科产物，其包括比所述浸渍的十字花科材料多至少约10倍的异硫氰酸酯。
在一个方面，本发明提供了一种含异硫氰酸酯的十字花科产物，其包括比浸渍的十字花科材料多约10倍至约16倍的异硫氰酸酯。
在一个方面，本发明提供了一种含异硫氰酸酯的十字花科产物，基于可提取的芥子油苷含量，其包括至少约2倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。
在一个方面，本发明提供了一种含异硫氰酸酯的十字花科产物，基于可提取的芥子油苷含量，其包括约2倍至约4倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。
在一个方面，本发明提供了一种含异硫氰酸酯的十字花科产物，其包括至少150mg/kg dw的异硫氰酸酯。
在一个实施方案中，本发明提供了含异硫氰酸酯的产物，其包括至少150mg/kgdw、至少200mg/kg dw、至少300mg/kg dw、至少400mg/kg dw，或至少450mg/kg dw，或至少500mg/kg dw，或至少550mg/kg dw，或至少600mg/kg dw，或至少650mg/kg dw，或至少700mg/kg dw，或至少1000mg/kg dw，或至少2000mg/kg dw，或至少3000mg/kg dw，或至少4000mg/kg dw，或至少5000mg/kg dw，或至少6000mg/kg dw，或至少7000mg/kg的萝卜硫素。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括肠膜明串珠菌和/或植物乳杆菌。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物具有一种或多种或全部以下特征：
i)当储存在约4℃至约25℃下时，稳定至少4周，或至少8周，或至少12周；
ii)当储存在约4℃至约25℃下时，耐受酵母、霉菌和/或大肠菌生长至少4周，或至少8周，或至少12周；和
iii)包括至少107CFU/g肠膜明串珠菌和/或植物乳杆菌。
除非另外具体说明，否则本文中的任何实施方案应做必要的变更以应用于任何其它实施方案。例如，如本领域技术人员将理解的，以上对于本发明的方法概述的乳酸菌的示例同样适用于本发明的产物。
本发明不限于这里描述的具体实施方案的范围，这些实施方案仅用于示例的目的。如本文所述，功能等同的产物、组合物和方法显然在本发明的范围内。
在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，提及单个步骤、物质组成、步骤组或物质组成组应被认为包括一个和多个(即一个或多个)那些步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。
以下通过以下非限制性实施例并参考附图描述本发明。
附图说明
图1.A)显示了萝卜硫苷水解为萝卜硫素和萝卜硫腈的途径。B)显示了浸渍和发酵对西兰花泥中萝卜硫素含量(mg/kg，DW)的影响。C)显示了发酵对西兰花泥储存期间乳酸菌计数(logCFU/gm)的影响。
图2.A)显示了发酵对4℃和25℃(RT)储存的西兰花泥中萝卜硫素稳定性的影响。B)热处理条件对西兰花基质中萝卜硫苷转化为萝卜硫素的影响。
图3.A)分别显示了在25℃和4℃原料西兰花的总酚含量(mg GAE/100g DW)及其在发酵和储存过程中的变化。B)分别显示了在25℃和4℃原料西兰花的ORAC(氧自由基吸收能力)抗氧化能力(μmol TE/g DW)及其在发酵和储存过程中的变化。
图4.显示了对于乳酸菌菌株的不同组合达到4.4或以下的pH所花费的发酵时间。
图5.A)显示了在具有密封袋的西兰花的不同热处理条件下的萝卜硫素产率(μmol/kg DW)。B)显示了在直接浸入水中的西兰花的不同热处理条件下的萝卜硫素产率(μmol/kg DW)。
图6.显示了浸渍、预加热和发酵以及仅仅浸渍和预加热和浸渍，预加热和化学酸化的组合效果对加工后以及在4℃和25℃储存期间的萝卜硫素产率(μmol/kg DW)的比较效果。将样品在密封包装中于65℃预处理3分钟。
图7.显示了发酵和储存对萝卜硫苷含量的影响。与原始样品相比，在25℃和4℃储存的发酵样品中的萝卜硫苷含量降低。
图8.PLS-DA得分图显示了原料西兰花泥和发酵西兰花泥的多酚代谢物谱的差异。
图9.区分PLS-DA鉴别的发酵和非发酵样品的重要特征。右侧的方框表示各组中各代谢物的相对浓度。
图10.基于非靶向LC-MS分析，显示了乳酸发酵对西兰花泥代谢物谱的影响。这表明发酵释放结合的植物化学品例如多酚糖苷和芥子油苷并且增强它们的生物可接受性。
图11.基于非靶向LC-MS分析，显示了指示在发酵后具有显著(p＜0.05)倍数变化的代谢物的火山图。具有显著倍数变化的前50种代谢物及其个别倍数变化列于表8中。
图12.基于非靶向LC-MS分析，显示了乳酸发酵对西兰花多酚的影响。在绿原酸(2.4-15.8μg/mg)中观察到6.6倍的变化，在芥子酸中观察到23.8倍的增加(3.6-86.6μg/mg，在山奈酚中观察到10.5倍的增加(12.7-134.6μg/mg)和在对香豆酸中观察到0.48倍的减少。
图13.显示了用脉冲场凝胶电泳获得的BF1和BF2基因组DNA的SmaI和NotI限制性酶切。
具体实施方式
一般技术和定义
除非另外具体定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应被认为具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义(例如，酶、发酵、接种等)。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为“X和Y”或“X或Y”，并应被视为对两种含义或其中一种含义提供明确支持。
在整个说明书中，单词“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises或comprising)”将被理解为暗示包括所述元件、整体或步骤，或一组元件、整体或步骤，但不排除任何其他元件、整体或步骤，或一组元件、整体或步骤。
如本文所用，除非另有相反说明，术语“约”是指指定值的+/-10％、更优选+/-5％、甚至更优选+/-1％。
“等位基因”是指细胞、个体植物或群体内的遗传序列(例如基因)的一种特定形式，特定形式在同一基因序列内至少一个(通常多于一个)变体位点的序列上不同于同一基因的其他形式。在不同等位基因之间不同的这些变体位点处的序列称为“变异”、“多态性”或“突变”。
十字花科
本领域技术人员将理解，本文所述的方法适用于由任何包括芥子油苷的十字花科材料生产含异硫氰酸酯的产物。如本文所用，“十字花科”是指家族十字花科(FamilyBrassicaceae)的成员，通常称为芥菜(mustard)、十字花科(cruicifer)或卷心菜科(cabbage)。本领域技术人员将理解材料可以来自多于一种十字花科(Brassicaceae)。
在一个实施方案中，十字花科选自芸苔属(genus Brassica)或碎米荠属(Cardamine)。在一个实施方式中，所述芸苔属选自：巴利阿里芸苔(Brassica balearica)、伊索比亚芥(Brassica carinata)、长芥(Brassica elongate)、地中海包心菜(Brassicafruticulosa)、芥菜(Brassica hilarionis)、印度芥菜(Brassicajuncea)、欧洲油菜(Brassica napus)、黑芥菜(Brassica nigra)、甘蓝(Brassica oleracea)、小松菜(Brassica perviridis)、芜菁(Brassica rapa)、褐芥(Brassica rupestris)、芥菜(Brassica septiceps)和亚洲芥(Brassica tournefortii)。
在一个实施方案中，芸苔属(Brassica)是甘蓝(Brassica oleracea)。
在一个实施方案中，所述芸苔属选自：甘蓝变种甘蓝(野生卷心菜)(Brassicaoleracea variety oleracea(wild cabbage))、甘蓝变种头状花序(卷心菜)(Brassicaoleracea variety capitate(cabbage))、青菜(小白菜)(Brassica rapasubsp.chinensis(bok choy))、白菜(娃娃菜)(Brassica rapa subsp.pekinensis(napacabbage))、芜菁甘兰(洋蔓菁)(Brassica napobrassica(rutabaga))、芜菁(蔓菁)(Brassica rapa var.rapa(tumip))、芥蓝(芥兰)(Brassica oleracea varietyalboglabra(kai-lan))、绿甘蓝(羽衣甘蓝)(Brassica oleracea variety viridis(collard greens))、高茎甘蓝(饲用甘蓝)(Brassica oleracea variety longata(jerseycabbage))、观赏羽衣甘蓝(观赏甘蓝)(Brassica oleracea variety acephala(ornamental kale))、皱叶甘蓝(羽衣甘蓝)(Brassica oleracea variety sabellica(kale))、泽西羽衣甘蓝(恐龙羽衣甘蓝)(Brassica oleracea variety palmifolia(lacinato kale))、甘蓝(永续甘蓝)(Brassica oleracea variety ramose(perpetualkale))、髓茎甘蓝(髓甘蓝)(Brassica oleracea variety medullosa(marrow cabbage))、葡萄牙甘蓝(Brassica oleracea variety costata(tronchuda kale))、抱子甘蓝(孢子甘蓝)(Brassica oleracea variety gemmifera(btrussels sprout))、球茎甘蓝(苤蓝)(Brassica oleracea variety gongylodes(kohlrabi))、花茎甘蓝(西兰花)(Brassicaoleracea variety italica(broccoli))、花椰菜(菜花、罗马花椰菜、青花菜)(Brassicaoleracea variety botrytis(cauliflower，Romanesco broccoli，broccoli ditorbole))、甘蓝(球花甘蓝)(Brassica oleracea variety botrytis x italica(broccoflower))，和甘蓝(小西兰花)(Brassica oleracea variety italica×alboglabra(Broccolini))。
在一个实施方案中，芸苔属是甘蓝，意大利品种(西兰花)。
在一个实施方案中，十字花科植物选自：碎米荠(野荠菜)(Cardamine hirsuta(bittercress))、白蜀葵(屈曲花)(Iberis sempervirens(candytuft))、新疆野生油菜(田芥菜)(Sinapis arvensis(charlock))、辣根(马萝卜)(Armoracia rusticana(horseradish))、凯尔盖朗甘蓝(凯尔盖朗卷心菜)(Pringlea antiscorbutica(Kerguelencabbage))、遏蓝菜(菥蓂)(Thlaspi arvense(pennycress))、萝卜(莱菔)(Raphanusraphanistrum subsp.sativus(radish))、芸芥(芝麻菜)(Eruca sativa(rocket))、含生草(回生草)(Anastatica hierochuntica(rose of Jericho))、海甘蓝(海芥兰)(Crambemaritima(sea kale))、滨海卡克勒(海芥属)(Cakile maritima(sea rocket))、荠(荠菜)(Capsella bursa-pastoris(shepherd′s purse))、香雪球(sweet alyssum)、阿拉伯芥(拟南芥)(Arabidopsis thaliana(thale cress))、豆瓣菜(水田芥)(Nasmrtium officinale(watercress))、白芥(白芥菜)(Sinapis alba(white mustard))、西鲱花(瘭疽草)(Erophila vema(whitlow grass))、野芥菜(野莱菔)(Raphanus raphanistrum(wildradish))、欧洲菘蓝(菘蓝)(Isatis tinctoria(woad))，和西洋菜(蔊菜)(Nasturtiummicrophyllum(yellow cress))。
在一个实施方案中，十字花科具有高水平的一种或多种芥子油苷。在一个实施方案中，十字花科已经被选择性地繁殖以具有高水平的一种或多种芥子油苷。在一个实施方案中，在相应的十字花科中，“高水平”的芥子油苷可以包括比Verkerk等(2009)的表2中所示更高水平的芥子油苷。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于3400μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于4000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于5000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于8000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于10,000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于12,000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于15,000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于18,000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于20,000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于25,000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，高水平的芥子油苷是高于30,000μmol/kg干重的芥子油苷水平。在一个实施方案中，十字花科已经被基因修饰或经受生物或非生物胁迫以具有高水平的一种或多种芥子油苷。本领域技术人员将理解十字花科可通过本领域技术人员已知的任何方法修饰。
在一个实施方案中，芥子油苷是萝卜硫苷(4-甲基亚硫酰基丁基)。在一个实施方案中，芥子油苷是芸苔葡糖硫苷(3-吲哚基甲基)。
如本文所用，“十字花科材料”是指十字花科的任何部分，其包括芥子油苷，包括但不限于叶、茎、花、小花、种子和根或其混合物。
本领域技术人员将理解，本文所述的方法适用于不同体积的十字花科材料，例如但不限于至少30kg，或至少50kg，或至少80kg，或至少100kg，或至少1,000kg，或至少2,000kg，或至少5,000kg，或至少8,000kg，或至少10,000kg，或至少15,000kg，或至少20,000kg。
在一个实施方案中，十字花科材料已被洗涤。如本文所用，“洗涤”去除可见的土壤和污染物。在一个实施方案中，十字花科材料已被消毒。如本文所用，“消毒”是指减少十字花科材料上的病原体。
在一个实施方案中，十字花科植物与其他植物材料混合。在一个实施方案中，其它植物材料是蔬菜或水果材料。在一个实施方案中，所述蔬菜是胡萝卜或甜菜。
芥子油苷
如本文所用，“芥子油苷”是指至少在十字花科家族中发现的次级代谢物，其共享由β-D-吡喃葡萄糖残基组成的化学结构，所述β-D-吡喃葡萄糖残基经由硫原子连接至(Z)-N-羟肟酸硫酸酯，和如Halkier等人(2006)所述的衍生自氨基酸的可变R基团。芥子油苷的实例在Halkier等人(2006)和Agerbirk等人(2012)中提供。芥子油苷的水解可以产生异硫氰酸酯、腈、环硫腈、硫氰酸盐和恶唑烷-2-硫酮(图1A)。许多芥子油苷在植物对病虫害的防御机制中起作用。
芥子油苷储存在十字花科的储存部位。如本文所用，“储存位点”是十字花科中存在芥子油苷并且不存在黑芥子酶的位点。
如本文所用，“黑芥子酶(myrosinase)”也称为“硫葡糖苷酶(thioglucosidase)”，“黑芥子甙酶(sinigrase)”或“葡糖硫苷酶(sinigrinase)”是指参与植物防御机制的可裂解硫连接的葡萄糖的酶家族(EC 3.2.1.147)。黑芥子酶催化芥子油苷的水解，导致异硫氰酸酯的产生。黑芥子酶有时作为黑芥子颗粒储存在被称为黑芥子细胞的特定异形细胞的液泡中，但也已经在蛋白质体或液泡中报道，以及作为倾向于与膜结合的细胞质酶储存。因此，在一个实施方案中，黑芥子酶储存在十字花科的黑芥子细胞中。
在一个实施方案中，如在此描述的预处理改善了黑芥子酶至芥子油苷的接近性。如本文所用，“改善接近性”或“接近性被改善”是指增加芥子油苷对黑芥子酶的可用性以允许产生异硫氰酸酯。在一个实施方案中，通过从芥子油苷储存位点释放芥子油苷来改善接近性。在一个实施方案中，芥子油苷储存位点被机械破裂(即通过浸渍)或酶促降解。在一个实施方案中，通过一种或多种多糖降解酶(例如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和/或糖苷酶)的活性从芥子油苷储存位点释放芥子油苷。在一个实施方案中，通过允许黑芥子酶进入芥子油苷储存位点来改善接近性。在一个实施方案中，通过从黑芥子细胞中释放黑芥子酶来改善接近性。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约10％至约90％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约20％至约80％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约30％至约70％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约40％至约60％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约45％至约55％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约10％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约20％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约30％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约40％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约50％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约60％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约70％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约80％的芥子油苷。在一个实施方案中，从芥子油苷储存位点释放约90％的芥子油苷。
在一个实施方案中，十字花科材料包括选自脂族、吲哚或芳族芥子油苷的一种或多种芥子油苷。
