WO2007013588A1 - カワラタケ株及びその抽出物及びその利用 - Google Patents

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WO2007013588A1 PCT/JP2006/314978 JP2006314978W WO2007013588A1 WO 2007013588 A1 WO2007013588 A1 WO 2007013588A1 JP 2006314978 W JP2006314978 W JP 2006314978W WO 2007013588 A1 WO2007013588 A1 WO 2007013588A1
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power
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oyster mushroom
test
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Fumio Eguchi
Ryo Sumi
Nobuo Mori
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Nikken Sohonsha Corporation
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a power oyster mushroom strain, an extract thereof, and use thereof, and in particular, organisms such as a platelet aggregation inhibitory action, a chemokine gene expression inhibitory action, an antimutagenic action, an anticancer action, and an antihypertensive action.
  • the present invention relates to a power oyster mushroom strain excellent in biological activity.
  • mushrooms are used not only for food but also for medicinal purposes, and mushrooms having various medicinal effects are known.
  • Rikitake is called “unshi” in Chinese medicine and is said to have antitumor activity.
  • an antitumor agent (generic name: PSK, trade name: Krestin), which has been developed for the protein polysaccharide strength derived from the power oyster mushroom, is used.
  • Patent Document 3 In recent years, selective binding to TGF- ⁇ and PDGF (patent document 1), immune system preventive effect on cancer and infection by administration to immature animals (patent document 2), suppression of preadipocyte differentiation Effects (Patent Document 3) have been reported!
  • Patent Document 1 JP-A-8-113540
  • Patent Document 2 JP-A-11-60495
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-75640
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and an object of the present invention is to provide a novel power oyster mushroom strain that is extremely excellent in useful activity and use thereof. Means for solving the problem
  • the present inventors have conducted extensive research on cross-breeding for selling or wild power oyster mushrooms.
  • the present inventors have studied platelet aggregation inhibition, chemokine gene expression inhibition, antimutation
  • the present inventors have also found that the action is synergistically improved by further combining microalgae and other basidiomycetes with this power oyster, and the present invention has been completed.
  • the power oyster mushroom strain used in the present invention is a power oyster mushroom strain having a deposit number power SFERM BP-10633.
  • the platelet aggregation inhibitor, the chemokine gene expression inhibitor, the antimutagenic agent, the antitumor agent, the antihypertensive agent, or the immunomodulator of the present invention contains the above-described power oyster mushroom and Z or an extract thereof as active ingredients.
  • the above-described power oyster mushrooms and Z or an extract thereof can be blended in oral compositions such as foods and drinks and pharmaceutical compositions.
  • the power oyster mushroom and Z or an extract thereof can be blended in a composition for external use of skin such as cosmetics and external preparations for pharmaceutical use.
  • microalgae and other basidiomycetes and their collective strength as well as the above-described power oyster mushroom and Z or an extract thereof.
  • the specific power oyster mushroom and Z or an extract thereof of the present invention have excellent platelet aggregation inhibitory action, chemokine gene expression inhibitory action, antimutagenic action, antitumor action, antihypertensive action, immunomodulatory action. Have Furthermore, the combination of microalgae and other basidiomycetes will synergistically improve their action.
  • the power oyster mushroom of the present invention is highly safe and has a low possibility of causing side effects even after long-term use. Food and drink, cosmetics for the purpose of prevention and improvement of inflammation, allergies, tumors and other diseases, Useful for pharmaceuticals.
  • the power oyster mushroom strain of the present invention has a very high hyphal growth and physiological function compared to conventional varieties, so that it can be used stably.
  • FIG. 1 Power Strains of the present invention (Test strain 1, FERM BP-10633), other produced hybrid strains (Test strains 2 to 4), parent strain A and parent strain B used for test strain production, conventional It is the figure which compared the platelet aggregation, the chemokine gene expression inhibitory effect, and the antimutagenic action of the fruit body hot water extract about the cultivars, Kojiwaratake I and Kishiwaratake mushroom (control is DMSO).
