KR101487847B1 - 발효 기간이 단축된 저온 숙성 된장 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 유효성분으로 포함하는 발효식품 제조를 위한 스타터 및 상기 균주를 첨가하여 발효시킨 발효 기간이 단축된 저온 숙성 된장에 관한 것으로서, 본 발명의 방법으로 제조된 된장의 경우 발암물질로 알려진 에틸 카르바메이트(ethyl carbamate) 생성능이 낮으며, 저염된장에도 적합할 뿐만 아니라 인체 유용한 이소플라본 성분의 체내 흡수력을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 된장은 제조기간을 단축시킬 수 있는 효과가 있다. 본 발명으로 제조된 된장은 단백질과 탄수화물 분해정도, 조지방과 조회분 함량, 염도, 항상화능, 색상, 경도 등의 물성에서는 차이가 없으나, 산화안전성이 높은 특징을 갖는다.

Description

발효 기간이 단축된 저온 숙성 된장{Low-temperature ripening soybean paste with reduced fermentation}

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 유효성분으로 포함하는 발효식품 제조를 위한 스타터 및 상기 균주를 첨가하여 발효시킨 발효 기간이 단축된 저온 숙성 된장에 관한 것이다.

한국 음식은 거의 모두 간장, 된장, 된장 등 장류로 간을 맞추고 맛을 내므로, 장의 맛은 곧 음식의 맛을 좌우하는 기본 요인이 된다. 전통적으로 한국인들에게는 예부터 부족한 단백질을 콩으로 만든 된장을 통해서 섭취할 수 있었다. 오래전부터 먹어오던 입맛으로 요즘에도 매일같이 먹는 음식 중의 하나가 된장이다. 된장은 우수한 단백질 식품으로 양질의 아미노산 형태로 존재하며 라이신이 많이 들어있어 쌀을 주식으로 하는 한국인에게는 균형있는 식품이다. 또한 된장속의 지방은 대부분 불포화 지방산으로 리놀렌산 등은 콜레스테롤이 쌓이는 것을 예방하며 혈액을 원활하게 한다. 이러한 우수한 우리의 전통식품이 요즘에는 가정에서 잘 만들어 먹지 못하는 어려움이 있는데, 이는 제조 공정상 처음부터 완성될 때까지 시간이 너무 많이 걸리기 때문이다.

한편, 가공 공장을 통하여 시판되는 된장은 100% 콩 제품보다는 소백분이 많이 함유되어 있는 제품들이 많다.

된장은 언제부터 만들어 먹었는지는 기록이 없어 확실한 것을 알 수 없지만, 중국의 위지(魏志)와 동이전(東夷傳)에 “고구려에서 장양(藏釀)을 잘한다.”라는 기록이 있는 것으로 보아, 삼국시대 이전부터 이미 된장과 간장이 한데 섞인 걸쭉한 것을 담가 먹다가 삼국시대에 와서 간장과 된장을 분리하는 기술이 발달하였던 것으로 추정할 수 있다.

된장의 종류는 간장을 담가서 장물을 떠내고 건더기를 쓰는 재래식 된장과 메주에 소금물을 알맞게 부어 장물을 떠내지 않고 먹는 개량식 된장, 2가지 방법을 절충한 절충식 된장 등을 들 수 있으며, 그 밖에 계절에 따라 담그는 별미장으로, 봄철에 담그는 담북장과 막장이 있고, 여름철에 담그는 집장과 생황장, 가을철에 담그는 청태장과 팥장, 겨울철에 담그는 청국장 등이 있다.

메주는 콩·보리·밀·쌀 등을 익혀 띄워 만드는데, 장에 따라 메주 만드는 법이 다르며, 말장(末醬)으로 알려진 일반 메주는 콩 → 수침(실온에서 12시간) → 삶음 → 절구에 찧음 → 성형 → 겉 말림(2~3일간) → 재우기(짚을 포개어 씌움, 4주간)→ 햇볕에 말림 → 다시 재우기(2개월) 순으로 만든다. 메주가 만들어지는 원리는 메줏덩이를 따뜻한 곳에 보관하는 동안 볏짚이나 공기로부터 여러 가지 미생물이 자연적으로 들어가 발육하게되며, 이에 착생 된 미생물이 콩의 성분을 분해할 수 있는 단백질분해효소(protease)와 전분분해효소(amylase)를 분비하고 장류에 고유한 맛과 향기를 내는 미생물이 번식하게 된다.

재래식 된장의 제조방법은 다음과 같다. 먼저 11∼12월경에 콩으로 메주를 쑤어 목침만한 크기로 빚어 2∼3일간 말린 후 볏짚을 깔고 훈훈한 곳에 쟁여서 띄운다. 30∼40일이 지나 메주가 잘 떴을 때 메주를 쪼개어 볕에 말려 장독에 넣고 하루쯤 가라앉힌 말간 소금물을 붓는다. 메주콩과 물, 소금의 비율은 1:4:0.8 정도가 알맞다. 맨 위에는 불순물과 냄새를 제거하기 위해 빨갛게 달군 참숯을 띄우고 붉은 고추 말린 것을 꼭지째 불에 굽고 대추도 구워서 함께 띄우는데, 이것은 불순물과 냄새를 제거한다는 관례에 따른 것이다. 60∼70일이 지난 후 메주를 건져서 소금을 골고루 뿌리고 질척하게 개어 항아리에 꼭꼭 눌러 담고 웃소금을 뿌린다. 빗물이 들어가지 않게 주의하면서 망사 등으로 봉해서 햇볕을 쬐면서 메주를 1년 정도 삭히면 된장이 된다.

그리고, 개량식 된장은 간장을 뜨지 않고 된장을 위주로 하는 제조법이다. 재래식과 같은 방법으로 메주를 쑤어 주먹만한 크기로 빚어서 너무 띄우지 말고 말려 독에 차곡차곡 담는다. 가라앉힌 말간 소금물을 메주가 잠길 정도로만 붓고 뚜껑을 덮어서 한 달 가량 둔다. 다른 독을 준비하여 이 메주를 옮겨 담으면서 켜켜이 소금을 뿌려 망사 등으로 봉해서 햇볕을 쬐어 익힌다.

절충식 된장은 간장을 뜨고난 건더기로 된장을 담그면 재래식 메주의 성분이 간장으로 많이 빠져 맛과 영양분이 적으므로, 간장도 맛있고 된장도 맛있는 것을 담그기 위해 이용한다. 굵직하게 빻은 메주를 미리 삼삼한 소금물에 개어 삭혀 두었다가 간장을 뜨고 남은 메주 건더기에 섞어 질척하게 치대어 담아 봉해 둔다.

된장에는 비린내를 없애는 교취효과(矯臭效果)가 있는데, 이것은 된장의 주성분인 단백질이 여러 냄새를 흡착하는 성질을 가지고 있기 때문이다. 고등어나 게 등 비린내 나는 생선요리와 일부 조수육(鳥獸肉) 요리에 된장을 섞어쓰면 비린내를 없애고 맛을 돋울 수 있다.

최근, 된장에 대한 소비자들의 요구는 기존의 맛, 색, 향 등의 식품적인 특성이외에도 효능에 바탕을 둔 건강지향성과 위생적인 측면이 담보된 고급화 된장에 대한 수요와 구매가 크게 늘어나는 추세이다. 따라서, 개량식 된장은 맛과 경제성 측면에서, 재래식 된장은 건강기능성 측면에서 각각 비교 우위에 있는 실정이다. 현재 시판되고 있는 개량식 된장 생산업체들은 제품에서는 소비자들의 호평을 받고 있으나 제품의 우수성 홍보를 통해 재래식 된장의 불리한 가격조건의 이유로는 대부분의 된장 제조 과정이 수작업으로 진행되며, 고가의 국산 콩 사용, 긴 숙성기간(2 ~ 3년)으로 인한 비용 상승에서 기인한다.