在一个实施方案中，该脂肪族芥子油苷选自以下中的一种或多种：萝卜硫苷(glucoraphanin)(4-甲基亚硫酰基丁基或4-甲基亚硫酰基丁烯基硫代葡萄糖苷(glucorafanin))、黑芥子甙(sinigrin)(2-丙烯基)、葡萄糖芫蓄芥素(gluconapin)(3-丁烯基)、芸苔葡萄糖苷(glucobrassicanapin)(4-戊烯基)、前告伊春(progoitrin)(2(R)-2-羟基-3-丁烯基)、表原告依春(epiprogoitrin)(2(S)-2-羟基-3-丁烯基)、2-羟基-4-戊烯基硫苷(gluconapo1eiferin)(2-羟基-4-戊烯基)、glucoibervirin(3-甲基硫代丙基)、芝麻菜苷(glucoerucin)(4-甲硫基丁基)、4-甲硫基-3-丁烯基硫苷(dehydroerucin)(4-甲硫基-3-丁烯基)、屈曲花苷(glucoiberin)(3-甲基亚硫酰基丙基)、萝卜苷(glucoraphenin)(4-甲基亚硫酰基-3-丁烯基)、葡萄糖庭荠素(glucoalyssin)(5-甲基亚硫酰基戊烯基)，和葡萄糖糖芥苷(glucoerysolin)(3-甲基磺酰基丁基，4-巯基丁基)。
在一个实施方案中，吲哚芥子油苷选自以下中的一种或多种：芸苔葡糖硫苷(3-吲哚基甲基)、4-羟基芸苔葡糖硫苷(4-羟基-3-吲哚基甲基)、4-甲氧基芸苔葡糖硫苷(4-羟基-3-吲哚基甲基)和新芸苔葡糖硫苷(1-甲氧基-3-吲哚基甲基)。
在一个实施方案中，吲哚芥子油苷以下中的一种或多种：金莲葡糖硫苷(苄基)和豆瓣菜苷(2-苯基乙基)。
在一个实施方案中，十字花科材料包含一种或多种芥子油苷，其选自苄基芥子油苷、烯丙基芥子油苷和4-甲基亚硫酰基丁基。在一个实施方案中，芥子油苷是萝卜硫苷(4-甲基亚硫酰基丁基)。在一个实施方案中，芥子油苷是芸苔葡糖硫苷(3-吲哚基甲基)。
在一个实施方案中，与预处理之前十字花科材料的可提取的芥子油苷含量相比，如本文所述的预处理增加了可提取的芥子油苷含量。
如本文所用，“可提取的芥子油苷含量”是指十字花科材料中可接近的用于转化成异硫氰酸酯的芥子油苷的水平。排除向腈和其它化合物的转化，从1摩尔芥子油苷异硫氰酸酯的预期最大产率是1摩尔异硫氰酸酯(1摩尔芥子油苷可以最大地转化为1摩尔异硫氰酸酯、1摩尔葡萄糖和1摩尔硫酸根离子)。因此，在一个实施例中，商品西兰花栽培品种的可提取的萝卜硫苷含量为3400μmol萝卜硫苷/kg dw，并且商品西兰花栽培品种的萝卜硫素的预期最大产率为3400μmol萝卜硫素/kg dw。
异硫氰酸酯
如本文所用，“异硫氰酸酯”是指具有通用结构R-N＝C＝S的含硫植物化学品，其为黑芥子酶对芥子油苷及其生物活性衍生物的活性的产物。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是萝卜硫素(1-异硫氰基-4-甲基亚硫酰基丁烷)。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是异硫氰酸酯(3-异硫氰基-1-丙烯)。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是异硫氰酸苄酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是异硫氰酸苯乙酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是3-丁烯基异硫氰酸酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是5-乙烯基-1，3-恶唑烷-2-硫酮。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是3-(甲硫基)丙基异硫氰酸酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是3-(甲基亚硫酰基)-丙基异硫氰酸酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是4-(甲硫基)-丁基异硫氰酸酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是1-甲氧基吲哚-3-甲醇异硫氰酸酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是2-苯基乙基异硫氰酸酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是iberin。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物还包括一种或多种异硫氰酸酯生物活性衍生物或其低聚物。在一个实施方案中，异硫氰酸酯生物活性衍生物是本文所述的任何异硫氰酸酯的衍生物。在一个实施方案中，异硫氰酸酯生物活性衍生物是萝卜硫素的衍生物。在一个实施方案中，异硫氰酸酯生物活性衍生物是iberin。在一个实施方案中，异硫氰酸酯生物活性衍生物是异硫氰酸烯丙酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯生物活性衍生物是吲哚-3-甲醇。在一个实施方案中，异硫氰酸酯生物活性衍生物是甲氧基-吲哚-3-甲醇。在一个实施方案中，异硫氰酸酯生物活性衍生物是抗坏血酸原。在一个实施方案中，异硫氰酸酯生物活性衍生物是新抗坏血酸原。
预处理
如本文所用，“预处理(pre-treatment)”或“预处理(pre-treating)”释放或帮助芥子油苷从芥子油苷储存位点释放和/或允许黑芥子酶进入十字花科材料中的芥子油苷储存位点。在一个实施方案中，预处理增加了芥子油苷对黑芥子酶的暴露，从而允许黑芥子酶将芥子油苷转化成异硫氰酸酯。
在一个实施方案中，预处理在维持内源黑芥子酶活性的同时减少了表皮特异硫蛋白(ESP)。如本文所用，“表皮特异硫蛋白”或“ESP”是指指导黑芥子酶活性产生腈并且远离异硫氰酸酯产生的蛋白质。降低或抑制ESP产生(mRNA或蛋白质)或活性可以增加异硫氰酸酯的产生。
如本文所用，“降低表皮特异硫蛋白”是指减少ESP的蛋白产生或活性。在一个实施方案中，降低ESP包括在高温下使ESP失活(例如变性)。在一个实施方案中，ESP在约50℃至约80℃的温度下变性。
如本文所用，“保持内源黑芥子酶活性”意指与未处理对照相比不显著降低黑芥子酶活性。在一个实施方案中，内源黑芥子酶活性没有降低约5％或以上。在一个实施方案中，内源黑芥子酶活性没有降低约10％或以上。在一个实施方案中，内源黑芥子酶活性没有降低约15％或以上。在一个实施方案中，内源黑芥子酶活性没有降低约20％或以上。在一个实施方案中，内源黑芥子酶活性没有降低约30％或以上。在一个实施方案中，内源黑芥子酶活性没有降低约40％或以上。在一个实施方案中，内源黑芥子酶活性没有降低约50％或以上。
在一个实施方案中，预处理包括以下中的一种或多种：i)加热；ii)浸渍；iii)微波处理；iv)暴露于高频声波(超声)，或v)脉冲电场处理，其中在预处理期间十字花科材料的温度不超过约75℃。
在一个实施方案中，十字花科材料在基于燃料的加热系统、基于电的加热系统(即烘箱或欧姆加热)、射频加热、高压热处理或基于蒸汽的加热系统(间接或直接施加蒸汽)中加热。在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中(例如在蒸煮袋中)加热。在一个实施方案中，十字花科材料在烘箱、水浴、生物反应器、炉子、水烫漂机或蒸汽烫漂机中加热。在一个实施方案中，十字花科材料经由高压热加热来加热。在一个实施方案中，十字花科材料经由欧姆加热。在一个实施方案中，十字花科材料经由射频加热。在一个实施方案中，十字花科材料在水中烫漂。在一个实施方案中，十字花科材料经由高压热处理来加热。在一个实施方案中，将十字花科材料放置在用于高压热处理的密封包装中。
在一个实施方案中，预处理包括将十字花科材料加热至约50℃至约70℃。在一个实施方案中，预处理包括将十字花科材料加热至约50℃至约65℃。在一个实施方案中，预处理包括将十字花科材料加热至约50℃至约60℃。在一个实施方案中，加热包括将十字花科材料加热至约55℃至约70℃。在一个实施方案中，加热包括将十字花科材料加热至约60℃至约70℃。在一个实施方案中，加热包括将十字花科材料加热至约65℃至约70℃。在一个实施方案中，将十字花科材料加热约30秒。在一个实施方案中，将十字花科材料加热约1分钟。在一个实施方案中，将十字花科材料加热约2分钟。在一个实施方案中，将十字花科材料加热约3分钟。在一个实施方案中，将十字花科材料加热约4分钟。在一个实施方案中，将十字花科材料加热约5分钟。
在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中在约60℃下加热约1分钟。在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中在约60℃下加热约2分钟。在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中在约60℃下加热约3分钟。在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中在约65℃下加热约4分钟。在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中在约65℃下加热约1分钟。在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中在约65℃下加热约2分钟。在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中在约65℃下加热约3分钟。在一个实施方案中，十字花科材料在密封包装中在约65℃下加热约4分钟。
在一个实施方案中，十字花科材料在约60℃下在水中加热约1分钟。在一个实施方案中，十字花科材料在约60℃下在水中加热约2分钟。
在一个实施方案中，加热包括汽蒸十字花科材料。在一个实施方案中，预处理包括汽蒸十字花科材料。在一个实施方案中，将十字花科材料汽蒸至约50℃至约70℃的温度。在一个实施方案中，将十字花科材料汽蒸至约60℃至约70℃的温度。在一个实施方案中，将十字花科材料汽蒸至少约30秒。在一个实施方案中，将十字花科材料汽蒸至少约1分钟。在一个实施方案中，将十字花科材料汽蒸至少约2分钟。在一个实施方案中，将十字花科材料汽蒸至少约3分钟。在一个实施方案中，将十字花科材料汽蒸至少约4分钟。在一个实施方案中，将十字花科材料汽蒸至少约5分钟。
在一个实施方案中，预处理包括浸渍十字花科材料。如本文所用，“浸渍(macerating)”、“浸渍(macerated)”、“浸渍(macerate)”是指将十字花科材料破碎成较小的碎片。在一个实施方案中，浸渍包括分解十字花科材料的至少约30％至约90％的细胞以允许黑芥子酶接近其底物芥子油苷。在一个实施方案中，浸渍包括分解十字花科材料的至少约40％至约90％的细胞。在一个实施方案中，浸渍包括分解十字花科材料的至少约50％至约90％的细胞。在一个实施方案中，浸渍包括分解十字花科材料的至少约60％至约90％的细胞。在一个实施方案中，浸渍包括分解十字花科材料的至少约70％至约90％的细胞。本领域技术人员将理解的是，分解细胞包括破坏细胞壁和破碎细胞内细胞器的区室化。
在一个实施方案中，用搅拌机、研磨机或粉碎机将十字花科材料浸渍。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的至少约80％具有约2mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的至少约80％具有约1mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的至少约80％具有约0.5mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的至少约80％具有约0.25mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的至少约80％具有约0.1mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的至少约80％具有约0.05mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的至少约80％具有约0.025mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的至少约80％具有约0.01mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的约50％至约90％具有约2mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的约60％至约80％具有约2mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的约50％至约90％具有约1mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，将十字花科材料浸渍，使得十字花科材料的约60％至约80％具有约1mm或以下的尺寸。在一个实施方案中，在浸渍期间将十字花科材料加热至约50℃至约70℃的温度。在一个实施方案中，在浸渍期间将十字花科材料加热至约55℃至约70℃的温度。在一个实施方案中，在浸渍期间将十字花科材料加热至约60℃至约70℃的温度。在一个实施方案中，在浸渍期间将十字花科材料加热至约65℃至约70℃的温度。
在一个实施方案中，预处理包括加热和浸渍十字花科材料。在一个实施方案中，预处理产生泥。如本文所用，“泥”是指与奶油糊或液体稠度混合的十字花科材料。
本领域技术人员将理解，“微波(microwave)”或“微波处理(microwaving)”通过使微波辐射通过物质来加热物质(例如十字花科材料)。在一个实施方案中，预处理包括微波处理十字花科材料。在一个实施方案中，十字花科材料在消费者微波或工业微波中预处理。在一个实施方案中，工业微波是连续微波系统，例如但不限于MIP 11工业微波连续蒸煮(铁氧体微波技术)。在一个实施方案中，预处理包括微波处理十字花科材料。在一个实施方案中，将十字花科材料在约0.9至约2.45GHz微波处理。在一个实施方案中，将十字花科材料微波处理至少约30秒，或至少约1分钟，或至少约2分钟，或至少3分钟。
在一个实施方案中，预处理包括将十字花科材料暴露于低至中频超声波。在一个实施方案中，预处理包括将十字花科材料暴露于热超声(具有约30℃至约60℃的热的低至中频超声波)。在一个实施方案中，用工业规模的超声处理器产生超声波。在一个实施方案中，超声处理器是连续或分批超声处理器。在一个实施方案中，超声处理器例如但不限于UIP500hd或UIP4000(Hielscher，Ultrasonictechnology)。在一个实施方案中，超声波的频率为约20kHz至约600kHz。在一个实施方案中，将十字花科材料暴露于声波至少约30秒，或至少约1分钟，或至少约2分钟，或至少约3分钟，或约5分钟。
在一个实施方案中，预处理包括将十字花科植物材料暴露于脉冲电场处理。脉冲电场处理是包括施加短的高压脉冲的非热处理技术。脉冲诱导对十字花科植物材料细胞的电穿孔促进黑芥子酶对芥子油苷的接近性。在一个实施方案中，脉冲电场处理将十字花科材料加热至约40℃至约70℃的温度。在一个实施方案中，脉冲电场处理将十字花科材料加热至约50℃至约70℃的温度。在一个实施方案中，脉冲电场处理将十字花科材料加热至约60℃至约70℃的温度。在一个实施方案中，脉冲电场处理包括用约20至约80kV的电压脉冲处理十字花科植物材料。在一个实施方案中，预处理将约10％至约90％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约20％至约80％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约30％至约70％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约40％至约60％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约10％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约20％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约30％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约40％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约50％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约60％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约70％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约80％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。在一个实施方案中，预处理将约90％的芥子油苷转化成异硫氰酸酯。
发酵
本领域技术人员将理解，本文所述的发酵方法可以包括使用任何乳酸菌。如本文所用，“发酵”是指十字花科材料被乳酸菌生物化学分解。在一个实施方案中，使用添加外源乳酸菌进行与乳酸菌的发酵。如在此使用的，“乳酸菌(lactic bacteria)”或“乳酸菌(lactic acid bacteria)”是产生乳酸作为碳水化合物发酵的最终产物的细菌，并且可以包括但不限于包括来自以下的细菌：乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、乳球菌属、链球菌属、气球菌属、肉食杆菌属、肠球菌属、酒球菌属、芽孢乳杆菌属、四联球菌属、漫游球菌属和魏斯氏菌属。在一个实施方案中，乳酸菌包括黑芥子酶活性。在一个实施方案中，乳酸菌来自明串珠菌属。在一个实施方案中，乳酸菌来自乳杆菌属。
在一个实施方案中，乳酸菌选自以下中的一种或多种：植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌、短乳杆菌、乳酸乳球菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌。
在一个实施方案中，乳酸菌分离自十字花科。在一个实施方案中，乳酸菌分离自甘蓝。在一个实施方案中，乳酸菌分离自西兰花。在一个实施方案中，乳酸菌分离自西兰花叶。在一个实施方案中，乳酸菌分离自西兰花茎。在一个实施方案中，乳酸菌分离自西兰花泥。在一个实施方案中，乳酸菌分离自澳大利亚西兰花。
在一个实施方案中，乳酸菌缺乏黑芥子酶活性。
在一个实施方案中，乳酸菌是乳杆菌属。
在一个实施方案中，乳酸菌选自：i)肠膜明串珠菌；ii)植物乳杆菌；iii)戊糖乳杆菌；iv)鼠李糖乳杆菌；v)i)和ii)的组合；vi)i)、ii)和iii)的组合；和vii)i)、ii)和iv)的组合。
在一个实施方案中，乳酸菌是肠膜明串珠菌。在一个实施方案中，肠膜明串珠菌是ATCC8293。在一个实施方案中，肠膜明串珠菌是BF1和/或BF2。在一个实施方案中，肠膜明串珠菌缺乏黑芥子酶活性。
在一个实施方案中，乳酸菌是植物乳杆菌。在一个实施方案中，植物乳杆菌缺乏黑芥子酶活性。
在一个实施方案中，大约50％的乳酸菌是肠膜明串珠菌，并且大约50％的乳酸菌是乳杆菌属。
在一个实施方案中，大约50％的乳酸菌是肠膜明串珠菌，并且大约50％的乳酸菌是植物乳杆菌。
在一个实施方案中，植物乳杆菌选自B1、B2、B3、B4和B5中的一种或多种或全部。在一个实施方案中，植物乳杆菌是B1。在一个实施方案中，植物乳杆菌是B2。在一个实施方案中，植物乳杆菌是B3。在一个实施方案中，植物乳杆菌是B4。在一个实施方案中，植物乳杆菌是B5。
在一个实施方案中，在选自BF1、BF2、B1、B2、B3、B4和B5的至少2种，或至少3种，或至少4种，或至少5种，或至少6种乳酸菌菌株存在下发生发酵。
在一个实施方案中，乳酸菌是经修饰以与缺乏该修饰的对照细菌相比产生高水平的黑芥子酶活性的重组细菌。本领域技术人员将理解重组乳酸菌是通过本领域技术人员已知的任何技术生产的。
在一个实施方案中，乳酸菌受到应激，例如但不限于热应激、冷应激、亚致死超声波(例如约20至约2000MHz)、高压、动态高压或脉冲电场，以与未受到应激的对照乳酸菌相比增加黑芥子酶活性和多糖降解酶的活性。在一个实施方案中，热应激包括将细菌加热至大于约40℃至约75℃。在一个实施方案中，热应激包括将细菌加热至大于约45℃至约65℃。在一个实施方案中，热应激包括将细菌加热至大于约45℃至约55℃。在一个实施方案中，冷应激包括将细菌降低至约0℃至约8℃的温度。在一个实施方案中，冷应激包括将细菌降低至约2℃至约6℃的温度。在一个实施方案中，冷应激包括将细菌降低至约4℃的温度。