  • FIG. 2 Platelet aggregation inhibitory action, chemokine gene expression inhibitory action, antimutagenic action of hot water extract and hydrous ethanol extract of fruiting body of power oyster mushroom strain (Test strain 1, FERM BP-10633) of the present invention (Control is DMSO).
  • FIG. 3 Chloroella and Z or Shiitake fruiting body hot water extract mixed with the hot water extract of the power oyster mushroom strain (Test strain 1, FERM BP-10633) of the present invention
  • FIG. 5 is a diagram showing a synergistic effect on platelet aggregation inhibitory action, chemokine gene expression inhibitory action, and antimutagenic action (control is DMSO).
  • FIG. 4 Contrast with control (non-administration) after a single administration to SHR of a composition containing a hot water extract of the fruiting body of the power oyster mushroom strain of the present invention (test strain 1, FERM BP-10633). It is a figure which shows the time-dependent change of systolic blood pressure.
  • FIG. 5 A composition containing a hot water extract of the fruit body of the power oyster mushroom strain of the present invention (test strain 1, FERM BP-10633) when administered chronically to SHR and when not administered (control) It is a figure which shows the time-dependent change of systolic blood pressure.
  • FIG. 6 (a) Expansion when a composition containing a hot water extract of the fruit body of the power oyster mushroom strain of the present invention (test strain 1, FERM BP-10633) is chronically administered to hypertensive patients. It is a figure which shows the time-dependent change of a systolic blood pressure, and (b) systolic blood pressure.
  • FIG. 7 (a) Blood renin concentration when a composition containing a hot water extract of the fruit body of the power oyster mushroom strain of the present invention (test strain 1, FERM BP-10633) is chronically administered to hypertensive patients. (B) and (b) are diagrams showing the time course of blood angiotensin I concentration.
  • FIG. 8 A composition containing a hot water extract of the fruit body of the power oyster mushroom strain of the present invention (test strain 1, FERM BP-10633) was chronically administered to 30 healthy individuals for 1 month and then for 2 months.
  • FIG. 4 is a graph showing changes over time in the number of T cells and the number of NK cells when administration is stopped.
  • the power oyster mushroom used in the present invention is Trametes versicolor (L .: Fr.) Pilat belonging to the genus Corpioaceae (Polyporaceae), and is a patent biological deposit center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. It is a power waratake strain (trade name: Tanaka Yoshiho strain) with a deposit number of FERM BP-10633, which was deposited internationally on June 28, 2006. This was transferred from the deposit number FERM P-20377 (deposited on January 26, 2005) deposited at the center. All were deposited by Fumiyo Eguchi, one of the inventors.
  • the main power oyster mushroom strain is a new power oyster mushroom strain obtained by cross-breeding using wild protoplasty technology from wild power oyster mushrooms that grew naturally in Kumamoto Prefecture, compared to conventional varieties and parental strains. It has the highest activity in hyphal growth and physiological functions, platelet aggregation inhibitory action, chemokine gene expression inhibitory action, antimutagenic action, and antitumor action. It also has high activity in antihypertensive action and immunosuppressive action. The production method, selection method and effects of this strain are described in detail in the examples.
  • the power oyster mushroom may be a fruit body, an extract of the fruit body, or a dried product of the extract, and the fruit body may be either raw or dried. From the standpoints of handling, storage, extraction efficiency, etc., dried fruit bodies are desirable. In order to efficiently ingest an effective amount, it is preferable to use a dry powder of fruit body or an extract thereof, and the use of the extract is particularly preferable.
  • fruit bodies are preferably used, but the effect can be expected for the mycelium.
  • mycelium live or dry mycelium obtained by culturing inoculum in a medium containing a carbon source and a nitrogen source can be used. The dried one is convenient.
  • a known cell wall degrading enzyme or polysaccharide degrading enzyme can be used.
  • 8-Dalkanase, etc. can be used alone or in combination of two or more kinds.
  • Enzymatic treatment of force oyster mushroom is added to force oyster mushroom that has been appropriately shredded or crushed, as an aqueous solution.
  • an extraction solvent is added to the oyster mushroom that has been subjected to the tissue destruction treatment as described above, and the mixture is appropriately stirred and extracted. What is necessary is just to process.