이에, 본 발명자들은 재래식 된장과 개량식 된장의 장점인 영양과 경제성을 다 가지면서도 보다 손쉽게 된장을 제조할 수 있는 방법을 강구하던 중, 제조 공정시간을 단축시키고 발암 물질인 에틸카바메이트를 저감시킬 수 있는 락토바실러스 플란타룸　KCTC　3928를 첨가하여　발효 기간이 단축된 저온 숙성 된장을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제1998-0001090호

본 발명의 목적은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 유효성분으로 포함하는 발효식품 제조를 위한 스타터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 첨가하여 발효시킨 발효 기간이 단축된 저온 숙성 된장을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 유효성분으로 포함하는 발효식품 제조를 위한 스타터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효식품은 된장, 간장, 막장, 고추장, 청국장, 김치 또는 젓갈로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 첨가하여 발효시킨 발효 기간이 단축된 저온 숙성 된장을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928는 된장 10 g 당 1.25~25 mg으로 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 된장은 아르기닌 대사능이 저하되어 발암물질인 에틸 카르바메이트(ethyl carbamate) 생성을 억제 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 된장은 2 ~ 6℃의 온도에서 1 ~ 6개월동안 발효 및/또는 숙성시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 된장은 산화스트레스의 지표인 말론디알데히드(malondialdehyde)를 억제 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 유효성분으로 포함하는 발효식품 제조를 위한 스타터 및 상기 균주를 첨가하여 발효시킨 발효 기간이 단축된 저온 숙성 된장에 관한 것으로서, 본 발명의 방법으로 제조된 된장의 경우 발암물질로 알려진 에틸 카르바메이트(ethyl carbamate) 생성능이 낮으며, 저염된장에도 적합할 뿐만 아니라 인체 유용한 이소플라본 성분의 체내 흡수력을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 된장은 제조기간을 단축시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 된장의 염농도에 따른 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3928 유산균의 생육 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3928 첨가 된장과 무첨가 된장의 숙성 1개월 시점에서의 식이섬유 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3928 첨가 된장의 지방산 조성 변화를 나타낸 결과이다.
도 4는 산화유도 시스템을 이용한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3928 첨가 된장의 산화안정성 정도를 나타낸 결과이다.
도 5는 숙성 조건을 달리한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3928 첨가 된장의 색상을 나타낸 결과이다.
도 6은 숙성 조건을 달리한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3928 첨가 된장의 입도분포도를 나타낸 결과이다.
도 7은 숙성 조건을 달리한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3928 첨가 된장의 물성특성을 나타낸 결과이다.

된장은 콩, 소금, 물을 주원료로 한 한국의 전통식품으로 공장형 된장생산법과 재래식 된장 생산법이 있다. 재래식 된장 생산법은 원료인 콩의 준비, 세척, 침지, 메주제조, 발효, 소금물 첨가, 숙성과 포장 과정으로 진행되고, 통상적으로 숙성과정은 2-3년의 기간이 소요되며, 소비자들의 개인적인 취향에 따라 더욱 더 증가하게 된다(Park et al., 2000, Jo et al., 2011). 숙성기간중에 일어나는 변화로는 콩의 이소플라본이 인체흡수가 용이한 비배당체 이소플라본으로 변화되고, 항산화력의 증가, 콩 탄수화물과 단백질의 분해 등의 긍정적 효과 이외에도, 된장색 변화, 에틸 카르바메이트(ethyl carbamate) 생성, 장시간 숙성에 따른 비용 증가들의 부작용을 수반한다(Park et al., 2000, Jo et al., 2011).

에틸 카르바메이트(ethyl carbamate)는 식품의 제조와 저장, 발효와 숙성에 따라 자연적으로 발생하여 알코올 음료와 식품에 함유될 수 있다(Ough 1976, Chung & Kwon, 1997). 에틸 카르바메이트는 포도주, 청주, 위스키, 매실주 등의 알코올 음료와 일본식 된장인 미소, 청국장 낫토, 요구르트, 김치, 간장, 치즈 등에 존재한다(Chung & Kwon, 1997, Tonon & Lonvaud-Funel 2002, Weber & Sharypov 2009). 에틸 카르바메이트(urethane, NH₂COOC₂H₅)는 단시간 고농도로 노출 시에는 신장과 간 손상의 원인이 되며, DNA 수준에서의 돌연변이를 유발하여, 국제암연구소(IARC)에서는 암을 유발하는 Group 2A 물질로 분류하고 있다(IARC 2007). 매실은 미생물 활성과 무관하게 과실에 포함되어 있는 시안화합물이 알코올과 반응하여 에틸 카바메이트를 생성하지만(Kim et al., 2013), 다수의 발효식품에서 에틸 카르바메이트 생성은 미생물에 의한 대사와 관련이 있다(Arena et al., 1999).

다수의 유산균에서 에틸 카르바메이트 생성은 아르기닌(arginine)의 가수분해와 관련된 arginine deaminase(ADI) 효소에 의하여 시트룰린(citrulline)과 NH₃를 생성하며, 생성된 시트룰린은 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(ornithine transcarbamylase)에 의하여 오르니틴(ornithine)과 carbamyl-phosphate(Carbamyl-P)로 대사된다. 에틸 카르바메이트 생성과 관련된 전구체로는 요소(urea), 아르기닌(arginine), 에탄올(ethanol) 등이 알려져 있다(Arena et al., 1999; Tonon Lonvaud-Funel, 2002; Ough, 1976).

에틸 카르바메이트의 인체 안전기준은 아직 명확한 기준은 없으나, 동물 발암용량-반응자료를 근거로 노출인구집단의 10%가 유해반응(발암)을 나타낸다는 가정 하에 고용량에서 저용량으로 외삽된 용량반응곡선의 95% 신뢰하한치로서 동물에 영향을 줄 수 있는 양을 나타내는 Benchmak Dose Lower Limit (BMDL10)는 0.3 mg/kg body weight/day로 알려져 있다(Weber and Sharypov, 2009).

본 발명자들은 된장 등의 발효식품의 제조에 있어 에틸 카르바메이트 생성을 저감화시키는 방안을 찾기 위해 다양한 연구를 진행하던 중 유산균을 스타터(starter)로 된장에 첨가 시 아르기닌에 대한 낮은 대사능이 에틸 카르바메이트 전구체 형성을 낮출 수 있으며, 특히 상업용 유산균들 중에서 에틸 카르바메이트 생성능이 낮은 균주를 선발하여 이를 발효식품용 스타터(starter)균으로 적용하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 아르기닌 대사능이 저해된 유산균 균주를 선발하기 위하여 상업용 유산균 균주들을 MRS broth에서 배양하여 배양액의 유리아미노산(free amino acid) 함량을 정량분석한 결과, 다른 비교 균주들과 비교하였을 때 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928에서 아르기닌(arginine) 함량이 높게 나타났음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 콩 선별, 증자, 메주 제조, 소금물 첨가, 고체/액체 분리 과정들을 거쳐, 액체(간장)을 제외한 고체(된장)를 3개월 숙성하여 사용하였다. 3개월 숙성 된장 1 Kg에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928을 0.125 ~ 2.50 g (1.0×10¹⁰CFU/g)을 첨가하여 완전히 혼합한 후, 뚜껑을 닫고 각각 4℃와 25℃에서 정치 배양하는 방법으로 본 발명의 유산균 첨가 된장을 제조하였다.

또한, 본 발명자들은 선발한 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928 유산균과 된장의 최적 혼합비를 결정하기 위하여 된장 10 g당 분말 상태의 유산균의 양을 25, 18.75, 12.5, 6.25, 2.5, 1.875, 1.25 g을 혼합하여 MRS-agar 배지에서 생균수를 측정하였다.

그 결과, 유산균 수는 각각 41.3×10³, 40.3×10³, 47.3×10³, 19.0×10³, 8.3×10³, 2.7×10³, 2.0×10³CFU/g으로 나타나 생균수 47.3×10³CFU/g를 보인 된장 10 g 당 유산균 12.5 mg을 최적비로 선정하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 선정된 유산균인 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928의 비배당체 이소플라본(isoflavone) 생성능 여부를 확인하기 위하여, 된장을 살균하고, 여기에 추가로 이소플라본과 선정된 균주를 첨가하여 발효하였다. 사용한 이소플라본은 다수를 차지하는 배당체 형태의 이소플라본과 소량의 비배당체로 구성되었다. 발효 전 비배당체 이소플라본 전체 함량은 537 mg/kg였으며, 발효 후에는 1,075 mg/kg으로 증가하였음을 알 수 있었다.

또한, 비조절발효 조건에서 진행되는 재래식 된장 발효에서는 배당체 이소플라본의 비배당체 이소플라본 대사가 진행되지만, 더디게 진행되는데 반하여 인위적으로 β-글루코시다아제 활성이 있는 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928을 접종하여 조절발효(controlled fermentation)하게 되면 단시간에 비배당체 이소플라본 함량을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 발효식품 제조시 사용할 수 있는 스타터 균주로서 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 제공할 수 있으며, 상기 균주를 첨가하여 발효시킨 발효 기간이 단축된 저온 숙성 된장을 제공할 수 있다.