在一个实施方案中，用至少约105CFU/g本文所述的乳酸菌接种十字花科材料。在一个实施方案中，用至少约106CFU/g本文所述的乳酸菌接种十字花科材料。在一个实施方案中，用至少约107CFU/g本文所述的乳酸菌接种十字花科材料。在一个实施方案中，用至少约108CFU/g本文所述的乳酸菌接种十字花科材料。在一个实施方案中，十字花科材料已经被预处理。
在一个实施方案中，发酵在约20℃至约34℃下进行。在一个实施方案中，发酵在约22℃至约34℃下进行。在一个实施方案中，发酵在约24℃至约34℃下进行。在一个实施方案中，发酵在约24℃至约30℃下进行。在一个实施方案中，发酵在约34℃至约34℃下进行。在一个实施方案中，发酵在约25℃下进行。在一个实施方案中，发酵在约30℃下进行。在一个实施方案中，发酵在约34℃下进行。
在一个实施方案中，发酵进行约8小时至约17天。在一个实施方案中，发酵进行约8小时至约14天。在一个实施方案中，发酵进行约8小时至约7天。在一个实施方案中，发酵进行约8小时至约5天。在一个实施方案中，发酵进行约8小时至约4天。在一个实施方案中，发酵进行约8小时至约3天。在一个实施方案中，发酵进行约8小时至约30小时。在一个实施方案中，发酵进行约8至约24小时。在一个实施方案中，发酵进行约10小时至约24小时。在一个实施方案中，发酵进行约10天。在一个实施方案中，发酵进行约9天。在一个实施方案中，发酵进行约8天。在一个实施方案中，发酵进行约7天。在一个实施方案中，发酵进行约4天。在一个实施方案中，发酵进行约6天。在一个实施方案中，发酵进行约5天。在一个实施方案中，发酵进行约72小时。在一个实施方案中，发酵进行约60小时。在一个实施方案中，发酵进行约45小时。在一个实施方案中，发酵进行约30小时。在一个实施方案中，发酵进行约24小时。在一个实施方案中，发酵进行约20小时。在一个实施方案中，发酵进行约18小时。在一个实施方案中，发酵进行约15小时。在一个实施方案中，发酵进行约16小时。在一个实施方案中，发酵进行约14小时。在一个实施方案中，发酵进行约12小时。在一个实施方案中，发酵进行约10小时。在一个实施方案中，发酵进行约8小时。在一个实施方案中，搅拌发酵培养物。在一个实施方案中，搅拌是间歇的。在一个实施方案中，搅拌是连续的。在一个特别优选的实施方案中，发酵在间歇搅拌下进行15小时。在一个特别优选的实施方案中，发酵在间歇搅拌下进行24小时。
在一个实施方案中，当组合物达到约4.5至约3.8的pH时，发酵反应完成。在一个实施方案中，当组合物达到约4.5至约3.6的pH时，发酵反应完成。在一个实施方案中，当组合物达到约4.5至约4.04的pH时，发酵反应完成。在一个实施方案中，当组合物达到约4.3至约4.04的pH时，发酵反应完成。在一个实施方案中，当组合物达到4.5或以下，或4.4或以下，或4.3或以下，或4.04或以下，或3.8或以下的pH时，发酵反应完成。在一个实施方案中，当组合物达到4.5或以下的pH时，发酵反应完成。在一个实施方案中，当组合物达到4.4或以下的pH时，发酵反应完成。
在一个实施方案中，如果存在，发酵减少以下中的一种或多种或全部的数目：大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌和李斯特菌。在一个实施方案中，如果存在，发酵降低以下一种或多种或全部的CFU/g：大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌和李斯特菌。
在一个实施方案中，在发酵培养物中不添加盐。
在一个实施方案中，与预处理的十字花科材料中的可提取的芥子油苷含量相比，发酵增加了可提取的芥子油苷含量。在一个实施方案中，与十字花科材料中可提取的芥子油苷含量相比，发酵增加了可提取的芥子油苷含量。在一个实施方案中，与十字花科材料中可提取的芥子油苷含量相比，发酵增加可提取的芥子油苷含量增加约100％至约500％。在一个实施方案中，与十字花科材料中可提取的芥子油苷含量相比，发酵使可提取的芥子油苷含量增加约200％至约450％。在一个实施方案中，与十字花科材料中可提取的芥子油苷含量相比，发酵使可提取的芥子油苷含量增加约250％至约450％。在一个实施方案中，与十字花科材料中可提取的芥子油苷含量相比，发酵使可提取的芥子油苷含量增加约300％至约400％。在一个实施方案中，与十字花科材料中可提取的芥子油苷含量相比，发酵使可提取的芥子油苷含量增加约300％。在一个实施方案中，与十字花科材料中可提取的芥子油苷含量相比，发酵使可提取的芥子油苷含量增加约400％。在一个实施方案中，所述芥子油苷是萝卜硫苷。
酸化
经过预处理的物料可经过酸化处理，提高了产物的微生物安全性和稳定性(对微生物降解的敏感性)，并且提高了产物中异硫氰酸酯的稳定性。酸化可以通过加入有机酸来实现，有机酸例如但不限于乳酸、乙酸、抗坏血酸和柠檬酸。在实施方案中，通过加入葡糖酸-δ-内酯可以实现酸化。在一个实施方案中，酸化包括将pH降低至约4.4至约3.4的pH。在一个实施方案中，酸化包括将pH降低至4.5，或4.4，或4.2，或4，或3.8，或3.6，或3.4或以下的pH。在一个实施方案中，酸化包括将pH降低至4.4或以下的pH。
来自十字花科的含异硫氰酸酯的产物
如本文所述的来自十字花科的含异硫氰酸酯的产物可通过如本文所述的方法产生。本领域技术人员将理解，使用本文所述的方法生产的含异硫氰酸酯的产物比十字花科材料或仅经受发酵的十字花科材料(没有如本文所述的预处理)含有更高水平的异硫氰酸酯，例如萝卜硫素。例如，来自商业西兰花栽培品种的浸渍的西兰花具有～800μmol/Kg dw(～149.8mg/Kg dw)的萝卜硫素浓度，发酵的浸渍的西兰花具有～1600μmol/Kg dw(～278.8mg/Kg dw)的萝卜硫素浓度，并且使用本文所述的方法生产的预处理的和发酵的西兰花具有～13100μmol/Kg dw(～2318.7mg/Kg d)的萝卜硫素浓度。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约4倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约6倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约8倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约10倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约12倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约14倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约16倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约17倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多约4倍至约17倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多约4倍至约16倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多约8倍至约16倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多约10倍至约16倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多约12倍至约16倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多约14倍至约16倍的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，异硫氰酸酯是萝卜硫素。
在一个实施方案中，存在于含异硫氰酸酯的产物中的异硫氰酸酯的水平高于从十字花科材料的可提取的芥子油苷含量所预期的水平。在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约1倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约2倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约3倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约3.8倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约4倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括约1倍至约4倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括约1倍至约3.8倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括约2倍至约3.8倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的芥子油苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括约2倍至约3倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。
在一个实施方案中，存在于含异硫氰酸酯的产物中的萝卜硫素的水平高于从十字花科材料的可提取的萝卜硫苷含量所预期的水平。在一个实施方案中，基于可提取的萝卜硫苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约1倍于萝卜硫素的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的萝卜硫苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约2倍于萝卜硫素的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的萝卜硫苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约3倍于萝卜硫素的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的萝卜硫苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约3.8倍于萝卜硫素的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的萝卜硫苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括至少约4倍于萝卜硫素的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的萝卜硫苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括约1倍至约4倍于萝卜硫素的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的萝卜硫苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括约1倍至约3.8倍于萝卜硫素的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的萝卜硫苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括约1倍至约3倍于萝卜硫素的预期最大产率。在一个实施方案中，基于可提取的萝卜硫苷含量，含异硫氰酸酯的产物包括约2倍至约3倍于萝卜硫素的预期最大产率。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约100mg/kg dw至约7000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约500mg/kg dw至约7000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约1000mg/kg dw至约7000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约1600mg/kgdw至约4000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约1600mg/kgdw至约3000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约2000mg/kg dw至约4000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约2000mg/kg dw至约7000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约3000mg/kg dw异硫氰酸酯至约7000mg/kg dw异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约2300mg/kg dw的异硫氰酸酯。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约100mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约200mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约250mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约300mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约350mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约400mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约450mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约500mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约550mg/kgdw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约600mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约650mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约700mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约1000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约2000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约3000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约4000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约5000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约6000mg/kg dw的异硫氰酸酯。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约7000mg/kg dw的异硫氰酸酯。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约100mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约150mg/kg的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约200mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约250mg/kg的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约300mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约350mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约400mg/kgdw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约450mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约500mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约550mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约600mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约650mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约700mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约1000mg/kg的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约2000mg/kgdw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约3000mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约4000mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约5000mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约6000mg/kg dw的萝卜硫素。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约7000mg/kg dw的萝卜硫素。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料多至少约5％的总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料多至少约10％的总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料多至少约15％的总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料多至少约20％的总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料多至少约4％的蛋白质。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料多至少约6％的蛋白质。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料多至少约8％的蛋白质。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料多至少约10％的蛋白质。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料少至少约10％的碳水化合物。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料少至少约20％的碳水化合物。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料少至少约30％的碳水化合物。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料少至少约40％的碳水化合物。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料少至少约45％的碳水化合物。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料少至少约48％的碳水化合物。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括比十字花科材料少约10％至约48％的碳水化合物。
在一个实施方案中，与十字花科材料相比，含异硫氰酸酯的产物包括增加水平的多酚糖苷。在一个实施方案中，多酚糖苷为花青素糖苷。在一个实施方案中，多酚糖苷为酚酸糖苷。在一个实施方案中，多酚糖苷为酚酸。
在一个实施方案中，与十字花科材料相比，含异硫氰酸酯的产物包括增加水平的芥子油苷。在一个实施方案中，芥子油苷是萝卜硫苷。在一个实施方案中，萝卜硫苷增加至少约25倍。在一个实施方案中，芥子油苷是芸苔葡糖硫苷。在一个实施方案中，芸苔葡糖硫苷增加26倍。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括吲哚-3-甲醇。在一个实施方案中，与浸渍的十字花科材料相比，在含异硫氰酸酯的产物中吲哚-3-甲醇增加至少约2倍。在一个实施方案中，与浸渍的十字花科材料相比，在含异硫氰酸酯的产物中吲哚-3-甲醇增加至少约3倍。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括抗坏血酸原。在一个实施方案中，与浸渍的十字花科材料相比，含异硫氰酸酯的产物中的抗坏血酸原增加至少约2倍。在一个实施方案中，与浸渍的十字花科材料相比，含异硫氰酸酯的产物中的抗坏血酸原增加至少约3倍。
在一个实施方案中，与十字花科材料相比，含异硫氰酸酯的产物包括增加水平的以下中的一种或多种：阿魏酸、丁香酸、苯基乳酸、绿原酸芦丁、芥子酸、丁香酸甲酯、橙皮素、槲皮素和山奈酚。在一个实施方案中，与十字花科材料相比，含异硫氰酸酯的产物包括增加水平的绿原酸。在一个实施方案中，绿原酸增加约6.6倍。在一个实施方案中，与十字花科材料相比，含异硫氰酸酯的产物包括增加水平的芥子酸。在一个实施方案中，芥子酸增加约23.8倍。在一个实施方案中，与十字花科材料相比，含异硫氰酸酯的产物包括增加水平的山奈酚。在一个实施方案中，山奈酚增加约10.5倍。
在一个实施方案中，与十字花科材料相比，含异硫氰酸酯的产物包括降低水平的以下中的一种或多种：原儿茶酸、没食子酸、4，羟基苯甲酸、香草酸、2，3二羟基苯甲酸、对香豆酸、肉桂酸、儿茶酸、迷迭香酸、咖啡酸。
在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约40％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约50％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约60％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约70％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约80％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约90％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约95％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约97％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约98％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约99％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约100％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约40％至约100％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的产物中转化为异硫氰酸酯。在一个实施方案中，十字花科材料中存在的约40％至约80％的芥子油苷在含异硫氰酸酯的十字花科产物中转化为异硫氰酸酯。
在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃下时，含异硫氰酸酯的产物中的异硫氰酸酯稳定至少1周，或至少2周，或至少3周，或至少4周，或至少6周，或至少8周，或至少10周，或至少12周，或至少14周。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃下时，含异硫氰酸酯的产物中的异硫氰酸酯稳定至少4周。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃下时，含异硫氰酸酯的产物中的异硫氰酸酯稳定至少8周。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃下时，含异硫氰酸酯的产物中的异硫氰酸酯稳定至少12周。
如本文所用，“稳定”是指当储存在4℃下六周时异硫氰酸酯浓度不降低或仅轻微降低。在一个实施方案中，轻微降低是指异硫氰酸酯浓度降低约1％至约30％。在一个实施方案中，轻微降低是指异硫氰酸酯浓度降低约5％或以下。在一个实施方案中，轻微降低是指异硫氰酸酯浓度降低约10％或以下。在一个实施方案中，轻微降低是指异硫氰酸酯浓度降低约15％或以下。在一个实施方案中，轻微降低是指异硫氰酸酯浓度降低约20％或以下。在一个实施方案中，轻微降低是指异硫氰酸酯浓度降低约30％或以下。可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行异硫氰酸酯分析，例如实施例1所示的萝卜硫素。
在一个实施方案中，异硫氰酸酯是萝卜硫素。
在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃下时，含异硫氰酸酯的产物耐受酵母、霉菌和/或大肠菌生长至少1周，或至少2周，或至少3周，或至少4周，或至少6周，或至少8周，或至少10周，或至少12周，或至少14周。
在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃下时，含异硫氰酸酯的产物耐受酵母、霉菌和/或大肠菌生长至少4周。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃下时，含异硫氰酸酯的产物耐受酵母、霉菌和/或大肠菌生长至少8周。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃下时，含异硫氰酸酯的产物耐受酵母、霉菌和/或大肠菌生长至少12周。
如本文所用，“耐受”酵母、霉菌和/或大肠菌生长意指使用实施例1中所述的方法在以上所列的时间段之后在样品中可检测到＜1 Log CFU/g的酵母、霉菌和/或大肠菌。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约20g/100gdw至约32g/100gdw总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约20g/100gdw总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约25g/100gdw总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约28g/100gdw总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约29g/100gdw总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约30g/100gdw总纤维。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约32g/100gdw总纤维。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约14000μmol TE/100gdw至约19000μmol TE/100gdw的ORAC抗氧化能力。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约14000μmol TE/100gdw的ORAC抗氧化能力。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约15000μmol TE/100gdw的ORAC抗氧化能力。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约16000μmol TE/100gdw的ORAC抗氧化能力。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约17000μmol TE/100gdw的ORAC抗氧化能力。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约18000μmol TE/100gdw的ORAC抗氧化能力。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约18695μmol TE/100gdw的ORAC抗氧化能力。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约19000μmol TE/100gdw的ORAC抗氧化能力。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约1750mg GAE/100gdw至约2600mgGAE/100gdw的总多酚含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约1750mg GAE/100gdw的总多酚含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约2000mg GAE/100gdw的总多酚含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约2100mg GAE/100gdw的总多酚含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约2200mg GAE/100gdw的总多酚含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约2300mg GAE/100gdw的总多酚含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约2360mg GAE/100gdw的总多酚含量。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约0.9％至约1.1％乳酸当量的总可滴定酸度。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约1.1％乳酸当量的总可滴定酸度。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约23g/100gdw至约39g/100gdw的总蛋白质含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约23g/100gdw至约30g/100gdw的总蛋白质含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约25g/100gdw的总蛋白质含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约27g/100gdw的总蛋白质含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约28g/100gdw的总蛋白质含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约29g/100gdw的总蛋白质含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约30g/100gdw的总蛋白质含量。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括约32g/100gdw的总蛋白质含量。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括至少约100mg/kg dw的异硫氰酸酯和以下中的一种或多种或全部。
i)约29至约36g/100gdw的总纤维；
ii)约15000至约18695μmol TE/100gdw的ORAC抗氧化能力；
iii)约2310至约2600mg GAE/100gdw的总多酚含量；
iv)约0.9至约1.1％乳酸当量的总可滴定酸度；
v)约27至约39g/100gdw的总蛋白含量；和
vi)肠膜明串珠菌和/或植物乳杆菌。
在一个实施方案中，所述含异硫氰酸酯的产物由西兰花产生。
本文所述的十字花科产物可包括活性乳酸菌，其可在受试者中消化含芥子油苷的产物期间帮助存在于含异硫氰酸酯的产物中的芥子油苷转化为异硫氰酸酯(即，它们充当益生菌)。在一个实施方案中，乳酸菌是肠膜明串珠菌。在一个实施方案中，乳酸菌是乳杆菌属。在一个实施方案中，所述乳酸菌是植物乳杆菌。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括浓度为至少约102CFU/g的乳酸菌。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括浓度为至少约102CFU/g的乳酸菌。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括浓度为至少约105CFU/g的乳酸菌。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括浓度为至少约106CFU/g的乳酸菌。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括浓度为至少约107CFU/g的乳酸菌。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括浓度为至少约108CFU/g的乳酸菌。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括浓度为至少约109CFU/g的乳酸菌。
在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，含异硫氰酸酯的产物中存在于活性乳酸菌至少10天。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，活性乳酸菌存在于含异硫氰酸酯的产物中至少20天。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，活性乳酸菌存在于含异硫氰酸酯的产物中至少30天。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，活性乳酸菌存在于含异硫氰酸酯的产物中至少40天。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，活性乳酸菌存在于含异硫氰酸酯的产物中至少50天。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，活性乳酸菌存在于含异硫氰酸酯的产物中至少60天。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，活性乳酸菌存在于含异硫氰酸酯的产物中至少70天。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，活性乳酸菌存在于含异硫氰酸酯的产物中至少80天。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，活性乳酸菌存在于含异硫氰酸酯的产物中至少85天。在一个实施方案中，当储存在约4℃至约25℃时，活性乳酸菌存在于含异硫氰酸酯的产物中至少90天。
在一个实施方案中，乳酸菌是乳杆菌属。在一个实施方案中，乳酸菌是植物乳杆菌。在一个实施方案中，乳酸菌是肠膜明串珠菌。在一个实施方案中，细菌以至少约107CFU/g的浓度存在。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物包括一种或多种由乳酸菌产生的细菌素。在一个实施方案中，细菌素是I类细菌素。在一个实施方案中，细菌素是II类细菌素。在一个实施方案中，细菌素是III类细菌素。由乳酸菌产生的细菌素的实例可见于Alvarez-Sieiro等人(2016)。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物是食品。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物是营养品。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物是补充剂。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物为食品成分。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物是益生菌。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物是动物饲料。动物可以是水生动物，如鱼或牲畜。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物是农药。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物是药用化妆品。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物是局部配制的。
在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物为固体、液体、泥或粉末。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物在发酵后干燥成粉末。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物在发酵后冷冻干燥。在一个实施方案中，在发酵后如WO2005030229中所述将含异硫氰酸酯的产物微囊化。在一个实施方案中，将含异硫氰酸酯的产物配制为丸剂。
后处理
在一个实施方案中，在发酵或酸化后，可以后处理含异硫氰酸酯的产物以灭活例如有助于产物降解或如果消耗则致病的微生物。
如本文所用，“后处理(post-treatment)”或“后处理(post-treating)”是指在发酵后处理本文所述的含异硫氰酸酯的产物以灭活微生物。如本文所用，“微生物”是指可导致含异硫氰酸酯的产物降解或腐败的细菌、病毒、真菌或真核活性。如本文所用，微生物的“灭活(inactivate)”或“灭活(inactivation)”是指将活微生物减少约1-7log。在一个实施方案中，活微生物减少约1-6log。在一个实施方案中，活微生物减少约2-6log。在一个实施方案中，活微生物减少约3-6log。