참고로 본 발명에서 용어 “스타터(starter)"란 식품의 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제로, 발효식품 제조 시 첨가함으로써 숙성된 식품에서 지배적으로 생장하는 미생물을 말하며, 본 발명의 목적상 스타터란, 발효 식품의 맛을 일정하게 조절하게 할 뿐만 아니라 우수한 관능미를 가질 수 있도록 제공하는 미생물, 즉, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 필수적으로 포함하는 제제를 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 스타터는 액상 제제, 분말 제제 등으로 제형화할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

균주 및 재료 준비

본 발명에 사용한 유산균인 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928과 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) AY675249은 동결건조된 상태로 Cell Biotech Co., Ltd (GyeongGi-Do, Korea)에서 구매하여 사용하였으며, 이들 유산균들의 배양은 MRS 배지(Difco, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 37^oC에서 2 ~ 3일간 정치배양하였다.

된장에서 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928균 동정은 API 50CHL kit(BioMerieuxInc.,Marcyl'Etoile,France)를 사용하여 생화학적 특성검사를 실시하였다.

< 실시예 2>

유산균 첨가 된장의 제조

실험에 사용한 된장은 2011년도 9월에서 2012년도 2월 사이에 콩 선별, 증자, 메주 제조, 소금물 첨가, 고체/액체 분리 과정들을 거쳐, 액체(간장)을 제외한 고체(된장)를 3개월 숙성하여 사용하였다. 3개월된 된장 1 Kg에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928을 0.125 ~ 2.50 g (1.0×10¹⁰CFU/g)을 첨가하여 완전히 혼합한 후, 뚜껑을 닫고 각각 4℃와 25℃에서 정치 배양하는 방법으로 본 발명의 유산균 첨가 된장을 제조하였다.

< 실시예 3>

아르기닌 대사능이 저해된 유산균 균주 선발

본 발명자들은 아르기닌 대사능이 저해된 유산균 균주를 선발하기 위하여 상업용 유산균 균주들을 MRS broth에서 배양하여 배양액의 유리아미노산(free amino acid) 함량을 정량분석하였다.

먼저, 된장 시료 약 5 g과 70% 에탄올 30 mL를 50 mL 원심분리관에 넣어 1시간 동안 교반한 후 10분 동안 방치 시켰다. 이 추출물을 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 한 후 상층액을 농축플라스크로 옮기고, 남은 침전물에는 70% 에탄올 25 mL를 넣어 교반과 원심분리 과정을 2회 추가 반복하여 얻어진 상징액을 모두 합하였다. 농축플라스크에 모은 추출액을 진공농축한 후 증류수를 첨가하여 150 mL로 정용하고 0.45 μm 실린지 필터(syringe filter)로 원심분리 한 후 상층액을 농축플라스크로 옮기고, 남은 침전물에는 70% 에탄올 25 mL를 넣어 여과 한 후 아미노산 분석기에 주입하였다. 각 시료를 이온교환수지 컬럼(Ion Exchange column, lithium form, 4.6 mm×60 mm)에 통과시킨 후, 다양한 pH와 이온강도를 가진 버퍼(buffer)를 칼럼에 흘려 아미노산을 분리하고, 이들 아미노산을 고온의 반동 코일(reaction coil)에서 닌하이드린(ninhydrin)과 반응시켜 발색 화합물을 형성시켰다.

형성된 화합물들을 570 nm와 440 nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 각각의 아미노산들을 정량하였다. 실험에 사용된 아미노산 분석기는 Hitach L-8800 Amino acid(Hitchi, Japan), 컬럼 오븐 온도는 30-70°C, 반응코일 온도는 135°C, 유속은 0.35 mL/min, 시료 주입액은 20 μL이었다. 정량을 위한 표준물질의 농도는 유리아미노산(free amino acid) 중 포스포세린(phosphoserine), 타우린(taurine), 포스포에탄올아민(phosphoethanolamine), α-아미노아디프산(α-amino adipic acid), α-아미노-n-부티릭산(α-amino-n-butyric acid), 시스타티오닌(cystathionine)은 1.25 μmol/mL, 요소(urea) 50 μmol/mL, 사르코신(sarcosine) 6.25 μmol/mL이었으며, 그 외의 모든 유리아미노산(free amino acid)의 농도는 2.5 μmol/mL이었다. 시료 속 아미노산의 함량은 표준용액 1점을 주입하여 얻어진 크로마토그램을 이용하여 농도와 면적의 비례식을 이용하여 계산되었다.

그 결과, 비교 균주들 중에서 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928에서 아르기닌(arginine) 함량이 높게 나타났음을 알 수 있었다(표 1 참조). 무균 상태의 MRS broth배지에서 18종 아미노산 총 함량은 418 mg/100 g이고 아르기닌(arginine)은 23 mg/100 g로 5.5%였으며, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC3928을 첨가하여 키운 배양액과 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) AY675249을 첨가하여 키운 배양액에서 아미노산 총 함량대비 아르기닌 비율은 각각 4.9%와 0%로 나타나 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928을 아르기닌 대사능이 결여된 균주로 선정하였다(표 1 참조).

< 실시예 4>

된장의 염농도에 따른 락토바실러스 플란타룸 ( L. plantarum ) KCTC 3928 생육

본 발명자들은 된장의 염농도(13.2%)에 따른 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928의 생육 정도를 알아보기 위하여 된장시료를 살균수로 각각 0, 2, 4, 10배 희석한 된장을 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928균의 생육배지로 사용하여 배양 후, MRS-agar에서 생균수를 측정하였다.

그 결과, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)균을 접종하여 발효시킨 된장시료에서 회수한 콜로니(colony)는 흰색에 규칙적인 동그란 형태였다. 생성된 콜로니를 API 50CH kit를 사용하여 생리적 특성을 분석한 결과, 생성 콜로니는 L-아라비노스(L-arabinose), D-리보스(D-ribose), D-갈락토오즈(D-galactose), D-글루코오즈(D-glucose), D-프럭토오즈(D-fructose), D-만노즈(D-mannose), 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), α-메틸-D-만노사이드( α-methyl-D-mannoside), N-아세틸-글루코사민(N-acethyl-glucosamine), 아미그달린(amygdalin), 알부틴(arbutin), 에스쿨린(esculin), 살리신(salicin), 셀리오비오즈(celiobiose), 말토즈(maltose), 락토오즈(lactose), 멜리비오스(melibiose), 수크로오즈(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 멜레지토스(melezitose), 라피노스(raffinose), 겐티오비오스(gentiobiose), D-튜라노스(D-turanose), 글루코네이트(gluconate), 2-케토-글루코네이트(2-keto-gluconate)에 대해서 양성반응을 보임을 알 수 있었다(표 2 참조).

이러한 결과를 웹 프로그램(http://apiweb.biomerieux.com/)을 이용하여, 표준균종에 대한 상대적 근접성을 나타내는 %ID, 각 균종에 대하여 전형적인 생화학 특성에 대한 근접성을 나타내는 T-index를 이용하여 동정하였으며, %ID=99.9%, T-index 0.7를 나타내어 L. plantarum으로 동정하였다.

락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928균의 생균수는 소금농도에 반비례하는 결과를 보였으나, 소금농도 1.32, 3.3과 6.6%에서는 각각 1.0×10⁹,4.0×10⁸,2.5×10⁸CFU/g Danjang으로 유의적인 차이가 없었으나, 희석하지 않은 된장 (소금농도 13.2%)에서는 1.9Χ10⁶CFU/g Doenjang으로 유의적으로 낮았다 (p > 0.05). 이러한 결과는 13.2%의 소금농도를 갖는 된장에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928을 스타터균으로 사용 시에는 일정시간이 경과하면 첨가된 유산균의 활성이 사라진다는 것을 의미한다(도 1 참조).

< 실시예 5>

유산균과 된장의 최적 혼합비 결정

또한, 본 발명자들은 선발한 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928 유산균과 된장의 최적 혼합비를 결정하기 위하여 된장 10 g당 분말 상태의 유산균의 양을 25, 18.75, 12.5, 6.25, 2.5, 1.875, 1.25 mg을 혼합하여 MRS-agar 배지에서 생균수를 측정하였다.