本领域技术人员将理解，后处理可以是使微生物失活的任何方法，包括例如热处理、UV处理、超声处理、脉冲电场处理或高压处理。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物用热处理进行后处理。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物用高压处理进行后处理。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物在后处理期间在密封包装中。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物在高压处理期间在密封包装中。在一个实施方案中，含异硫氰酸酯的产物在热处理期间在密封包装中。在一个实施方案中，高压处理包括用等静压在约300至约600MPa下处理含异硫氰酸酯的产物。在一个实施方案中，高压处理包括用等静压在约350至约550MPa下处理含异硫氰酸酯的产物。在一个实施方案中，高压处理包括用等静压在约300至约400MPa下处理含异硫氰酸酯的产物。在一个实施方案中，热处理包括将样品加热至约60℃至约121℃的温度。在一个实施方案中，热处理包括将样品加热至约65℃至约100℃的温度。在一个实施方案中，热处理包括将样品加热至约65℃至约80℃的温度。在一个实施方案中，热处理包括将样品加热至约65℃至约75℃的温度。
分离的菌株和起子培养物
在一个实施方案中，本发明提供了适用于本文所述的方法和产物的分离的乳酸菌菌株。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的乳酸菌菌株，其选自：
i)2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1；
ii)2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2；
iii)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
iv)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
v)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
vi)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
vii)2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的肠膜明串珠菌菌株，其包括当被SmaI和/或NotI切割时产生与BF1或BF2相同的SmaI和/或NotI指纹的基因组DNA。BF1和BF2的SmaI和NotI指纹示于图13中。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括当被SmaI和/或NotI切割时产生与B1、B2、B3、B4或B5相同的SmaI和/或NotI指纹的基因组DNA。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的肠膜明串珠菌菌株，其包括表18或19中列出的不同于ATCC8293的一种或多种或全部多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表18或19中列出的不同于ATCC8293的5种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表18或19中列出的不同于ATCC8293的10种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表18或19中列出的不同于ATCC8293的15种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表18或19中列出的不同于ATCC8293的19种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表19中列出的不同于ATCC8293的20种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表19中列出的不同于ATCC8293的30种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表19中列出的不同于ATCC8293的50种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表19中列出的不同于ATCC8293的80种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表19中列出的不同于ATCC8293的100种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表19中列出的不同于ATCC8293的150种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表19中列出的不同于ATCC8293的200种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表19中列出的不同于ATCC8293的300种或多种多态性。在一个实施方案中，分离的肠膜明串珠菌菌株包括表19中列出的不同于ATCC8293的400种或多种多态性。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的一种或多种或全部多态性。在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的5种或多种多态性。在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的10种或多种多态性。在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的15种或多种多态性。在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的20种或多种多态性。在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的25种或多种多态性。在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的30种或多种多态性。在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的35种或多种多态性。在一个实施方案中，本发明提供了分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的40种或多种多态性。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于生产含异硫氰酸酯的产物或包括乳酸菌的益生菌的起子培养物，所述乳酸菌包括本文所述的一种或多种分离的菌株。如本文所用，“起子培养物”是用于发酵的活微生物的培养物。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于生产含异硫氰酸酯的产物或包括乳酸菌的益生菌的起子培养物，所述乳酸菌选自以下中的一种或多种或全部：
i)2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1；
ii)2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2；
iii)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
iv)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
v)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
vi)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
vii)2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
在一个实施方案中，用至少约105CFU/g的本文所述的起子培养物接种十字花科材料。在一个实施方案中，用至少约106CFU/g的本文所述的起子培养物接种十字花科材料。在一个实施方案中，用至少约107CFU/g的本文所述的起子培养物接种十字花科材料。在一个实施方案中，用至少约108CFU/g的本文所述的起子培养物接种十字花科材料。在一个实施方案中，用至少约1010CFU/g的本文所述的起子培养物接种十字花科材料。在一个实施方案中，用约105CFU/g至约1010CFU/g的本文所述的起子培养物接种十字花科材料。
益生菌
在一个实施方案中，本发明提供了包括一种或多种分离自十字花科的乳酸菌的益生菌。如本文所用，“益生菌”是指当以足够量施用时赋予宿主对健康益处的活微生物。在一个实施方案中，乳酸菌分离自甘蓝。在一个实施方案中，乳酸菌分离自西兰花。在一个实施方案中，乳酸菌分离自澳大利亚西兰花。在一个实施方案中，乳酸菌选自：i)肠膜明串珠菌；ii)植物乳杆菌；iii)戊糖乳杆菌；iv)鼠李糖乳杆菌；v)i)和ii)的组合；vi)i)、ii)和iii)的组合；和vii)i)、ii)和iv)的组合。在一个实施方案中，乳酸菌选自BF1、BF2、B1、B2、B3、B4和B5中的一种或多种或全部。在一个实施方案中，乳酸菌是B1。在一个实施方案中，乳酸菌是B2。在一个实施方案中，乳酸菌是B3。在一个实施方案中，乳酸菌是B4。在一个实施方案中，乳酸菌是B5。在一个实施方案中，益生菌是胶囊、片剂、粉末或液体。在一个实施方案中，如WO 2005030229中所述将益生菌微囊化。
实施例
实施例1-方法
化学品和试剂
HPLC级甲醇、磷酸二氢钠、氢氧化钠(NaOH)和盐酸(HCl)购自Merck(Damstadt，德国)。福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂、碳酸钠(Na2CO3)、没食子酸、荧光素钠盐和磷酸氢二钾购自Sigma Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。磷酸二氢钠、6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(trolox)、2，20-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(AAPH)购自SapphireBioscience(澳大利亚新南威尔士州雷德芬)。
乳酸菌
在发酵过程中使用的乳酸菌选自以下中的一种或多种：
LP：植物乳杆菌ATCC8014；
LGG：鼠李糖乳杆菌ATCC53103；
B1：2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的分离自西兰花的植物乳杆菌；
B2：2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的分离自西兰花的植物乳杆菌；
B3：2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的分离自西兰花的植物乳杆菌；
B4：2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的分离自西兰花的植物乳杆菌；
B5：2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的分离自西兰花的植物乳杆菌；
BF1：2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的分离自西兰花泥的肠膜明串珠菌；
BF2：2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的分离自西兰花泥BF2的肠膜明串珠菌；
BP：合并的BF1、BF2；和
LAB：合并的B1、B2、B3、B4和B5。
BF1和BF2通过16s-RNA序列鉴定为肠膜明串珠菌(澳大利亚基因组研亢平台；数据未显示)。基于16S-RNA序列，将B1至B5鉴定为植物乳杆菌。通过全基因组序列分析证实了所有分离物的同源性。
从西兰花和西兰花泥中分离乳酸菌
上述植物乳杆菌B1、B2、B3、B4和B5分离自西兰花的叶和茎。用水洗涤叶和茎，并使用stomacher用加入的蛋白胨盐均匀化。将浸泡液连续稀释并涂布在De Man，Rogosa，Sharpe(MRS)琼脂上。将板在厌氧条件下在37℃温育48至72小时以分离推定的嗜温乳酸菌。基于MRS平板上的不同菌落形态，分离菌落，在MRS肉汤中培养，使用染色和生物化学表征技术筛选，并在-80℃用甘油保持冷冻。使用在AGRF的16s RNA测序在物种水平鉴定分离物。
为了分离肠膜明串珠菌BF1和BF2，在连续稀释后使用西兰花小花泥代替上述用于从西兰花叶分离的悬浮液。
起子培养物的制备
从西兰花中分离得到乳酸菌菌株、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌，并由澳大利亚基因组研宄平台鉴定。为了获得初代培养物，将储存在-80℃下的乳酸菌培养物接种到10mLMRS肉汤(Oxoid，Victoria，Australia)中并在30℃下温育24h以获得每毫升8log菌落形成单位(CFU/mL)的初始生物量。将2mL的每种初代接种物接种到200mL MRS肉汤中并在30℃下温育24小时。通过在2000g在4℃下离心15分钟收集培养物，用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并且将所有植物乳杆菌培养物混合在一起，并且将所有肠膜明串珠菌培养物混合在一起。将两种培养物悬浮液稀释至10log CFU/ml并以相同的体积比例混合并与甘油在-80℃下储存直至用作用于西兰花发酵的混合起子培养物。
发酵方法
西兰花(Brassica oleracea L.ssp.Italic；30kg)小花从冠上切下约2cm，切碎成较小的碎片，并使用魔弹混合器(magic bullet blender)以3：2的比率用Milli-Q水浸渍1分钟。将西兰花浆液充分混合并置于具有螺旋盖的无菌塑料瓶(200mL)中。将每瓶西兰花泥(200mL)用制备的起子培养物以8log CFU/g的初始浓度接种。在48个瓶中在30℃下平行进行发酵实验，直到达到约4.0的pH值(第4天)。发酵阶段完成后，取出3个样品作为第0天储存样品，将其它样品分成两批用于储存实验：一批储存在冰箱(4℃)中，另一批储存在恒温于25℃的室中。在12周内定期取样进行微生物、物理化学和植物化学分析。将发酵后的西兰花泥与均质化后储存于-20℃的原料西兰花泥进行比较，并将泥样品与未接种LAB的发酵样品温育相同的时间。
取样
对于时程实验，分别在第10、20、30、40、50、60、70、80和90天以及第14、28、42、56、70和84天对储存在25℃和4℃的样品进行取样。一式三份取样，在表面上测量颜色，打开发酵瓶后立即测量pH。然后，样品进行微生物分析和可滴定酸度分析。将剩余材料分成两部分，将第一部分冷冻并冻干，研磨成细粉并储存在干燥器中用于进一步分析，并且将第二部分冷冻并保持在-20℃下直至萝卜硫苷和萝卜硫素分析。
微生物分析
对于微生物分析，用3种不同的培养基测量不同微生物的CFU/g西兰花泥；平板在DeMan-Rogosa-Sharp(MRS)琼脂上计数总乳酸菌，在紫红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)上计数总肠杆菌，在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上计数酵母和霉菌。对于每个样品，将西兰花悬浮液在无菌蛋白胨盐水稀释剂中进行连续稀释，并将0.1mL稀释物一式两份地铺在琼脂平板上。分别在25℃好氧温育72h(PDA)，37℃温育24h(VRBGA)，30℃厌氧温育72h(MRS)，计数CFU。
pH和可滴定酸度的确定
用pH计(PHM240，Meterlab)直接在含西兰花泥的发酵瓶中确定pH值。西兰花样品的可滴定酸度(TA)用自动滴定仪(Titralab 854滴定管理器，放射分析，法国)测量。简而言之，使用0.1M NaOH将稀释的西兰花泥(10mL)滴定至终点pH＝8.1，并且根据以下等式将获得的结果表示为克当量乳酸/升样品：
Figure BDA0002495677020000321
其中，v是氢氧化钠的滴定体积。乳酸的酸因子为0.009。
总蛋白和颜色分析
西兰花样品的总蛋白含量确定为总氮含量乘以6.25。以LECO TruMac仪器(美国密歇根州LECO公司)，采用Dumas燃烧法分析西兰花的全氮含量。用Chroma meter CR-200三色刺激色度计(日本大阪美能达)确定发酵西兰花样品的颜色指数(L，a，b)。获得的颜色值表示为明度/暗度(如L*)，红色/绿色(a*)和黄色/蓝色(b*)。根据以下等式计算总色差(ΔE)：
ΔE＝[(L*-L0)2+(a*-a0)2+(b*-b0)2]1/2
其中，L0、a0、b0是新鲜未发酵西兰花的色值。
总多酚含量的确定
用修改的Folin-Ciocalteu比色法分光光度法(Singleton和Rossi，1965)测定了TPC的总酚含量(TPC)。简单地说，将50mg西兰花粉末悬浮于10mL酸化(1％HCl)甲醇/水(70∶30，v/v)溶液中且在超声波浴(IDK technology Pty Ltd，VIC，澳大利亚)中萃取8分钟。提取物在4℃保存16h，用0.2μM滤器过滤，在4℃保存直至分析。将1ml 0.2N的Folin-Ciocalteu试剂，800μL的碳酸钠溶液(7.5％p/v)和180μL的Milli-Q级水添加至萃取物(20μL)。在37℃下在黑暗中温育1h后，使用分光光度计(UV-1700 Pharma Spec，SHIMADZU)在765nm下一式三份测量吸光度。使用没食子酸作为标准物，并且基于使用已知浓度的没食子酸形成的标准曲线，TPC表示为以mg/100g鲜重表示的没食子酸当量(GAE)(mg GAE/100gFW)。
氧自由基吸收能力测定
将冻干的西兰花粉末(10mg)悬浮在10mL甲醇/水(80：20，v/v)(萃取溶剂)中。在Heidolph Multi-Reax(澳大利亚新南威尔士州John Morris Scientific)上在室温下以650rpm提取浆液1小时。然后将其在25,000g，4℃下离心15分钟，收集上清液，用75mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)稀释100倍后即可进行分析。根据Huang等(2002)报道的方法(稍作修改)进行ORAC分析。该测定在不透明的96孔板(dark optical bottom，Waltham，MA，USA)中进行。测定反应物包括81.6nM的荧光素，153mM的AAPH，不同浓度的Trolox标准品(100、50、25、12.5，和6.25μM过量)，以及作为空白的75mM磷酸盐缓冲液。反应物按以下顺序加入：25μL稀释的样品；25μL的75mM磷酸盐缓冲液，25μL的Trolox标准品和150μL荧光素。加入荧光素后，将板在37℃下温育10分钟，然后加入AAPH(25μL)。加入AAPH后，立即将板置于荧光板读数器(BMG Labtech ClarioStar，德国)中，每3分钟测量荧光，直到其降低至小于原始荧光的5％。ORAC值计算为曲线下面积(AUC)并表示为每克西兰花干重的微摩尔trolox当量(TE)(μmol Te/g DW)。每个样品测定三次。
萝卜硫素分析
按照Li等人(2012)的方法(稍作修改)从西兰花基质中提取萝卜硫素。简言之，将冷冻的西兰花(2g)与2mL Milli-Q水混合并涡旋1分钟。然后向浆液中加入20mL乙酸乙酯，接着超声处理5分钟并在4℃下振荡20分钟。然后以15,000g离心浆液10分钟，收集上清液。然后向沉淀中再加入15mL乙酸乙酯进行第二次萃取。用真空旋转干燥器(SC250EXP，ThermoFisher Scientific，CA，USA)在室温下将来自每个样品的合并的萃取物蒸发至干燥，并储存在-20℃下直至分析。使用AcquityTM超性能LC系统(Waters Corporation，Milford，MA，USA)测定萝卜硫素的浓度，该系统配有二元溶剂输送管理器和样品管理器。在2.1x50mm，Acquity BEH C18色谱柱上进行色谱分离。流动相A和B分别为0.1％甲酸的millique水溶液和0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱系统由流动相A(0.1％甲酸的millique水溶液)和B(0.1％甲酸的乙腈溶液)组成，并且使用以下梯度实现分离：0-2min，10％B；2-5min，20％B；5-10min，10％B。柱温保持恒定在30℃。流速为0.350mL/min，进样量为5μL。