그 결과, 유산균 수는 각각 41.3×10³, 40.3×10³, 47.3×10³, 19.0×10³, 8.3×10³, 2.7×10³, 2.0×10³CFU/g으로 나타나 생균수 47.3×10³CFU/g를 보인 된장 10 g 당 유산균 12.5 mg을 최적비로 선정하였다(표 3 참조).

<실시예 6>

락토바실러스 플란타룸 ( L. plantarum ) KCTC 3928 유산균 첨가 된장의 화학적 조성 및 산화안정성 분석

본 발명자들은 실시예 2의 방법으로 제조된 된장(SP 0.3yr; 3개월 숙성)의 화학적 조성 및 산화안정성 정도를 분석하였으며, 대조군으로는 실시예 2의 방법과 동일하게 제조하였으나 유산균 접종 전 숙성기간을 달리한 SP 2.3yr군(2년 3개월 숙성), SP 8.3yr군(8년 3개월 숙성)을 사용하였다.

<6-1> 일반 성분 및 식이섬유 분석

본 발명자들은 실시예 2의 방법으로 제조된 된장을 25°C와 4°C에서 6개월 동안 저장하면서 유산균 첨가 된장의 일반성분과 식이섬유의 변화를 관찰하고자 하였다.

먼저, 일반성분분석을 위하여 AOAC 방법에 준하여 분석하였다. 일반성분 항목은, 수분은 105°C 건조기(OF-12, Jeio Tech, Kimpo, Korea)를 이용한 상압가열건조법으로, 시료 2g을 취해 항량이 될 때까지 총 12시간 건조하였다.

조회분은 시료 4 g을 취해 백색에서 회백색의 회분이 얻어질 때까지 600°C 회화로(MF31G, Jeio Tech)에서 22시간 동안 시료를 완전 회화시킨 후 직접회화법으로 분석하였다. 조단백질은 킬달 분해 장치(Digestion unit K-424, Buchi, Switzerland), 증류 장치(Kjelflex K-360, Buchi), 적정 장치(702 SMTitrino Metrohm, Buchi)를 연속적으로 사용하여 micro-Kjeldahl법으로 분석한 후, 질소계수 6.25를 곱하여 시료의 조단백질 함량을 산출하였으며, 조지방 함량은 시료 5 g을 105°C 건조기에서 예비 건조시킨 후 건조 시료를 원통여지에 담아 diethyl ether를 용매로 하여 Soxhlet 장치(E-816, Buchi, Switzerland)를 사용하여 추출하였다. 또한, 탄수화물은 100 - (수분+조회분+조단백질+조지방)의 식으로 계산하여 그 값을 표시하였고, 모든 일반성분의 분석은 3회 반복 실시하여 평균값을 취하였다.

또한, 식이섬유 분석은 AOAC 방법(Enzymatic method 985.29)에 따라, 열에 안정한 효소들(amylase, protease, amyloglucosidase)을 시료에 처리한 분해(digestion) 단계, 에탄올을 가하여 식이섬유를 침전시킨 단계, 여과(filtration) 단계(Fibertec System E 1023 Filtration Module, Foss, Switzerland)를 순차적으로 거쳤다. 이 후, 얻어진 반응물을 105°C 상압가열건조법으로 항량이 될 때까지 건조시켰다. 이렇게 건조된 반응물을 첫째, 회화 처리하여 반응물 속의 회분 함량을 산출하였고, 둘째, 효소에 의한 분해단계에서 분해되지 않고 남아있는 시료 속 단백질의 함량을 산출하기 위해, 건조된 반응물의 단백질 함량을 micro-Kjeldahl법으로 분석하였다. 반응물의 건조중량에서 회분과 단백질의 함량을 차감함으로써, 시료에 들어있는 식이섬유의 함량을 산출하였다.

본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 본 발명의 유산균 첨가 된장의 일반성분과 식이섬유의 변화를 측정한 결과, 일반 된장은 숙성기간이 증가할수록 수분감소에 의한 다른 성분들의 농축현상이 관찰되었으나 본 발명의 방법으로 제조된 된장의 경우, 접종 후 1개월 시점에 수분이 유의적으로 증가하는 현상이 관찰되었고, 이후 6개월 시점까지는 일정한 수준의 수분이 유지되었음을 알 수 있었다(표 4 참조).

조회분은 수분이 증가한 1개월 시점에 유의적으로 감소하였고, 이후 수분함량이 일정한 시기에는 조회분의 함량도 일정한 수준이 유지되었음을 알 수 있었다(표 5 참조). 이러한 변화는 유산균 첨가된장에서의 조회분 변동은 무기질 총량이나 조성의 변화라기보다는 수분함량의 변화에 따른 희석(혹은 농축)의 효과로 해석할 수 있다. 반면, 6개월 숙성기간 중 가장 두드러진 변화는 단백질과 지방의 유의적 감소현상이다(표 6 내지 7 참조). 유산균 무첨가 된장을 동일기간 동안 저장한 후 분석한 단백질과 지방의 함량은 유산균 첨가 된장과 큰 차이를 보임을 알 수 있었다(표 6 내지 7 참조).

상기 결과는 본 발명에서 관찰된 단백질과 지방의 변화가 된장 고유의 균에 의한 변화라기보다는 유산균 작용의 결과임을 시사해주고 있다.

본 발명에서 산출된 단백질과 질소는 각각 총질소와 Diethylether-Soluble Compounds를 정량한 것이므로, 유산균 접종으로 인해 질소화합물과 지용성 성분들이 감소했음을 알 수 있다. 이는 차감법으로 계산된 탄수화물의 상대적 함량(%)을 6개월 시점에 유의적으로 증가시키는 결과를 가져왔다(표 8 참조).

고분자의 식이섬유는 6개월의 숙성기간 중 그 함량이 감소하였고, 이러한 변화는 처음 1개월에 가장 뚜렷이 관찰되었으며, 그 이후 기간에는 큰 변화를 나타내지 않았음을 알 수 있었다(표 9 참조). 1개월에 특징적으로 관찰된 본 발명의 방법으로 제조된 된장의 식이섬유 감소는 유산균 무첨가 된장에서도 동일하게 관찰됨에 따라, 외부에서 접종해준 유산균에 의한 영향이라기보다는 된장 자체에 존재하는 된장 발효 숙성균들이 식이섬유 분해에 더 관여했음을 알 수 있었다(도 2 참조). 또한, 전반적으로 숙성온도(25°C, 4°C)에 따른 일반성분의 유의적 차이는 뚜렷하지 않았다.

<6-2> 산도, pH , 수용성 고형분( Soluble Solid ), 염도 분석

본 발명자들은 실시예 2의 방법으로 제조된 된장을 25°C와 4°C에서 6개월 동안 저장하면서 유산균 첨가 된장의 산도, pH, 수용성 고형분 및 염도 정도를 확인하고자 하였다.

먼저, 된장시료 1 g을 증류수 25 mL에 분산시키고 homogenizer(Wise Mix Hg-15, Daihan Scientific, Seoul, Korea)로 약 30초간 골고루 분산시켰다. 이 후 원심분리기(5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)로 2,465×g에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 취해 pH(725P; Istek, Seoul, KOREA)와 수용성 고형분(refractometer, N-1α; Atago, Tokyo, Japan)을 측정하였다.

된장의 총산도(Titratable Acidity, TA)는 원심분리 후에 얻어진 상층액 4 mL를 증류수(6 mL)로 희석한 후 0.01N NaOH로 중화적정하여 결정하였다. 즉, 적정 시 소모된 NaOH 부피로부터 된장의 총산 함량을 발효과정에서 많이 생성되는 유기산인 젖산(lactic acid, 60.05 g/mol)함량으로 산출하였다(Skoog DA 등 2000).

된장의 염도 측정은, K₂CrO₄를 지시약으로 가하고 AgNO₃를 표준용액으로 하여 적갈색의 난용성 침전이 형성될 때까지 적정하여 할로겐화 이온을 정량하는 Mohr법으로 결정하였다. 이를 위해, 된장시료 2.5 g을 증류수 25 mL에 분산시키고 homogenizer(Wise Mix Hg-15, Daihan Scientific, Seoul, Korea)로 약 30초간 골고루 분산시켰다. 이 후 원심분리기(5810R, Eppendorf)로 2,465×g에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 여과지(Whatman NO.5; Whatman International Ltd., Maidstone, UK)로 여과시켜 이를 0.05N의 AgNO₃로 적정하여 최종적으로 된장의 염도를 결정하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시하였으며 결과는 평균과 표준편차로 나타내었다. pH와 수용성 고형분 결과는 희석배수를 별도로 반영하지 않았다.

본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 본 발명의 유산균 첨가 된장의 산도, pH, 수용성 고형분 및 염도를 측정한 결과, 본 발명의 방법으로 제조된 된장은 접종 이후부터 3개월 숙성시점까지 4°C와 25°C 저장온도 모두에서 유기산 함량이 유의적으로 증가하였으며, 이러한 변화는 4°C에서 더 크게 관찰되었다(표 10 참조).

이러한 결과는, 된장 숙성 중 된장 고유의 균과 유산균 간의 경쟁이 온도에 의해 영향을 받으며, 4°C에서 상대적으로 유산균 활성이 더 컸음을 시사하고 있으며 본 발명의 유산균 첨가 된장은 유기산 함량이 증가함에 따라 pH가 감소한 결과를 보임을 알 수 있었다(표 11 참조).

한편, 유산균 접종 후 6개월이 경과하였을 때, 모든 된장에서 유기산 함량이 접종 전 수준까지 현저하게 감소하였다. 유기산 감소 현상은 (i)유산균 활동 억제 및 정지, (ii)유기산 사용 속도가 생성 속도를 능가하여 생성된 유기산이 빠른 속도로 된장 내 미생물에 의해 이용될 가능성도 배제할 수 없다. 접종 후 3개월까지 유기산이 증가하여 된장 속에서 유산균 증식이 활발히 이루어지고 있음을 시사 하였으나, 6개월 시점에서는 유산균 증식의 방해요소로 의심되는 염의 농도가 변화하지 않았음에도, 잔존하는 유기산 양이 현저히 감소한 결과를 나타내었다. 유산균 첨가된장에서만 6개월 시점에 단백질과 지방의 감소했던 결과를 고려하면, 유산균의 생육이 정지되었을 가능성은 다소 희박하다.

발효와 숙성이 진행됨에 따라 일반적으로 미생물에 의해 고분자가 저분자로 분해되므로 수용성 고형분의 함량이 증가할 것이 예상되었다. 그러나, 유산균 첨가 된장은 숙성 1개월 후 전반적으로 감소하는 경향을 보였으며, 6개월 시점에 이르러 초기 수준의 값으로 회복되었다(표 12 참조). 1개월 시점에 관찰된 감소현상은 이 시기에 일어난 현저한 수분감소에 의한 희석효과로 볼 수 있다. 한편, 숙성 3개월 시점부터는 수분 감소가 일어나지 않았음에도 수용성 고형분의 증가는 관찰되지 않았다. 이 결과는, 측정된 수용성 고형분들이 대부분 당, 염, 무기염류 등임을 고려할 때, 발효·숙성과 더불어 증가한 수용성 고형분들이 된장 내 미생물에 의해 이용된 결과로 일부 해석할 수 있다.

선행 연구에서 숙성기간이 긴 된장은 수분 감소에 의한 농축으로 염도가 상승하는 현상이 관찰되었으나 본 발명의 된장은 유산균 접종 전 염의 함량에 유의적 차이가 없었다. 유산균을 첨가한 이후 6개월의 숙성 동안 소폭의 증감이 있었으나 전반적으로는 유의적 차이가 없이 일정한 수준을 유지하였다(표 13 참조). 유산균 접종 후 1개월 시점에 수분이 일시 증가하여 염도 감소를 예상하였으나 상응하는 유의적 변화는 나타나지 않았다. 6개월 숙성동안 염의 농도가 큰 변화가 없었던 이유는, 된장에서 염의 농도 변화에 가장 크게 영향을 주는 수분함량이 비교적 일정한 수준을 유지하였기 때문이다.

<6-3> 아미노산 조성

또한, 본 발명자들은 실시예 2의 방법으로 제조된 된장의 유리 아미노산을 측정하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였다.

전처리는 Hitachi사에서 공급한 매뉴얼에 수록된 방법을 일부 변형하여 수행하였다(Instruction manual, Hitachi, 2001). 먼저, 구성아미노산 분석을 위한 전처리는 시료 약 400~500 mg에 6 N HCl를 약 10 mL 첨가한 후 110°C 에서 22 hr 동안 가수분해 하였다. 이후 진공 농축과 건조과정을 통해 HCl을 제거하였고, 증류수를 첨가하여 100 mL로 정용한 후 0.45 μm 실린지 필터(syringe filter)로 여과시켜 아미노산 분석기에 주입하였다.

유리아미노산 분석을 위해서는, 50 mL 원심분리관에 시료 약 5 g과 70% 에탄올 30 mL를 넣어 1시간 동안 교반한 후 10분동안 방치 시켰다. 이 추출물을 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 한 후 상징액을 농축플라스크로 옮기고, 남은 침전물에는 70% 에탄올 25 mL를 넣어 교반과 원심분리 과정을 2회 추가 반복하여 얻어진 상징액을 모두 합하였다. 농축플라스크에 모은 추출액을 진공농축한 후 증류수를 첨가하여 150 mL로 정용하고 0.45 μm 실린지 필터(syringe filter)로 원심분리 한 후 상징액을 농축플라스크로 옮기고, 남은 침전물에는 70% 에탄올 25 mL를 넣어 여과 한 후 아미노산 분석기에 주입하였다.

구성아미노산 분석을 위한 산 가수분해 시료와 유리아미노산 분석을 위한 에탄올 추출시료를 유리아미노산법으로 분석하였다.

즉 각 시료를 이온교환수지 컬럼(Ion Exchange column, lithium form, 4.6 mm× 60 mm)에 통과시킨 후, 다양한 pH와 이온강도를 가진 버퍼를 칼럼에 흘려 아미노산들이 분리하고, 이들 아미노산을 고온의 반응코일(reaction coil)에서 닌하이드린(ninhydrin)과 반응시켜 발색 화합물을 형성시켰다. 형성된 화합물들을 570 nm와 440 nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 각각의 아미노산들을 정량하였다. 실험에 사용된 아미노산 분석기는 Hitach L-8800 Amino acid(Hitchi, Japan), 컬럼 오븐 온도는 30-70°C, 반응코일 온도는 135°C, 유속은 0.35 mL/min, 시료 주입액은 20 μL이었다. 정량을 위한 표준물질의 농도는 유리아미노산 중 phosphoserine, taurine, phosphoethanolamine, α-amino adipic acid, α-amino-n-butyric acid, cystathionine은 1.25 μmol/mL, urea 50 μmol/mL, sarcosine 6.25 μmol/mL이었으며, 그 외의 모든 유리아미노산 및 구성아미노산의 농도는 2.5 μmol/mL이었다. 시료 속 아미노산의 함량은 표준용액 1점을 주입하여 얻어진 크로마토그램을 이용하여 농도와 면적의 비례식을 이용하여 계산하였다.

상기 방법으로 본 발명의 된장에 대한 유리 아미노산 함량을 측정한 결과, 3개월 시점까지는 큰 변화가 없다가 6개월에 이르러 유리아미노산의 함량이 현저하게 증가하는 결과를 보임을 알 수 있었고, 숙성기간이 긴 된장일수록 유리 아미노산의 함량이 증가함을 알 수 있었다(표 14 참조). 이는 된장 고유의 균에 의한 단백질 분해 결과로 보이며, 유산균 접종 후 6개월 시점에, 접종 전 유리아미노산의 2배에 달하는 유리아미노산이 검출되었다. 유산균을 첨가하지 않은 된장이 2년의 숙성기간 차이에도 유리 아미노산 함량은 단지 10%만 차이가 난 점을 고려하면, 유산균에 의한 단백질 분해력은 주목할만하다.

이 결과를 근거로 하면, 6개월 시점에 관찰된 유기산 감소 현상의 원인 중 유산균의 생육 및 활동이 정지되었을 가능성은 배제될 수 있다(표 10 참조). 한편, 유산균 접종으로 인해 6개월 시점에 관찰된 유리아미노산 증가현상은 4°C 보다 25°C에서 상대적으로 더 큰 경향을 보임을 알 수 있었다.