在分析之前，将所有样品溶解在1mL 30％乙腈中，并且通过0.22μm膜过滤器(MerkMillipore，Billerica，MA，USA)过滤。每个峰的鉴定基于保留时间和可靠标准的色谱。根据标准曲线计算各化合物的浓度，并将结果表示为西兰花的微摩尔/千克DW(μmol/kg DW)。
萝卜硫苷分析
根据Cai和Wang(2016)的方法(稍作修改)从原料或发酵西兰花中提取萝卜硫苷。因此，向2g冷冻的西兰花泥中加入10mL沸腾的Milli-Q水，并将混合物在沸水浴中温育5分钟。然后将其冷却并以15000×g离心15min，并收集上清液。将沉淀用8mL沸水再萃取一次。用真空旋转干燥器(Speedvac SC250EXP，Thermo Fisher Scientific，CA，USA)在3℃下将来自每个样品的合并的萃取物蒸发至干燥，并储存在-20℃下直至分析。使用配备有光电二极管阵列检测器2998的Alliance HPLC仪器(Waters Corporation，Milford，MA，USA)对萝卜硫苷的浓度进行定量。HPLC柱-Luna□3□M亲水作用液相色谱(HILIC)200□A(100×4.6mm；Phenomenex，Torrance，CA，USA)用于在25℃的柱温下分析。流动相由乙腈/水(85∶15，v/v)与30mM甲酸铵(溶液A)和乙腈(溶液B)组成，使用以下等度流动程序：溶液A 70％；溶液B 30％。其它色谱条件包括2.0mL/min的恒定流速，100μL的注射体积，8min的运行时间和235nm的检测波长。在分析之前，将所有样品溶解在1mL溶剂A中，并且通过0.22μm膜过滤器(Merk Millipore，Billerica，MA，USA)过滤。每个峰的鉴定基于保留时间和可靠萝卜硫苷标准的色谱。使用标准曲线计算萝卜硫苷的浓度，并且将结果表示为西兰花的微摩尔萝卜硫苷/千克DW(μmol/kg DW)。
统计分析
所有实验一式三份进行，结果表示为平均值。采用单向方差分析(ANOVA)在0.05显著性水平(p＜0.05)评价平均值之间差异的显著性。使用Windows的统计软件SPSS 16.0(SPSS公司，芝加哥，IL，USA)进行统计分析。
实施例2-乳酸菌发酵的西兰花小花的微生物分析
西兰花泥的发酵如实施例1的发酵部分中所述进行。如表1所示，与接种的西兰花相比，原料西兰花的总乳酸菌计数较低。发酵4天后，样品的pH达到4.04，停止发酵，将储存实验前的发酵样品作为第0天的样品。从表1和图1C清楚看出，与原料西兰花相比，第0天样品的总乳酸菌计数显著增加(8log CFU/g)。在储存的头两周期间，对于在25℃和4℃储存的样品，总乳酸菌的存活数增加至9log CFU/g的最高值(表1和表2)。在25℃储存期间，总乳酸菌计数在第10天增加至9log CFU/g，并且在储存期间在第50天缓慢下降至5log CFU/g，并且在第70天后进一步下降至几乎检测不到的水平。相反，
Figure BDA0002495677020000351
Figure BDA0002495677020000361
Figure BDA0002495677020000371
储存在4℃的样品中的LAB计数即使在储存84天后仍保持较高(6log CFU/g)。
原料西兰花样品中酵母菌和霉菌总计数为2log CFU/g。原料西兰花中的肠杆菌科计数为3log CFU/g。储存在两种温度条件下发酵后或发酵后的样品均未检测到真菌、霉菌和肠杆菌。在发酵和储存期间没有检测到致病和腐败微生物。结果表明，发酵过程产生了具有不可检测水平的潜在致病性肠杆菌科(eneterobacteriaceae)和腐败酵母和霉菌的安全且稳定的产物，其在4℃储存时保持高水平的总乳酸菌。在4℃，～3个月后有～106CFU/g乳酸菌。
实施例3-乳酸菌发酵的西兰花小花储存后pH和可滴定酸度的评估
如实施例1所述分析原料西兰花、25℃和4℃储存后的发酵西兰花和发酵西兰花的pH和可滴定酸度(TA)。TA的测定用于估计发酵期间乳酸和乙酸(乳酸菌产生的主要酸)的量。在发酵期间，乳酸菌产生的酸降低了样品的pH。如表1所示，TA在第0天样品中增加至10.7g/L。当在25℃下储存时，在储存期间10天后pH降至3.87，同时TA值显著增加，达到14.4g/L(p＜0.05；参见表1)。结果表明，在储存初期，仍然存在乳酸菌消耗和进一步产生酸的底物。在剩余储存期间，pH和TA值都没有显著变化(表1)。
由于在较低温度下乳酸菌的活性降低，将温度降至4℃降低了储存样品中pH和TA的降低速率(参见表2)。在4℃储存近3个月后，pH为3.85，TA值为13.7g/L。
实施例4-西兰花浸渍和发酵对萝卜硫苷向萝卜硫素转化的评估
将西兰花小花切成小碎片，与水以3：2的西兰花：水的比例混合，并使用混合器将混合物浸渍成泥。将泥样品(200gm)等分到无菌塑料瓶中。用从澳大利亚西兰花中分离的乳酸菌(肠膜明串珠菌和植物乳杆菌)的混合培养物以108CFU/gm接种样品。将样品在保持在30℃的水浴中温育直至pH降至约4.0，其在发酵四天后达到。浸渍后立即冷冻对照未接种的样品。将第二组未接种的对照样品(向其中加入苯甲酸钠以抑制微生物生长)与接种的样品在30℃下温育4天，直到完成接种的样品的发酵。实验一式三份进行。将所有样品保持冷冻直至萝卜硫素和萝卜硫苷分析。如图1B和表3所示，与仅浸渍和单独温育相比，浸渍后发酵增加了萝卜硫素的产率。
表3：浸渍和发酵对西兰花泥中萝卜硫素含量的影响
Figure BDA0002495677020000391
实施例5-乳酸菌发酵西兰花小花储存后的总蛋白含量和颜色的评估
如上述方法部分所述评估发酵后乳酸发酵西兰花小花的总蛋白含量和颜色。与原料西兰花(26.9±0.03)比较，发酵西兰花的总蛋白含量显著增加(29.6±0.8mg/g；p＜0.05)。这可能是由于大量的乳酸菌接种到样品中，以及在发酵过程中的生长和乳酸菌的蛋白质合成。总蛋白含量在25℃和4℃储存期间保持稳定(表1和表2)，样品之间无显著差异。
西兰花样品的颜色值(L，a，b)和总色差(ΔE)总结于表1和表2中。如表1和表2所示，记录了原料和发酵样品之间颜色参数和总颜色差值(ΔE)的显著差异。西兰花泥发酵后，L*值(明度)变化不明显，而a*(青度)和b*(黄度)值降低。a*和b*值的降低可归因于有色化合物(如叶绿素)的降解，其将在低pH下转化为脱镁叶绿酸。第0天样品的高ΔE值(12.5)表明发酵后西兰花泥的颜色发生了显著变化，这在视觉上是明显的。在储存期间(表1和表2)，25℃和4℃样品的ΔE值没有显著变化。
用LAB+BP发酵后的西兰花(从西兰花分离的植物乳杆菌B1、B2、B3、B4、B5和肠膜明串珠菌BF1、BF2)与仅用LAB发酵的西兰花(从西兰花分离的植物乳杆菌(B1、B2、B3、B4、B5))相比，具有更亮、更强的绿色，与未浸渍的西兰花颜色更相似。
实施例6-发酵西兰花小花中乳酸菌的总酚含量和抗氧化活性的变化
按方法部分所述评估发酵后乳酸发酵西兰花小花的总酚含量(TPC)和抗氧化活性。原料西兰花的TPC为127.6±12.4mg GAE/100g鲜重(图3A)。与原料西兰花相比，第0天的TPC值显著增加至236.9±23.4mg GAE/100g(p＜0.05)。在25℃和4℃下在TPC中储存的样品之间在储存后没有显著差异(图3A)。当储存在25℃时，发酵西兰花中的TPC值在第10天时为246.2±19.3mg GAE/100g，在第90天时为248.1±25.0mg GAE/100g。当储存在4℃下时，第14天和第84天的TPC值分别为274.1±20.2和267.2±3.3mg GAE/100g。
以ORAC值表示的样品的抗氧化活性示于图3B中。原料样品的ORAC值为110.1±0.05μmol TE/g。当与原料西兰花相比时，发酵将ORAC值显著增加约70％至186.9±3.3μmolTE/g。该结果表明，抗氧化剂化合物在发酵期间可能增加，并且与发酵后TPC的变化一致。
在储存期间，发酵西兰花的抗氧化活性没有明显变化。如图3B所示，当储存在25℃时，第10天和第90天的ORAC值分别为173.0±14.4和150±5.5μmol TE/g。对于储存在4℃的样品获得类似的结果。在储存开始时ORAC值为172.0±15.5μmol TE/g，储存后ORAC值增加至最大值(188.7±12.9μmol TE/g)。
实施例7-乳酸菌的不同组合的发酵时间的评估
如上述方法部分所述制备浸渍西兰花，其中西兰花与水的比例为3∶2，浸渍时间为1分钟。用107CFU/g或108CFU/g的以下中的一个接种西兰花材料：LGG、LAB(从澳大利亚西兰花分离的植物乳杆菌(B1、B2、B3、B4、B5))，LAB+LP(从西兰花和乳杆菌属ATCC 8014(ATCC8014)分离的植物乳杆菌)，BP(从西兰花中分离的肠膜明串珠菌)，LAB+BP(如方法部分中所述的两组的混合物)并在25℃、30℃或34℃下发酵以达到4.4的目标pH。如图4所示，加入分离自西兰花和/或西兰花泥的乳酸菌显著减少了发酵所需的时间，其中LAB+BP的组合在发酵约4天后达到pH4.4。发酵西兰花产物的示例组成示于表4中。
表4：发酵西兰花产物的组成。
Figure BDA0002495677020000401
Figure BDA0002495677020000411
实施例8：储存对西兰花萝卜硫素含量的影响
图2A显示了储存在4和25℃对发酵西兰花泥的萝卜硫素含量的影响。如在图2A中可以看出，储存在25℃下的样品的萝卜硫素含量在储存20天后显著降低至770.7±34.9μmol/kg(52％损失)，随后在储存期的剩余期间缓慢下降，达到69.5％的总损失。有趣的是，在4℃下存储发酵西兰花样品储存的头2周期间没有观察到萝卜硫素含量的统计学显著变化。在随后的两周期间发生～23.7％的显著降低，随后在储存期的剩余期间缓慢降解。在储存结束时(第84天)，在4℃储存的样品中，萝卜硫素的含量为1012.9±57.6μmol/kg，与第0天的样品相比，萝卜硫素的总损失为～37.4％。在储存的前两周期间萝卜硫素含量被保持，这可能是由于萝卜硫素的同时产生和降解，因为在相同的时间段内在4℃储存的样品中观察到萝卜硫苷含量的一些降低。
实施例9：发酵和储存对萝卜硫苷含量的影响
图7显示了在4℃和25℃储存期间浸渍和发酵对萝卜硫苷含量及其稳定性的影响。原料西兰花中的萝卜硫苷含量为3423.7±39.7μmol/kg(图7)，发酵后，萝卜硫苷含量急剧降低至712.4±64.2μmol/kg(第0天样品)。萝卜硫苷在完整组织中相对稳定，这种情况下的降解可归因于发酵期间浸渍组织中酶-底物相互作用增加导致的黑芥子酶催化水解。萝卜硫苷急剧减少的时期与发酵时期一致。
在25℃和4℃储存期间，在发酵样品中没有观察到萝卜硫苷含量的显著变化。然而，在储存在25℃的样品中观察到稍高的萝卜硫苷含量。与储存在4℃(在第二时间点的pH4.04)的样品相比，这可能与储存在25℃(在第二时间点的pH3.87)的样品的pH下降更快有关。对于黑芥子酶催化的萝卜硫苷水解的最佳pH范围为5-6，在pH3.0下降低至最低值(Dosz&Jeffery，2013年)。与25℃相比，储存在4℃的样品的相对较高的pH可能导致在4℃储存期间萝卜硫苷的降解稍高。
实施例10-使西兰花基质中的萝卜硫苷向萝卜硫素的转化最大化的热处理条件的评估
将包装在蒸煮袋中的西兰花小花在60℃至80℃的温度和0至5分钟的处理时间下进行热处理。处理包括在维持在高于实验温度5℃的水浴中预热至实验温度，然后在维持在实验温度的第二水浴中温育。热处理后，将样品在冰水中冷却，并如上所述以2∶3的水与西兰花比例添加的水浸渍。将浸渍的样品在30℃下温育1小时并保持冷冻直至萝卜硫素分析。结果示于图2B和表5中。如表5所示，将样品在60℃、65℃或80℃下预热，然后浸渍，相对于未经预热而浸渍的原料西兰花小花增加了萝卜硫素的产率。
表5：热处理对西兰花基质中萝卜硫素生产的影响
Figure BDA0002495677020000431
实施例11-乳酸菌发酵前预热对西兰花中的萝卜硫素含量的影响的评估
本研亢评价了温和预热处理西兰花小花以灭活与乳酸菌结合的表皮特异硫蛋白(ESP)对西兰花泥中萝卜硫素含量的影响。
材料
西兰花(cv.‘Viper’)购自当地超级市场(Coles，Werribee South，VIC，澳大利亚)。DeMan-Rogosa-Sharp(MRS)肉汤(1823477，CM0359，Oxoid)购自Thermo FisherScientific(澳大利亚)。DL-萝卜硫素购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯)。其它化学和生化试剂均为分析级或更高，均购自当地化学品供应商。
优化所述温和预热条件以使萝卜硫素产率最大化的实验
在头部下方约2cm处切割西兰花小花，并且在预热实验中使用每一个30g随机混合的西兰花小花。进行了2种预热试验；包装加工，直接水烫漂。在包装内实验的情况下，将西兰花小花包装在保持在60℃、65℃和80℃的恒温水浴中的蒸煮袋(Caspak Australia，墨尔本)中，密封并预热各个时间点。通过使用温度计测量西兰花样品在最慢加热点的温度。时间0定义为核心温度达到指定实验温度的时间。60℃和65℃处理时间分别为0、1、3和5分钟，80℃处理时间分别为0、1、2、3分钟。在直接水烫漂实验中，在玻璃烧杯中将西兰花小花浸入Milli-Q水中，所述玻璃烧杯在恒温水浴中加热。直接水烫漂实验在60℃和65℃下进行。使用温度计连续测量西兰花样品的温度，并且在最慢加热点的温度达到如上所述的指定实验温度时开始计时。所有热处理实验一式三份进行。未加热的西兰花小花用作对照。热处理之后，立即将样品在冰水中冷却，并使用厨用魔弹混合器(Nutribullet pro 900系列，LLC，USA)以3份西兰花与2份水的比例用Milli-Q水均化1分钟。将匀化的样品在黑暗中于25℃温育4小时，以允许萝卜硫苷酶促水解。温育后，将所有样品冷冻在-20℃中直至萝卜硫素分析。
起子培养物的制备
如实施例1中方法所述，从西兰花中分离的肠膜明串珠菌(BF1、BF2)和植物乳杆菌(B1、B2、B3、B4、B5)的混合培养物。用于发酵实验。将在-80℃下储存的乳酸菌贮存培养物通过接种到10mLMRS肉汤(Oxoid，Victoria，Australia)中并在30℃下温育24小时以获得初代接种物而活化。将2mL初代培养物接种到200mL MRS肉汤中以获得继代培养物。温育24小时后，将6个继代培养物离心，用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并将每个培养物以10log菌落形成单位/毫升(CFU/mL)的浓度重悬浮于Milli-Q水中，以在100gm西兰花泥样品中获得8log CFU/mL的初始生物量。在接种到西兰花泥样品之前，植物乳杆菌培养物与肠膜明串珠菌培养物以1∶1的比例混合。
样品制备
在冠下约2cm处切割西兰花小花并分成两批；热处理和未处理。在基于上述实验结果选择的最佳条件下热处理后，将样品在冰水中冷却，切碎并用使用厨用刻度魔弹混合器(Nutribullet pro 900系列，LLC，USA)以3∶2的比例与Milli-Q水均化1分钟。未处理的西兰花也以类似方式均化。将西兰花泥混合均匀后，等分到带有螺盖的无菌塑料容器(100mL)中(Technoplast Australia)用于进一步的实验。
发酵
用在本实施例中如上所述制备的LAB培养物接种西兰花泥样品(预热的和未处理的)。基于实验结果，在65℃的包装中对西兰花小花进行预热3分钟，以优化预热条件。为了评价不进行发酵的酸化对萝卜硫苷向萝卜硫素的转化的影响，使用葡糖酸-δ-内酯(GDL)对预热的和未处理的西兰花泥进行酸化实验以获得发酵的西兰花泥的pH。将预热的西兰花泥和未经进一步处理的未处理的西兰花泥用作对照。
对于发酵实验，每个西兰花泥样品以8log CFU/g的初始水平接种所制备的起子培养物。在30℃下进行发酵实验，直到温育15小时后pH达到～4.0。一旦发酵完成，取每个发酵组的3个样品(第0天的样品)并储存在-20℃直至分析。将剩余的发酵菌随机分成两批用于储存试验：一批储存在冷藏条件下(4℃)，第二批储存在25℃，用于储存14天后样品的萝卜硫素稳定性的评估。类似地，未处理的西兰花泥、预热的西兰花泥和预热的GDL处理的西兰花泥也在0时间取样并在25和4℃储存用于14天储存试验。储存14天后，将所有样品冷冻并保存在-20℃直至萝卜硫素分析。
萝卜硫素分析及统计分析
如实施例1中所述进行。
用于提高萝卜硫素产率的热处理条件的优化
在不同的处理时间(在60或65℃下0、1、3和5分钟；在80℃下0、1、2和3分钟)下，在三个不同的温度(60、65和80℃)下，热处理对加热的包装内西兰花小花的萝卜硫烷的形成的影响如图5A所示。结果表明，与原料西兰花相比，所有经热处理的样品的萝卜硫素产率均提高。时间0表示样品被加热直到它们的核心达到实验温度。
如图5A所示，当包装的西兰花样品在60℃加热0、1、3和5分钟时，发生萝卜硫素产率的增加。这些样品中萝卜硫素的浓度分别为2343.5±124.1、2661.5±10.9、2780.9±270.8和3147.7±148.0μmol/kg DW。另一方面，当在65℃处理西兰花时，萝卜硫素产率最初随着处理时间从3585.9±119.2(0分钟)增加到3983.4±30.5μmol/kg DW(3分钟)的最高值。处理时间的进一步增加导致更低的产率，在5分钟处理时间后观察到3620.1±240.7μmol/kg的最低值。与在60和65℃处理相比，对于在80℃处理的样品，在更长的处理时间内观察到萝卜硫产率的稳定降低；处理0分钟、1分钟、2分钟和3分钟后，萝卜硫素含量分别为1451.5±43.5、1446.8±17.5、1043.1±94.2和981.2±35.1μmol/kg DW。总之，对于在65℃预热3分钟的样品，获得西兰花的包装内处理的萝卜硫素的最高产率(3983.4±30.5μmol/kg)，其比原料西兰花(817.5±9.3μmol/kg DW)高～5倍。相反，直接在水中加热西兰花，与包装内加工相比，通常导致萝卜硫素的产率较低，如图5B所示。对于在60℃的直接水烫漂中，萝卜硫素产率随处理时间从1698.00±121.9μmol/kg Dw(0分钟)增加到2833.3±118.6μmol/kg Dw(1分钟)，然后稳定地降低到2345.8±57.7μmol/kg Dw的最低值，在60℃处理5分钟。与60℃相比，当样品在65℃烫漂时，观察到萝卜硫产率急剧下降。在65℃下热处理5分钟后西兰花的萝卜硫素产率为503.7±23.8μmol/kg DW，其甚至低于对原料西兰花获得的值。原因可能是萝卜硫苷在烫漂水中的浸出导致萝卜硫素产率低。对于直接水烫漂，与用于包装内加工的65℃相比，用于最大化萝卜硫素产率的最佳处理温度是60℃。
在本研亢中，在65℃下包装内处理3分钟的西兰花小花获得了萝卜硫素的最高产率，表明该条件有利于ESP的最大程度失活，同时保持足够的黑芥子酶活性，导致萝卜硫素的最佳转化。在此条件下，假定1∶1的转化，似乎大部分可提取的萝卜硫苷转化为萝卜硫素，因为西兰花样品的萝卜硫苷含量确定为3423.7±39.7μmol/kg DW。
观察到热处理的西兰花暴露于发酵导致了比从原料西兰花中可提取的萝卜硫苷水平所预测的更高水平的萝卜硫素，提示热处理可能增加了萝卜硫苷对黑芥子酶的可接近性，导致了比基于未处理西兰花中存在的萝卜硫苷可量化的量所预期的更高的萝卜硫素产率。
对于直接在水中烫漂的西兰花小花，获得了较少的萝卜硫素产率，最可能是由于浸出到烫漂水中，因为萝卜硫苷可溶于水。还值得注意的是，与当对西兰花小花进行包装内热处理时，通过在65℃下加热3分钟相比，当将西兰花小花直接在水中加热时，通过在60℃下加热1分钟获得了最大量的萝卜硫素。这可能是由于在65℃进入烫漂水的较高浸出速率抵消了在65℃ESP的较高水平失活的影响。
LAB发酵和化学酸化对萝卜硫素产率的影响
在以上选择的最佳处理条件下(65℃，3分钟)对西兰花小花进行包装内预热。然后将样品用乳酸菌发酵或用酸化剂酸化(GDL)。与预处理试验一致，热处理后西兰花的萝卜硫素值显著增加(p＜0.05)；原料西兰花和预热西兰花的萝卜硫素产率分别为806.2±7.0μmol/kg Dw和3536.0±136.9μmol/kg DW。在发酵之前用预热的该单独批次的西兰花获得的3536μmol/kg Dw的值与当使用不同批次的西兰花时具有相同的量级，其中获得3983μmol/kg DW，表明批次之间的轻微变化。