<6-4> 총 환원력 분석

된장 속의 대표적 항산화 물질로는 이소플라본(daidzin, genistin 등)을 들 수 있으며, 된장 발효가 시작되면, 배당체(glucoside) 형태는 당이 떨어져 나가면서 비배당체(aglycone, daidzein, genistein) 형태의 이소플라본으로 전환된다. 또한, 아글리콘 타입(Aglycone type)은 글루코시드 타입(glucoside type)에 비해 체내 흡수율 및 항산화력이 더 높은 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 숙성조건에 따른 유산균 첨가 된장의 환원력(reducing power)을 비교하기 위해, Folin-Ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 페놀성(phenol) 및 비페놀성(non-phenolic) 환원 물질(reducing substances)을 포괄 정량하는 Folin-Ciocalteu's reagent 법을 사용하였다(Singleton VL 등 1999).

먼저, 된장시료 1 g을 증류수 25 mL에 분산시키고 homogenizer(Wise Mix Hg-15, Daihan Scientific, Seoul, Korea)로 약 30초간 골고루 분산시켰다. 이 후 원심분리기(5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)로 2,465×g에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 취해 총 환원력을 측정하였다. 원심분리한 상층액 1 mL와 Folin-Ciocalteu's reagent와 Na₂CO₃를 각각 1 mL씩 넣고 상온(23°C)에서 1시간 동안 반응시킨 후 spectrophotometer(UV-1650; Shimadzu, Kyoto, Japan)로 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, 시료 추출액 대신 증류수를 넣고 반응 시약을 동일하게 첨가한 용액을 blank로 사용하였다. 된장의 총 환원력은 대표적 환원물질인 갈릭 에시드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준물질로 하여 나타내었다.

유산균 접종 후 6개월 동안의 총 환원물질의 양을 살펴본 경과, 숙성기간(0 ~ 6개월)이나 숙성온도(25°C, 4°C)의 영향보다는, 유산균 접종 전 원시료 된장의 숙성 시간이 더 큰 차이를 나타내었다. 즉 유산균 접종 후 6개월의 단기숙성 중에는 유산균으로 인한 환원물질의 유의적 증가(변화)는 일어나지 않았음을 알 수 있었다(표 15 참조).

<6-5> 지방산 조성

본 발명자들은 유산균 접종 후 숙성시간의 증가에 따라, 포화지방산(SFA, palmitic acid, stearic acid), 단일불포화지방산(MUFA, oleic acid), 다가불포화지방산(PUFA, linoleic acid, linolenic acid)의 변화를 측정하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였다.

된장 시료의 지방산은 Lepage G와 Roy CC(1986)방법에 따라 분석하였으며, 먼저 된장 시료 0.1 g에 내부 표준물질로 tridecanoic acid(C13:0) (Sigma, St. Louis,USA)를 100 μL 함유한 메탄올 : 벤젠 4:1(v/v) 혼합용액 2 mL를 넣고 vortex(KMC-1300V, Vision Scientific, Buchon, Korea)로 교반하면서, 200 μL의 염화아세틸(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)를 drop-wise로 천천히 첨가하였다. 이 후, 이 반응액을 100℃에서 1 시간 동안 열처리함으로써 메탄분해(methanolysis) 반응을 유도하였다.

반응 시간이 경과한 후, 찬물로 식혀 반응액을 실온으로 유지시키고, 6% K₂CO₃ 5mL를 천천히 넣어주면서 반응액을 중화시켜 메탄분해반응을 종결시켰다.

그 후, 원심분리기(5810R; Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 10°C, 1,811×g 에서 10분동안 원심분리 한 후 상층액을 취해 GC-FID(Gas Chromatograph-Flame Ionization Detector)에 주입하였다. 지방산 분석을 위한 GC는 YL 6100GC(Young lin, Anyang, Korea), 컬럼은 J&W Trademarks Durawax(30.0 m × 320 μm × 0.25 μm) (J&W Scientific, Folsom, CA, USA)를 사용하였다. Injector와 Detector(FID) 온도는 모두 250°C였고, 시료주입량은 1 μL(Split ratio 1:10), 이동상 기체 N₂의 유속은 1 mL/min이였다. 컬럼 온도는 180°C에서 3 분 동안 유지하고 235°C까지 3°C/min의 속도로 상승시킨 뒤 5분간 유지하였다.

선행 연구를 토대로 된장의 주요 지방산인 팔미트산(C16:0), 스테아르산(C18:0), 올레산(C18:1), 리놀레산(C18:2), 리놀렌산(C18:3)을 분석하였으며, 결과는 이들 지방산 함량을 100%으로 각 지방산의 함량은 상대적 %(% of total fatty acids)로 나타내었다.

유산균 첨가 된장의 지방산 조성을 살펴본 결과, 숙성 온도(25°C, 4°C) 및 숙성기간(0~6개월)에 따른 유의적 차이는 관찰되지 않았고, 다만 유산균 접종 전 원시료 된장의 숙성기간이 더 큰 영향을 준 것으로 나타났다. 분석된 된장들은 PUFA > MUFA > SFA의 분포를 보였으며, PUFA의 함량은 숙성기간이 가장 짧았던 SP 0.3yr 된장에서 가장 높았고, SP 2.3yr과 8.3yr로 갈수록 함량이 감소하였음을 알 수 있었다(도 3 참조).

<6-6> 전이금속 미량 무기질

된장은 리놀레익에시드(linoleic acid)가 전체 지방산의 50% 이상을 차지하고, 장기간 저장하면서 섭취되는 식품이라, 숙성 중 이들 지방산의 산화 안정성에 대한 검토가 필요하다. 지방산화는 내·외적 환경요인에 의해 영향을 받을 수 있으므로, 본 발명자들은 대표적 산화촉진제로 알려진 전이금속 무기질 함량이 된장 숙성기간에 따라 유의적 차이가 있는지를 측정하기 위하여 본 발명자들은 유산균 접종 전 원시료 된장만을 분석에 포함시켜, 숙성기간이 다른 3종의 된장에서 전이금속 미량 무기질을 측정·비교하였다.

본 발명자들은 일정량(0.2 g)의 시료를 취하여 H₂O₂ 2 mL, HNO₃ 7 mL를 가한 후 마이크로파 시료용해장치(Microwave Digestion System, Ethos Touch Control, Milestone Inc, Italy)를 사용하여 시료를 다음의 온도 조건으로 분해 추출하였다. 먼저 시료의 온도를 3분 동안 85°C까지 상승시키고, 이후 9분 동안 145°C까지 상승 시킨 후, 다시 4분 동안 180°C까지 올려 15분간 유지시켰다. 이렇게 분해된 시료를 증류수로 20배 희석한 후 ICP-AES(Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometer, Vista-Pro, Varian, Australia)에 주입하여 refected power는 1.2 kw, flow gas는 argon, plasma flow는 15 L/min, auxiliary gas flow rate은 1.5 L/min, nebulizer gas flow rate은 0.7 L/min의 조건으로, multi-channel detector(Simultaneous polychromators, Echelle polychromator)를 거쳐 3종의 전이금속 미량 무기질을 분석하였다.

각 원소 별 측정 파장은, Fe(238.204 nm, 259.940 nm), Zn(213.857 nm, 202.548 nm), Cu(327.395 nm, 324.754 nm) 이었다. 각 원소의 농도는, 표준물질의 농도 범위를 0-10 ppm으로 하여, 각 원소 별 standard 3점을 이용하여 표준곡선을 작성한 후 회귀직선 방정식을 이용하여 계산하였다.

그 결과, 숙성기간에 따른 전이금속 미량 무기질의 유의적 차이는 관찰되지 않았음을 알 수 있었다(표 16 참조).

<6-7> 산화안정성 평가

본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조한 된장의 산화안정성을 측정하기 위하여 Kornbrust 와 Mavis(1980)의 방법을 일부 변형하여, 된장시료를 철(iron)과 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함하는 산화유도시스템에 노출시킨 후, 시간의 경과에 따라 산화생성물인 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)를 측정함으로써, 숙성조건이 유산균 첨가 된장의 산화안정성(oxidative stability)에 미치는 영향을 비교 평가하였다.

유산균 첨가 된장은, (i)전체 지방산 중 50% 이상이 산화에 민감한 linoleic acid로 구성되어 있고, 원시료 된장의 숙성기간이 길수록 PUFA의 함량이 낮았으며(도 2 참조) (ii)산화 촉진제인 전이금속 무기질은 숙성기간과 상관성이 없었다(표 16 참조). 또한, (iii)총 환원력은 6개월 숙성기간의 차이보다는 유산균 첨가 이전 원시료의 숙성기간이 더 큰 영향을 주었다(표 15 참조).