如表6所示，发酵后，西兰花样品中的萝卜硫素含量根据发酵前西兰花的处理而变化。发酵后原料西兰花泥中的萝卜硫素含量(1617.4±10.0μmol/kg DW)约为原料西兰花泥中萝卜硫素含量的两倍。西兰花在泥化前进行预热处理，使发酵后萝卜硫素含量增加更多。预热发酵西兰花的萝卜硫素含量(13121.3±440.8μmol/kg DW)约为原料未发酵西兰花泥的8倍。在组合预热-发酵处理后观察到的萝卜硫素产率远高于基于原料西兰花样品中萝卜硫苷可量化的量(3423.7±39.7μmol/kg)所预期的产率。似乎组合预热和发酵过程增强了萝卜硫苷的释放和转化的可接近性，超过和高于通过预热过程灭活ESP。与微生物细胞壁降解酶结合的预热过程可增强细胞区室的破坏和基质中结合的芥子油苷的释放，其在原料西兰花中是不可提取的或可接近的。一些乳酸菌株产生能够降解细胞壁结构并增强壁结合组分释放的多糖降解酶，例如纤维素酶和果胶酶。
相反，与预热和预热-发酵的样品相比，用GDL化学酸化预热的西兰花泥导致萝卜硫素含量显著降低(p＜0.05)(表6)。GDL酸化样品的萝卜硫素含量为2169.4±176.0μmol/kg Dw，比预热后的西兰花样品(3536.0±136.9μmol/kg DW)低40％(P＜0.05)。似乎在酸化过程中快速降至pH4.04可能降低GDL样品中萝卜硫苷向萝卜硫素的转化。众所周知，芥子油苷的转化高度依赖于pH并且酸性pH有利于转化成腈(Latte等人，2011)。
在预热的发酵样品的情况下，酸化在＞15小时的时间内逐渐发生，使得萝卜硫苷主要转化为萝卜硫素，因为在65℃预热3分钟后，ESP的活性预期显著降低。
在储存期间萝卜硫素含量的变化
所有样品的萝卜硫素浓度在25℃储存14天后下降(参见表6和图6)。有趣的是，在4℃储存14天期间，在除了发酵样品之外的所有样品中都观察到了萝卜硫素含量的增加。在4℃储存期间，原料泥的萝卜硫素含量几乎加倍。类似地，预热样品中的萝卜硫素含量增加了～2.6倍，而预热GDL样品中的萝卜硫素含量增加了～2.3倍，这表明在储存期间萝卜硫苷从基质中连续释放，允许进一步转化为萝卜硫素，并且浓度增加，抵消了在储存期间萝卜硫素降解的后果。对于预热发酵的样品，在两个温度下储存期间观察到萝卜硫素含量的降低。所有可获得的萝卜硫苷在发酵期间都可能已经转化为萝卜硫素，使得在储存期间不会发生进一步的转化，而降解取决于温度达到不同的程度。因此，在4℃储存期间仅观察到轻微下降(～6％)，而在25℃储存期间下降为～70％。
研亢表明，预热结合乳酸菌发酵显著提高了西兰花基产物中的萝卜硫素含量。在65℃对西兰花小花包装内预加热处理3分钟，经浸渍和发酵后，与原料西兰花相比，萝卜硫素产率高出～16倍。在此条件下的预热将西兰花泥中的萝卜硫素产率从未处理西兰花中的806μmol/Kg DW(干重)增加到3536μmol/Kg DW，表明该处理基本上抑制ESP，同时保持足够的黑芥子酶活性以将萝卜硫苷转化为萝卜硫素。直接水烫漂期间的最佳预加热条件为60℃下1分钟，导致萝卜硫素产率为2833μmol/Kg DW。直接烫漂期间的较低产率可归因于水溶性萝卜硫苷浸出到烫漂介质中。包装内西兰花小花预热(65℃/3分钟)与乳酸菌发酵结合，使萝卜硫素含量进一步提高到13121μmol/Kg DW，比原料西兰花增加约16倍。包装内预热的化学酸化(65℃，3分钟)与葡糖酸-δ-内酯酸化西兰花泥结合，导致萝卜硫素的产率为2169μmol/Kg DW，低于单独预热。在4℃储存两周期间，预热发酵泥的萝卜硫素含量保持稳定(～94％保留)。
表6.加工前后西兰花的萝卜硫素产率(μmol/Kg DW)。
Figure BDA0002495677020000481
DW：干重，GDL：使用葡糖酸-δ-内酯酸化。在65℃下在包装中预热3分钟。
实施例12-乳酸菌发酵对西兰花多酚谱的影响
为了确定发酵对西兰花样品中多酚代谢产物的影响，对原料和发酵西兰花泥样品进行了基于目标液相色谱-质谱(LC-MS)的代谢组学分析。使用Metaboanalyst软件(Metaboanalyst 3.0，Xia和Wishart，2016)分析所得多元数据。发酵导致西兰花样品的代谢物谱的显著变化。数据的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示发酵和非发酵样品的多酚谱之间的明显区别(图8)。
被鉴定为负责两组之间差异的前15种代谢物示于图9中。它们是酚酸和酚糖苷配基，与它们的酚酸酯和酚糖苷前体相比具有更高的生物活性和生物利用度。这些代谢产物的大部分浓度在发酵后显示显著增加，表明发酵对西兰花泥的多酚谱的有益作用。一些代谢物的倍数变化示于表7中。
发酵后观察到芥子酸和山奈酚分别显著增加24倍和16倍。类似地，发酵诱导绿原酸和苯基乳酸增加8倍。发酵后橙皮素、槲皮素、丁香酸甲酯和丁香酸的浓度也显著增加。糖苷配基如山奈酚、橙皮素和槲皮素浓度的增加可归因于它们的糖苷前体通过微生物糖苷酶的活性的转化。芥子酸等酚酸浓度的升高可能是由于微生物酯酶的活性转化了西兰花中的酚酸酯。发酵后观察到咖啡酸和没食子酸的减少。微生物脱羧酶的活性将咖啡酸转化为相应的乙烯基儿茶酚，并且将没食子酸转化为焦棓酸，这可能是其浓度降低的原因(Filanino等人，2015；Guzman-Lopez等人，2009)。
表7.导致发酵和未发酵的西兰花泥之间差异的前13种多酚的倍数变化。
化合物 倍数变化(FC) Log<sub>2</sub>(FC)
1 芥子酸 24.1 4.6
2 山奈酚 16.1 4.0
3 绿原酸 8.3 3.1
4 苯基乳酸 7.9 3
5 橙皮素 3.7 1.9
6 丁香酸甲酯 3.3 1.7
7 丁香酸 3.3 1.7
8 咖啡酸 0.32 -1.6
9 阿魏酸 2.7 1.4
10 4，羟基苯甲酸 0.4 -1.4
11 槲皮素 2.6 1.3
12 芦丁 2.5 1.3
13 没食子酸 0.5 -1.1
实施例13-通过样品的靶向和非靶向LC_MS分析鉴定由西兰花的乳酸菌发酵产生的代谢物
将发酵和未发酵的西兰花泥样品冷冻并冻干。使用1mL冰冷的甲醇和Milli-Q水(50∶50，v∶v)提取样品(各100mg冻干粉)，其包含100mg/mL咖啡因作为内标。然后将样品涡旋2分钟，然后超声处理(40Hz)30分钟。然后将样品在4℃以20,000rpm离心30分钟，并将上清液转移至干净的硅烷化LC-MS小瓶中。通过将1.4μl注入Agilent 6410 LC-QQQ HPLC(Agilent Technologies，Santa Clara，California，USA)来分析样品。使用反相AgilentZorbax Eclipse Plus C18，Rapid Resolution HD，2.1x50mm，1.8um(AgilentTechnologies，Santa Clara，California，USA)进行分析，柱温为30℃，流速为0.3ml/min。将流动相等度运行1分钟，95∶5(A∶B)，然后切换至1∶99(A∶B)持续另外12分钟，之后返回至95∶5(A∶B)持续另外2分钟；提供15分钟的总运行时间。流动相‘A’由100％H2O和0.1％甲酸组成，流动相‘B’含有75％乙腈、25％异丙醇和0.1％甲酸。MS正在收集50-1000m/z质量范围内的数据。根据代谢组学标准规范(MSI)化学分析工作组，使用若干在线LC-MS代谢物数据库(包括Massbank和METLIN)进行化合物的定性鉴定。总的说来，对于正电喷射(+ESI)和负电喷射(-ESI)模式，仪器条件都是相似的。扫描时间为500，源温度保持在350℃，气流为12L/min，喷雾器压力为35psi。
为了在非靶向分析中鉴定化合物，将标准设定为＞90％匹配率。当匹配率降到70-89％之间时，用括号标识化合物(例如，如果化合物在70-89％之间，则将其注释为“＜name＞”)。所有低于70％的匹配被删除。共计有ca.1000-1500个待识别特征；许多是不良匹配的(如去除的)或与基线相比小于10xS/N比例。因此，所使用的化合物/峰是实际的峰，并且ID是相当强的(即＞70％)。
非靶向LC-MS代谢组学研亢显示某些多酚糖苷(包括花青素糖苷、酚酸糖苷、酚酸)增加2至360倍，一些芥子油苷增加5至60倍，萝卜硫苷增加27倍，吲哚-3-甲醇和抗坏血酸原增加约3至4倍。结果总结在表8中，并示于图10和图11的火山图中。发酵后增加的前50个代谢产物包括几种多酚糖苷和芥子油苷，表明该过程提高了它们的可提取性和生物可接受性。
表8.基于非靶向LC-MS分析，发酵和未发酵的西兰花泥之间不同代谢物的倍数变化。
Figure BDA0002495677020000501
Figure BDA0002495677020000511
Figure BDA0002495677020000521
Figure BDA0002495677020000531
Figure BDA0002495677020000541
Figure BDA0002495677020000551
Figure BDA0002495677020000561
Figure BDA0002495677020000571
Figure BDA0002495677020000581
为了确定发酵对西兰花样品中多酚代谢产物的影响，对原料和发酵西兰花泥样品进行了基于目标液相色谱-质谱(LC-MS)的代谢组学分析。统计分析在没有预处理的情况下进行。发酵导致西兰花样品的代谢物谱的显著变化。
在靶向LC-MS分析中，采用多酚标准品进行代谢物的鉴定和定量。在发酵西兰花中证实了绿原酸、阿魏酸、丁香酸、苯基乳酸、芦丁、芥子酸、丁香酸甲酯、橙皮素、槲皮素和山奈酚的增加(图12)。在发酵西兰花中证实了原儿茶酸、没食子酸、4，羟基苯甲酸、香草酸、2，3-二羟基苯甲酸，对香豆酸、肉桂酸、儿茶酸、迷迭香酸、咖啡酸的减少(图12)。值得注意的是，绿原酸(2.4至15.8μg/mg)改变6.6倍，芥子酸(3.6至86.6μg/mg)增加23.8倍，山奈酚(12.7至134.6μg/mg)增加10.5倍，以及对香豆酸减少0.48倍在发酵样品中发生(图12)。
实施例14-西兰花发酵培养物抑制有意导入的微生物的生长的评估
进行挑战研亢以评估西兰花发酵培养物抑制有意导入的微生物的生长的能力，所述微生物在食物制备中经常被观察到并受到关注。
实验室培养物起子培养物
10mL的1010cfu/mL的包括B1、B2、B3、B4、B5、BF1和BF2的接种物，以在发酵中实现108CFU/gm的样品。
病原体培养物
将大肠杆菌分离物FSAW1310、FSAW1311、FSAW1312、FSAW1313和FSAW1314分别在NB(营养肉汤)中生长至1-4x108cfu/mL，37℃过夜，静置。将培养物合并(各1mL)，并且将合并的培养物稀释至104，用MRD(最大回收稀释剂)进行前两次稀释，并且用水进行后两次稀释。
Salmonella strains S.Infantis 1023、S.Singapore 1234、S.Typhimurium1657(PT135)、S.Typhimurium 1013(PT9)和S.Virchow 1563在NB中分别生长至1-4x108cfu/mL，37℃过夜℃，静置。合并培养物(各1mL)并将合并的培养物稀释至104，用MRD进行前两次稀释，并用水进行后两次稀释。
将李斯特菌分离株Lm2987(7497)、Lm2965(7475)、Lm2939(7449)、Lm2994(7537)和Lm2619(7514)分别在10mL BHI(脑心浸液肉汤)中于37℃在搅拌下生长过夜。然后将所有培养物合并(各1mL)并且该混合物使用MRD进行前两次(1/10)稀释和用无菌去离子水进行后两次稀释。
由分离物B3078、B2603、2601、7571和7626制备蜡样芽孢杆菌孢子作物(B.cerusspore crop)。
方法
在制备接种物之前制备西兰花泥，西兰花：无菌自来水3∶2(900g西兰花∶600g水)。用自来水漂洗西兰花头，在用80％乙醇消毒的切菜板上用无菌刀切下西兰花的茎。将西兰花小花(900g)切成小片。将450g西兰花片与所有600g水一起放入Thermomix碗中。将半透明Thermomix杯/盖用80％乙醇消毒并置于盖孔上。西兰花以速度4切碎1分钟。将第二个450g西兰花片加入到Thermomix碗中并在速度4下切碎1分钟。将内容物以速度10(最大)切碎另外5分钟。在确保泥确实足够光滑之后，将Thermomix碗放置在冷却室中以将内容物冷却30分钟。此后，将碗放置在温育箱中并平衡至30℃。同时制备起子培养物和病原培养物(大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌)。将10mL的LAB培养物和7.5mL的10-4稀释的挑战微生物混合物(challenge microorganism cocktail)(在水中104cfu/mL培养物)加入到西兰花泥(105蜡样芽孢杆菌)中。在混合培养之前将箔片保持在Thermomix盖的大孔上。将培养物以最大速度混入泥中1分钟。关闭Thermomix的热定形，并将Thermomix置于30℃温育箱中，在10∶45am开始发酵。在将泥以4.5的速度混合1分钟之后，每小时进行pH和温度测量直至7小时(工作时间结束)。使用80％乙醇对pH计进行校准和消毒。在测量前用80％乙醇对温度探头进行消毒。
在发酵前(T0)和发酵开始后4小时(T4)和22小时(T22)，通过对原料西兰花的选择性培养基MRS、DRBX和NA+S上的生长计数来评估挑战微生物的生长。
结果
酵母和霉菌显著4小时后显著减少，而在发酵结束时没有检测到(T22)。在发酵结束时没有检测到大肠杆菌和沙门氏菌(T22)。在发酵结束时检测到少量李斯特菌，起始接种物刚好超过103cfu/mL。蜡样芽孢杆菌孢子一般不受发酵的影响，但不萌发。挑战研亢结果表明，从西兰花中分离的乳酸菌株能够完全灭活沙门氏菌和大肠杆菌并抑制李斯特菌最耐酸的菌株的生长。它们还能够抑制蜡样芽孢杆菌孢子形成。
表9.用大肠杆菌进行微生物挑战研亢的实施例。将大肠杆菌(5大肠杆菌菌株EC1605、EC1606、EC1607、EC1608的混合物)接种(2.2×102CFU/gm)到浸渍的西兰花(3：2的西兰花-水比例)中进行发酵以评价发酵起子(B1、B2、B3、B4、B5、BF1、BF2的聚生体)是否抑制大肠杆菌的生长。重复实验三次。在30℃下进行发酵22小时至pH低于4.0。
Figure BDA0002495677020000601
表10.用沙门氏菌进行微生物挑战研亢的实施例。将沙门氏菌(5菌株S.Infantis1023、S.Singapore 1234、S.Typhimurium 1657(PT135)、S.Typhimurium 1013(PT9)、S.Virchow 1623的混合物)接种(1.1×103)到浸渍的西兰花(3：2的西兰花-水比例)中发酵以评价发酵起子(B1、B2、B3、B4、B5、BF1、BF2的聚生体)是否抑制沙门氏菌的生长。重复实验三次。在30℃下进行发酵22小时至pH低于4.0。
Figure BDA0002495677020000602
Figure BDA0002495677020000611
表11.用单核细胞增生李斯特菌进行微生物挑战研亢的实施例将单核细胞增生李斯特菌(5菌株Lm2987(7497)、Lm2965(7475)、Lm2939(7449)、Lm2994(7537)、Lm2919(7514)的混合物)接种(1.9×103)到浸渍的西兰花(3：2的西兰花-水比例)中)发酵以评价发酵子(B1、B2、B3、B4、B5、BF1、BF2的聚生体)是否抑制耐酸性李斯特菌的生长。重复实验三次，发酵结束时的最终李斯特菌计数范围为＜10(未检测)至1.1×102CFU/gm。在30℃下进行发酵22小时至pH低于4.0。
Figure BDA0002495677020000612
表12.用蜡样芽孢杆菌进行微生物挑战研亢的实施例。将蜡样芽孢杆菌(5菌株B3078、B2603、B2601、B7571、B7626的混合物)接种(1.9×103)到浸渍的西兰花(3∶2的西兰花-水比例)发酵以评价发酵起子(B1、B2、B3、B4、B5、BF1、BF2的聚生体)是否抑制耐酸性李斯特菌的生长。重复实验三次。在30℃下进行发酵22小时至pH低于4.0。
Figure BDA0002495677020000621
实施例15-肠膜明串珠菌分离物的脉冲场凝胶电泳
如Chat和Dalmasso(2015)(有修改)中所述，对来自蔬菜的肠膜明串珠菌进行SmaI和NotI限制性酶切并用脉冲场凝胶电泳进行评估。
方法：
第1天
将评估的分离物接种到10mLMRS肉汤中并在温育箱中在30℃下温育过夜(16h)。
第2天
分离物在3500g下离心10分钟，弃去上清液。将沉淀混合，用5mL去离子水洗涤，在3500g下离心10分钟，弃去上清液。将沉淀与5mL TES(1mM EDTA，10mM Tris-HCl，0.5M蔗糖)混合并涡旋。接下来，将样品在3500g下离心15分钟并弃去上清液。将700μL裂解溶液(TE缓冲液(1mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH8.0，正常灭菌)，其具有溶菌酶为10mg/mL)添加至沉淀中并且混合并且在56℃下温育2h以裂解细菌。接着，将700μL琼脂糖(具有50μL EDTA/100mL的1％SeaChem Gold琼脂糖)添加到细胞混合物中，混合并分配到栓模中，并且将2mL脱蛋白(660μL蛋白酶K缓冲液，11μL蛋白酶K)溶液添加到用于放置在管中的一个样品的所有栓并且在55℃下温育过夜。
第3天
然后在55℃下在100mL无菌去离子水中加热栓，除去脱蛋白溶液并将栓转移至15mL离心管中，用4mL无菌去离子水洗涤并在室温下加热至55℃10分钟，然后在室温下用4mL TE缓冲液洗涤4次10分钟。
限制性消化
将2mm切下的栓置于具有100μL 1X限制性缓冲液的eppendorf管中，在室温下温育20分钟，去除限制性缓冲液并且用40-100μL SmaI(20U)或NotI限制性缓冲液替换，并且在最佳温度(25℃)下温育4h。
第4天
限制性片段的分离
在每个管中加入1mL 0.5X TBE缓冲液，并使其静置至少15分钟以终止反应，将噬菌体λDNA梯带(New England Biolab)在TBE缓冲液中温育。除去缓冲液，将切片装载到梳子上，梯带在每5个泳道中。在0.5X TBE运行缓冲液中制备1.0％超纯DNA级琼脂糖(脉冲场认证的琼脂糖)。
电泳条件
保持在14℃的缓冲器(1000型迷你冷却器，伯乐(model 1000 Mini-chiller，BioRad))，BioRad“ChefMapperTM”选择两状态程序(非自动算法)。脉冲时间从2秒线性斜升(当“a”出现时按压进入)到25秒。梯度6V/cm(电压)，夹角120°，运行时间24小时。
第5天
凝胶在GelRed中染色～30分钟，脱色，可视化
结果
BF1的限制性指纹是区域，但与分离自胡萝卜的肠膜明串珠菌相似(图13)。BF2的限制性指纹是所有评估的肠膜明串珠菌菌株的区域(图13)。
实施例16-肠膜明串珠菌和植物乳杆菌分离物的变异分析
对于植物乳杆菌分离物(B1至B5)的SNP分析，使用B1 Prokka gbk作为Snippy SNP分析-标准方法的参考。使用每个菌株的读取数据进行单次比较。将B1读数作为对照。
示例性命令为：
snippy--cpus 24--outdir B5--ref B1_S1mod.gbk--pe1 B5_S17_L001_R1_001.fastq.gz--pe2B5_S17_L001_R2_001.fastq.gz
使用B1 gbk作为参考计算个别比较和核心
snippy-core--prefix core B1 B2 B3 B4 B5
还在B1和从植物乳杆菌ATCC 8014的SRA下载的参考菌株读取数据(SRR1552613)之间进行比较。使用具有预取和使用-sratoolkit.2.9.2-win64转换为fastq的标准方法进行下载。类似的方法用于比较肠膜明串珠菌分离物BF1和BF2与作为参考的肠膜明串珠菌ATCC 8293。
结果
在B1和ATCC 8014之间观察到变体(41)(表13)。在B1与其它B分离物B2、B3、B4和B5之间观察到变体(表14至17)。BF1和BF2彼此非常不同。在BF1和ATCC 8293之间观察到变体(19)(表18)。在BF2和ATCC 8293之间观察到变体(～7000)。在BF2和ATCC 8293之间鉴定到459复杂变体，总结于表19中。
Figure BDA0002495677020000651
Figure BDA0002495677020000661