이 결과들은, 유산균 접종 전 된장의 숙성기간은 산화안정성에 영향을 줄 수 있지만, 유산균 접종 후 6개월의 숙성 동안은 산화 안정성에 큰 변화가 없을 것을 시사해주었다. 숙성기간과 온도가 다른 유산균 첨가 된장의 산화 안정성은, 산화유도 시스템 하에서 시간이 경과함에 따라 malondialdehyde(MDA)의 생성량을 모니터링하면서 평가하였다.

그 결과, 산화유도 시스템 하에 놓인 유산균 첨가 된장은 노출시간 경과에 따라 이차산화물인 MDA 생성이 비례적으로 증가하였으며, 0분에서 330분까지의 시간 경과에 따른 MDA 증가폭은 6개월 숙성 된장들이 상대적으로 낮아 더 높은 산화안정성을 보임을 알 수 있었다(도 4 참조). 이는 유산균 첨가 된장이 6개월 숙성되었을 때 관찰된 상대적으로 높은 적색도와 일부 관련이 있을 것으로 보인다. 갈변현상이 많이 일어난 된장일수록 Maillard Reaction Products(MRP)의 생성량이 많을 것으로 예상되며, MRP의 항산화력은 지속적으로 보고되고 있다.

< 실시예 7>

락토바실러스 플란타룸 ( L. plantarum ) KCTC 3928 유산균 첨가 된장의 물성 평가

<7-1> color 특성

본 발명자들은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928 유산균 첨가 된장의 색도를 측정하기 위하여 색차계(CR400, Konica Minolta Sensing, Osaka, Japan)를 사용하여 된장의 명도(L, lightness), 적색도(a, redness), 황색도(b, yellowness)를 측정하였다.

표준 백색판을 이용하여 칼리브레이션(calibration)한 후, L값은 0(검정색)에서 100(흰색)까지, a값(적색도)은 -80(녹색)에서 100(적색)까지, b값(황색도)은 -70(청색)에서 70(황색)까지의 범위에서 된장의 색도를 측정하였으며, 모든 시료는 3회 반복 측정하여 평균값± 표준편차로 결과를 나타내었다(표 17 내지 표 19 참조).

그 결과, 유산균 접종 후 6개월의 숙성기간 동안 명도(L)와 황색도(b)는 숙성기간(0~6개월)이나 숙성온도(25°C, 4°C)에 의한 차이는 뚜렷하지 않았다. 오히려, 접종 전 원시료 된장의 숙성기간에 의한 차이가 더욱 현저하여, SP 0.3yr > SP 2.3yr > SP 8.3yr의 순으로 명도와 황색도가 높았으며, 이러한 경향은 유산균 접종 후 6개월의 기간 동안 숙성온도(25°C, 4°C)와 관계없이 동일하게 관찰되었음을 알 수 있었다(표 17 내지 표 19 및 도 5 참조).

원시료 된장들의 숙성기간은 최대 8.3년으로, 유산균 접종 후 모니터링했던 6개월보다 상대적으로 매우 긴 숙성기간이었다. 따라서, 된장의 경우, 명도와 황색도의 유의적 차이는 적어도 6개월 이상의 숙성기간이 지나야 관찰될 것으로 보인다. 반면, 적색도(a)는 숙성기간이 0 ~ 6개월로 증가하는 동안 6종 된장 모두에서 유의적으로 변화하였다. 처음 1개월 시점에는 적색도가 일시적으로 감소하였다가 이후부터 다시 증가하는 경향을 나타내었으며, 증가폭은 25°C에서 상대적으로 높음을 알 수 있었다(표 18 참조). 적색도 증가는, 시간이 경과하면서 마이야르(Maillard) 반응 생성물이 증가한 결과이며, 25°C에서 상대적으로 마이야르(Maillard) 반응속도가 더 빨랐기 때문에 4°C보다 증가폭이 컸던 것으로 해석할 수 있다.

1개월 시점에서 관찰된 일시적 감소는, 유산균의 작용으로 숙성 1개월 시점에 수분이 유의적으로 증가하여 갈변물질이 희석되었기 때문이다.

<7-2> 입자분포 특성

또한 본 발명자들은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928 유산균 첨가 된장의 입자분포 특성을 알아보기 위하여 유산균 첨가된장을 testing sieve 45(aperture 355㎛, wire diameter 224㎛)로 걸러 시료에 함유되어 있는　큰 콩 입자를 제거하였다. 이 시료를 물에 분산시킨 후, 입도분석기(particle size analyzer, Analysette22 Nano Tech, Fritsch, Idar-Oberstein, Germany)를 사용하여, 0.1~1000 μm 측정 범위에서 된장 내부에 존재하는 미세 입자들의 입도분포(particle size distribution)를 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 유산균 첨가 된장을 1개월 숙성 시킨 후 측정한 입도분포도(Particle Size Distribution, PSD)는 25°C, 4°C 모두에서 접종 전과 유의적으로 다르지 않았다. 반면, 3개월 경과한 시점에서는 narrow PSD를 보임으로써, 된장 내부에 존재하는 입자들의 크기 범위가 좁아져 균일한 분포를 나타내고 있었다.

숙성 6개월이 경과했을 때에는, 유산균 첨가 된장의 PSD 상의 peak들은 더욱 좁아(narrow)졌고, 동시에 peak 중심은 오히려 약간 오른쪽으로 이동(right-shifted)된 현상이 나타났다(도 6 참조).

상기의 결과는, 된장 속 고분자에 해당하는 단백질, 지방, 식이섬유 등이 감소한 결과와는 대조를 이루었으나(표 6, 표 7 및 표 9 참조), 고분자의 마이야르 반응 산물(Maillard Reaction Prodoucts)의 생성을 암시하는 적색도 증가와는 일치하였음을 알 수 있었다(표 18 참조).

<7-3> 된장의 물성 분석

본 발명자들은 숙성조건이 다른 유산균 첨가 된장의 물성을 평가하기 위하여 경도, 탄력성, 복원력, 응집성, 점착성 및 저작성을 분석하였다.

된장의 물성은 Texture Analyzer(Instron 5542, Instron, USA)를 사용하여 시료 150 g을 250 mL 용량의 비이커에 3.5 cm 높이까지 정확히 채운 후, 직경 50 mm의 원형 프로브로 2회 반복 압착실험(two-bite compression test)으로 측정하였다. Pre-test speed 50.0 mm/min, test speed 3.3 mm/sec, post-test speed 50.0 mm/min 의 실험 조건으로 측정하였다. 측정 후 얻어진 force-time curve로부터 시료의 경도(hardness), 탄력성(springiness), 복원력(cohesion force resilience), 응집성(cohesiveness), 점착성(gumminess), 저작성(chewiness)이 산출되었으며, 각 시료 당 총 2회 반복 실험하여 평균값± 표준편차로 결과를 나타내었다.

그 결과, SP 2.3yr, SP 8 .3yr 된장과 같이 숙성기간이 충분히 경과한 된장들은 유산균 접종 후 6개월 동안 경도(Hardness)에 유의적 변화가 관찰되지 않았다. 반면, SP 0.3yr 된장은 유산균 접종이후 1개월 경과 시점까지 높은 경도를 유지하였고, 이후 3개월 시점에 경도의 유의적 감소가 관찰되었으며, 이는 SP 2.3yr, SP 8.3yr 된장값과 유사함을 알 수 있었다(도 7 참조).

상기의 결과는, 된장은 제조 후 처음 3개월안의 숙성기간동안만 경도의 드라마틱한 변화가 있었고, 이후의 변동은 초기 변동에 비해 미미한 수준임을 알 수 있었다. 즉 된장 경도 변화의 대부분은 된장 숙성 초기에 진행됨을 알 수 있었다.

유산균 접종 후 6개월의 숙성기간 동안 유산균 첨가 된장의 탄력성(Springiness)과 복원력(Resilence)은 숙성기간(0 ~ 6개월)이나 숙성온도(25°C, 4°C)에 의해 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다. 한편, 원시료 된장의 숙성기간에 따른 차이를 살펴보면, SP 0.3yr < SP 2.3yr SP 8.3yr의 결과를 보였다. 또한, 유의적이지는 않으나 숙성 기간이 가장 짧았던 SP 0.3yr 된장은 시간이 경과함에 따라 탄력성과 복원력이 상대적으로 숙성기간이 길었던 SP 2.3yr와 SP 8.3yr 된장과 유사한 값을 나타내는 경향이 관찰되었다(도 7 참조).