Figure BDA0002495677020000671
Figure BDA0002495677020000681
Figure BDA0002495677020000691
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本领域技术人员应当理解，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
本申请要求于2017年9月28日提交的，名称为“含异硫氰酸酯的十字花科产物及其制备方法”的澳大利亚临时申请号2017903944的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本文讨论和/或引用的所有出版物均全文引入本文。
包括在本说明书中的文件、动作、材料、设备、物品等的任何讨论仅仅是为了提供本发明的上下文。不应视为承认这些内容中的任何或全部形成现有技术基础的一部分或者是与本发明相关的领域中的公知常识，因为其存在于本申请的每个权利要求的优先权日之前。
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Claims (55)

1.一种由十字花科(Brassicaceae)材料制备含异硫氰酸酯的产物的方法，其包括：
i)对十字花科材料进行预处理以提高黑芥子酶对芥子油苷的接近性；
ii)用乳酸菌发酵由步骤i)获得的材料以形成所述含异硫氰酸酯的产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述预处理包括以下中的一种或多种：
i)加热；
ii)浸渍；
iii)微波处理；
iv)暴露于高频声波(超声)，或
v)脉冲电场处理；
其中在预处理期间十字花科材料的温度不超过约75℃。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述预处理降低了表皮特异硫蛋白(ESP)活性，同时保持了内源黑芥子酶活性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中预处理包括加热和浸渍十字花科材料，并且其中在预处理期间十字花科材料的温度不超过约75℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其中加热发生在浸渍之前或其中加热和浸渍同时发生。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中预处理包括将所述十字花科材料加热至约50℃至约70℃的温度，然后浸渍。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述十字花科材料在密封包装中加热。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述十字花科材料被浸渍，使得所述十字花科材料的至少约80％具有约2mm或以下的尺寸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述含异硫氰酸酯的产物包括比浸渍的十字花科材料多至少约10倍的异硫氰酸酯。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中基于可提取的芥子油苷含量，所述含异硫氰酸酯的产物包括至少约2倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其另外包括将来自步骤ii)的含异硫氰酸酯的产物酸化至约4.4或以下的pH。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述乳酸菌选自一种或多种选自以下的属：乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、乳球菌属、链球菌属、气球菌属、肉食杆菌属、肠球菌属、酒球菌属、芽孢乳杆菌属、四联球菌属、漫游球菌属和魏斯氏菌属。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述乳酸菌选自以下中的一种或多种：肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、短乳杆菌、乳酸乳球菌、戊糖片球菌、鼠李糖乳杆菌和乳酸片球菌。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述乳酸菌分离自西兰花和/或所述乳酸菌缺乏黑芥子酶活性。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述乳酸菌选自：
i)肠膜明串珠菌；
ii)植物乳杆菌；
iii)戊糖乳杆菌；
iv)鼠李糖乳杆菌；
v)i)和ii)的组合；
vi)i)、ii)和iii)的组合；和
vii)i)、ii)和iv)的组合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肠膜明串珠菌是2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1和/或2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2。
17.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述乳酸菌选自以下中的一种或多种或全部：
i)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
ii)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
iii)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
iv)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
v)2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中发酵进行约10小时至约17天。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中发酵进行约10至约24小时。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中发酵是在约22℃至约34℃。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中发酵是在约30℃。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中如果存在，发酵减少以下中的一种或多种或全部的数目：大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌和李斯特菌。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述异硫氰酸酯在约4℃至约25℃储存时稳定至少4周，或至少8周，或至少12周。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述含异硫氰酸酯的产物具有一种或多种或全部以下特征：
i)当储存在约4℃至约25℃下时，耐受酵母、霉菌和/或大肠菌生长至少4周，或至少8周，或至少12周；
ii)包括浓度为至少108CFU/g的乳酸菌；和
iii)包括异硫氰酸酯生物活性衍生物。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述芥子油苷选自以下中的一种或多种：萝卜硫苷(glucoraphanin)(4-甲基亚硫酰基丁基)、黑芥子甙(sinigrin)(2-丙烯基)、葡萄糖芫蓄芥素(gluconapin)(3-丁烯基)、芸苔葡萄糖苷(glucobrassicanapin)(4-戊烯基)、前告伊春(progoitrin)(2(R)-2-羟基-3-丁烯基)、表原告依春(epiprogoitrin)(2(S)-2-羟基-3-丁烯基)、2-羟基-4-戊烯基硫苷(gluconapoleiferin)(2-羟基-4-戊烯基)、glucoibervirin(3-甲基硫代丙基)、芝麻菜苷(glucoerucin)(4-甲硫基丁基)、4-甲硫基-3-丁烯基硫苷(dehydroerucin)(4-甲硫基-3-丁烯基)、屈曲花苷(glucoiberin)(3-甲基亚硫酰基丙基)、萝卜苷(glucoraphenin)(4-甲基亚硫酰基-3-丁烯基)、葡萄糖庭荠素(glucoalyssin)(5-甲基亚硫酰基戊烯基)、葡萄糖糖芥苷(glucoerysolin)(3-甲基磺酰基丁基，4-巯基丁基)、芸苔葡糖硫苷(glucobrassicin)(3-吲哚基甲基)、4-羟基芸苔葡糖硫苷(4-hydroxyglucobrassicin)(4-羟基-3-吲哚基甲基)、4-甲氧基芸苔葡糖硫苷(4-methoxyglucobrassicin)(4-甲氧基-3-吲哚基甲基)、新芸苔葡糖硫苷(neoglucobrassicin)(1-甲氧基-3-吲哚基甲基)、金莲葡糖硫苷(Glucotropaeolin)(苄基)，和豆瓣菜苷(Gluconasturtiin)(2-苯基乙基)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述芥子油苷选自萝卜硫苷(4-甲基亚硫酰基丁基)和芸苔葡糖硫苷中的一种或两种。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述异硫氰酸酯是萝卜硫素。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述异硫氰酸酯生物活性衍生物选自以下中的一种或多种或全部：iberin、异硫氰酸烯丙酯、吲哚-3-甲醇、甲氧基-吲哚-3-甲醇、抗坏血酸原和新抗坏血酸原。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述异硫氰酸酯为萝卜硫素且所述含异硫氰酸酯的产物包括至少150mg/kg dw、至少200mg/kg dw、至少300mg/kg dw、至少400mg/kg dw，或至少450mg/kg dw，或至少500mg/kg dw，或至少550mg/kg dw，或至少600mg/kg dw，或至少650mg/kg dw，或至少700mg/kg dw，或至少1000mg/kg dw，或至少2000mg/kg dw，或至少3000mg/kg dw，或至少4000mg/kg dw，或至少5000mg/kg dw，或至少6000mg/kg dw，或至少7000mg/kg dw的异硫氰酸酯。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述含异硫氰酸酯的产物包括约2000mg/kg dw至约4000mg/kg dw的异硫氰酸酯。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述十字花科选自甘蓝(Brassicaoleracea)、巴利阿里芸苔(Brassica balearica)、伊索比亚芥(Brassica carinata)、长芥(Brassica elongate)、地中海包心菜(Brassica fruticulosa)、芥菜(Brassicahilarionis)、印度芥菜(Brassica juncea)、欧洲油菜(Brassica napus)、黑芥菜(Brassica nigra)、小松菜(Brassica perviridis)、芜菁(Brassica rapa)、褐芥(Brassica rupestris)、芥菜(Brassica septiceps)和亚洲芥(Brassica toumefortii)。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述十字花科是甘蓝(Brassica oleracea)。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述十字花科材料选自以下中的一种或多种：叶、茎、花、小花、种子和根。
34.一种由十字花科材料制备含异硫氰酸酯的产物的方法，其包括：
i)对十字花科材料进行预处理以提高黑芥子酶对芥子油苷的接近性；和
ii)酸化由步骤i)获得的材料，形成含异硫氰酸酯的产物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中酸化包括将pH降低至约4.4或以下。
36.一种由西兰花材料制备含异硫氰酸酯的产物的方法，所述方法包括用乳酸菌肠膜明串珠菌和/或植物乳杆菌发酵所述材料以形成含异硫氰酸酯的产物，其中所述方法任选地包括预处理所述西兰花材料以提高黑芥子酶对芥子油苷的接近性。
37.一种由十字花科材料制备含异硫氰酸酯的产物的方法，所述方法包括用从西兰花中分离的乳酸菌肠膜明串珠菌和/或植物乳杆菌发酵所述材料以形成含异硫氰酸酯的产物，其中所述方法任选地包括预处理十字花科材料以提高黑芥子酶对芥子油苷的接近性。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述肠膜明串珠菌是2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1和/或2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2。
39.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述乳酸菌选自以下中的一种或多种或全部：
i)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
ii)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
iii)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
iv)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
v)和2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中在发酵或酸化后，对所述含异硫氰酸酯的产物进行后处理以灭活微生物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述含异硫氰酸酯的产物用高压处理或热处理进行后处理。
42.一种分离的乳酸菌菌株，其选自：
i)2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1；
ii)2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2；
iii)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
iv)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
v)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
vi)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
vii)2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
43.一种分离的肠膜明串珠菌菌株，其包括当用SmaI和/或NotI切割时产生与BF1或BF2相同的SmaI和/或NotI指纹的基因组DNA，或一种分离的植物乳杆菌菌株，其包括当用SmaI和/或NotI切割时产生与B1、B2、B3、B4或B5相同的SmaI和/或NotI指纹的基因组DNA。
44.一种分离的肠膜明串珠菌菌株，其包括表18或19中列出的不同于ATCC8293的一种或多种或全部多态性；或一种分离的植物乳杆菌菌株，其包括表13、表14、表15、表16或表17中列出的不同于ATCC8014的一种或多种或全部多态性。
45.一种用于生产含异硫氰酸酯的产物或包括乳酸菌的益生菌的起子培养物，所述乳酸菌选自以下中的一种或多种或全部：
i)2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1；
ii)2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2；
iii)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
iv)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
v)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
vi)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
vii)2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
46.根据权利要求44所述的起子培养物，其中所述起子培养物包括浓度至少约108cfu/mL的乳酸菌。
47.一种益生菌组合物，其包括选自以下中的一种或多种或全部的乳酸菌：
i)2017年9月25日以V17/021729保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF1；
ii)2017年9月25日以V17/021730保藏在澳大利亚国家计量研亢院的BF2；
iii)2017年9月25日以V17/021731保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B1；
iv)2017年9月25日以V17/021732保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B2；
v)2017年9月25日以V17/021733保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B3；
vi)2017年9月25日以V17/021734保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B4；和
vii)2017年9月25日以V17/021735保藏在澳大利亚国家计量研亢院的B5。
48.一种通过根据权利要求1至41中任一项所述的方法获得的或可获得的含异硫氰酸酯的产物。
49.一种含异硫氰酸酯的十字花科产物，其包括比所述浸渍的十字花科材料多至少约10倍的异硫氰酸酯。
50.一种含异硫氰酸酯的十字花科产物，基于可提取的芥子油苷含量，其包括至少约2倍于异硫氰酸酯的预期最大产率。
51.根据权利要求48或权利要求49所述的含异硫氰酸酯的产物，其中含异硫氰酸酯的产物包括至少150mg/kg dw、至少200mg/kg dw、至少300mg/kg dw、至少400mg/kg dw，或至少450mg/kg dw，或至少500mg/kg dw，或至少550mg/kg dw，或至少600mg/kg dw，或至少650mg/kg dw，或至少700mg/kg dw，或至少1000mg/kg dw，或至少2000mg/kg dw，或至少3000mg/kg dw，或至少4000mg/kg dw，或至少5000mg/kg dw，或至少6000mg/kg dw，或至少7000mg/kg dw的萝卜硫素。
52.根据权利要求47至50中任一项所述的含异硫氰酸酯的产物，其中含异硫氰酸酯的产物具有一种或多种或全部以下特征：
i)当储存在约4℃至约25℃下时，稳定至少4周，或至少8周，或至少12周；
ii)当储存在约4℃至约25℃下时，耐受酵母、霉菌和/或大肠菌生长至少4周，或至少8周，或至少12周；和
iii)包括至少107CFU/g肠膜明串珠菌和/或植物乳杆菌。
53.根据权利要求47至51中任一项所述的含异硫氰酸酯的产物，其中所述产物选自：营养品、补充剂和食品成分。
54.根据权利要求47至52中任一项所述的含异硫氰酸酯的产物，其中所述产物是益生菌。
55.根据权利要求47至53中任一项所述的含异硫氰酸酯的产物，其中所述产物是粉末形式。
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