또한, 유산균 접종 전인 SP 0.3yr 된장이 가장 낮은 응집성(Cohesivenss)을 보였으며, 유산균 접종이후 시간이 경과함에 따라 된장 내부의 응집력, 즉 내부 결합력은 증가하는 경향이 관찰되었다. SP 2.3yr, SP 8.3yr 된장은 유산균 접종 전 SP 0.3yr 된장보다 높은 응집성이 나타나, 유산균 접종이후 6개월간의 숙성기간의 영향보다는, 원시료 된장의 숙성년도가 응집력에 더 큰 영향을 준 것으로 보인다. 그러나, 유산균 접종 후 6개월이 경과했을 때, SP 2.3yr 된장과 SP 8.3yr 된장의 응집성은 유의적으로 다르지 않았으므로, 2년 숙성 후 시판되는 시중 된장(또바기된장)의 경우, 그 이후 추가의 숙성기간에서는 응집성의 변화가 매우 미미할 것을 시사하였다.

나아가 SP 0.3yr 된장의 경우, 유산균 접종 후 1개월 시점에, 점착성(Gumminess)과 저작성(Chewiness) 모두 유의적으로 증가하였다. 유산균 접종 전(0 month)과 접종 후 1개월 사이의 경도가 유의적으로 다르지 않은 결과를 고려하면, 이 시점에서의 점착성 증가는 응집성 증가로 설명할 수 있다. 즉 유산균 접종이후 1개월 시점에 경도에서는 변화가 없었으나, 된장 내부의 응집력이 증가함에 따라, 목으로 넘기기 적합한 정도까지 저작하는데 소요되는 힘과 일에 대한 정보를 제공하는 점착성과 저작성 모두가 증가한 것으로 볼 수 있다. 이후 3개월과 6개월에 관찰된 점착성과 저작성의 감소는 경도가 감소한 결과로 볼 수 있다. 즉, SP 0.3yr 된장의 점작성과 저작성은 유산균 접종 후 숙성 초기 1개월 시점까지는 응집력이, 3개월 이후 시점에는 경도가 주요 영향인자로 확인되었다. 반면, SP 2.3yr과 SP 8.3yr 된장은 유산균 접종시점에 이미 충분히 물성 변화가 진행된 이후였으므로, 유산균 접종이후의 숙성기간(0~6개월)이나 숙성온도(25°C, 4°C)는 유의적 영향을 주지 않았음을 알 수 있었다(도 7 참조).

< 실시예 8>

락토바실러스 플란타룸 ( L. plantarum ) KCTC 3928 유산균 첨가 된장의 이소플라본 대사

선정된 유산균인 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928의 비배당체 이소플라본(isoflavone) 생성능 여부를 확인하기 위하여, 된장을 살균하고, 여기에 추가로 이소플라본과 선정된 균주를 첨가하여 발효하였다.

사용한 이소플라본은 다수를 차지하는 배당체 형태의 이소플라본과 소량의 비배당체로 구성되었다. 발효 전 비배당체 이소플라본 전체 함량은 537 mg/kg였으며, 발효 후에는 1,075 mg/kg으로 증가하였음을 알 수 있었다(표 20 참조).

콩 이소플라본은 대부분 배당체 이소플라본으로 존재하고, 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase)에 의한 효소적 분해나 산가수분해 등의 방법에 의하여 비배당체 이소플라본으로 변환되며, 이 경우 인체에서 이소플라본의 흡수가 촉진된다 (Izumi et al., 2000, Setchell & Cassidy 1999).

따라서, 선정된 유산균인 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928은 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 대사시키는 베타-글루코시다아제 활성이 있는 것으로 나타났다. 다른 연구자들에 의해 진행된 선행연구에서도 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) ATCC 15707과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCTC 3108 (Kim et al., 2010), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum)(Tsangalisetal.,2002)에서도 β-글루코시다아제 활성의 존재가 확인되었다.

하지만, Kim et al(2010)의 연구는 배양배지로 대두추출물을, Tsangalis et al(2002)의 연구에서는 두유(soy milk)를 사용하여 고농도의 소금이 포함된 된장을 사용한 본인들의 배양액 조성과는 매우 상이하다. Jo etal .(2011)의 연구에서 전통식 된장의 숙성기간별 이소플라본 함량을 분석하였을 때, 1, 3, 5, 7와 10년 숙성된장에서 비배당체인 다이드제인(daidzein)은 각각 55.0, 72.4, 76.6, 96.0와 101.2 μg/g였고, 또 다른 비배당체인 제니스테인(genistein)은 각각 42.5, 72.4, 87.8, 88.2, 89.5와 94.7 μg/g였고 배당체와 비배당체 이소플라본 총 함량은 149.2, 192.8, 190.0, 208.8와 223.0 μg/g였으며, 전체 이소플라본 함량 대비 비배당체 이소플라본 함량 비율은 각각 92.2, 90.0, 93.4, 94.1와 94.3%로 보고되었다.

상기의 결과는 비조절발효 조건에서 진행되는 재래식 된장 발효에서는 배당체 이소플라본의 비배당체 이소플라본 대사가 진행되지만, 더디게 진행되는데 반하여 인위적으로 β-글루코시다아제 활성이 있는 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928을 접종하여 조절발효(controlled fermentation)하게 되면 단시간에 비배당체 이소플라본 함량을 증가시킬 수 있음을 보여준다.

< 실시예 9>

생균수 측정

된장에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928을 실시예 5에서 결정한 최적화 첨가비율인 12.5 mg으로 첨가한 후, 6개월간 4℃와 25℃에서 숙성하였다.

그 결과, 모든 시료에서 숙성기간이 증가함에 따라 불규칙적이지만 유산균의 생균수가 감소하였으며, 1달까지는 생균수가 증가하다가 다시 감소하는 경향을 보임을 알 수 있었다(표 21 참조). 25℃에서 숙성된 된장의 경우 유도기와 사멸기가 빠른 속도로 진행된 반면에, 4℃ 숙성된장은 온도가 낮음으로 인해 유산균의 생육 환경이 악화되면서 유도기간이 길어지고 그에 따라 사멸기에도 영향을 주어 25℃ 숙성된장에 비해 유산균이 비교적 천천히 그리고 지속적으로 생존함을 알 수 있었다.

상기 실시예의 결과들로 보아 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928 유산균은 아미노산 중 아르기닌 대사능이 현저히 낮아서 에틸 카르바메이트(ethyl carbamate) 생성능이 낮으며, 소금 농도가 높은 된장의 특성을 고려하여 소금농도를 달리한 된장에서의 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928균의 생존능을 분석시 13.2%의 소금농도에서는 다소 생존능이 감소되는 결과를 보여서 현재 제품에 적용하기 보다는 소금 농도를 낮춘 저염된장 제조에 적합한 특성을 보였다.

된장에 대한 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928 유산균의 첨가비율은 제품의 비용에 영향을 주는 요소로 12.5 mg 의 유산균과 10 g 된장의 첨가비로 사용 시 생균수의 감소가 없었으며, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928 유산균은 글리코시드 이소플라본(glycoside isoflavone)을 아글리콘 이소플라본(aglycon isoflavone)으로 변형시키는 특성을 보여서 된장 제조에 적용 시 유용한 효소활성을 갖는 것으로 나타났다. 상기의 조건에서, 비살균 된장에 유산균을 첨가하여 유산균 첨가 된장을 적용 시, 발효기간이 증가할수록 유산균 수는 감소하여 6개월에서는 유산균 활성이 사라져 6개월 이내의 숙성 기간이 적합한것으로 나타났으며, 에틸 카르바메이트(ethyl carbamate) 함량은 통상적으로 발견되는 수준으로 나타났다.

따라서 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928 유산균은 저온에서의 저염 된장 제조에 활용 시 적용이 가능하며, 본 발명은 된장 제조 시 상기 유산균의 최적 첨가량을 규명하였다는 점에 특징이 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

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3. 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) KCTC 3928를 된장 10 g 당 1.25 ~ 25 mg의 양으로 첨가하여 발효시킨 된장에 있어서,
   상기 된장은 2 ~ 6℃의 저온에서 숙성하고, 발효기간을 1 ~ 6개월로 단축시킬 수 있는 특징이 있으며, 아르기닌 대사능이 저하되어 발암물질인 에틸 카르바메이트(ethyl carbamate) 생성을 억제 또는 감소시킬 수 있고, 산화스트레스의 지표인 말론디알데히드(malondialdehyde)를 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 된장.
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