  • the extraction solvent is not particularly limited, and examples thereof include primary alcohols such as water, methanol and ethanol, polyhydric alcohols such as 1,3-butylene glycol and propylene glycol, lower alkyl esters such as ethyl acetate, benzene and hexane. And hydrocarbons such as ethyl ether, acetone and the like. These may be used in combination of two or more.
  • Preferred extraction solvents include water, methanol, ethanol, 1,3-butylene glycol, or a mixed solvent thereof. In particular, a product obtained by extracting dry powder of power oyster mushroom fruit body with hot water is preferable.
  • the extraction operation may be performed under normal pressure and at room temperature, but may also be performed under a pressure of 1 to 5 atmospheres, a pressure of 60 to 150 ° C, and heating. Specifically, for example, after extraction with hot water or the like, it is preferable to separate into an extract and a residue by centrifugal separation or vacuum filtration.
  • the extraction residue may be re-extracted under the same conditions as described above, and this extraction operation may be repeated several times.
  • the extract may be an extract or a dried product thereof.
  • the extract is removed by subjecting the extract to treatments such as vacuum concentration, sterilization, freeze drying, and spray drying.
  • Mycelium elongation is the best at around 27 ° C, and low temperature treatment of 10-12 ° C is suitable for fruit body development.
  • the cultivation period takes 20 to 25 days for the hyphae to spread, and about 20 days for subsequent fruiting. 2.
  • a yield of about 200g can be expected with 5kg capacity bag cultivation.
  • Culture medium The base sawdust is suitable for most hardwoods, and cedar hydrolyzed can be used.
  • the power oyster mushroom strain of the present invention is excellent in platelet aggregation inhibitory action and chemokine gene expression inhibitory action, and thus is useful for preventing thrombus formation 'improvement, improving blood flow, preventing inflammatory or allergic diseases' etc. .
  • a preventive / ameliorating effect can be expected for inflammatory or allergic skin diseases.
  • the power oyster mushroom strain of the present invention is excellent in antimutagenic action and antitumor action.
  • the power oyster mushroom strain of the present invention capable of suppressing the activity of the mutagen is useful for the prevention of such diseases. It is also useful for inhibiting the growth of tumor cells.
  • the power oyster mushroom strain of the present invention has an antihypertensive action and can improve hypertension.
  • the power oyster mushroom strain of the present invention has an immunomodulatory action, and therefore can contribute to disease prevention and health maintenance by adjusting the immune system in vivo.
  • the force oyster mushroom extract dry mass
  • the force oyster mushroom extract is an adult (60 kg body weight) per day.
  • Chlorella spp. can be preferably used, and in particular, Chlorella pyrenoidaosa can be preferably used.
  • the present invention is not limited to this.
  • basidiomycetes at least one selected from agaritas (Agaricus blazei), mesimacob (Phellinu s linteus), shitake (Lentinus edodes) and cordyceps sinesis power can be preferably used.
  • microalgae and basidiomycetes As for the extraction method of these microalgae and basidiomycetes, it can be carried out by the extraction method of early oyster mushrooms or other known methods. [0025] Some of the above-mentioned microalgae and basidiomycetes have been reported to have antitumor activity, but when used in combination with the power oyster mushroom of the present invention, the activity is higher than when they are used alone. Synergistically improve. Also, a synergistic improvement effect is observed in the platelet aggregation inhibitory action, chemokine gene expression inhibitory action, and antimutagenic action.
  • the mixing ratio of the two is not particularly limited, but the ratio of the power oyster mushroom and Z or its extract to the microalgae, other basidiomycetes and the total amount of these extracts is from 1: 1 to 1 in mass ratio.
  • the range is preferably 25: 1, more preferably 5: 3 to 15: 1.
  • an oral composition is prepared using the power oyster mushroom or extract thereof according to the present invention
  • powders, tablets, capsules, granules, teas, suspending agents, fluid extracts are prepared by conventional methods. , Liquids, syrups and the like.
  • normal formulation carriers such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, flavoring agents, and flavoring agents are used as necessary. be able to. If necessary, apply a coating with an appropriate coating agent.
  • a power oyster extract may be blended with a generally known skin external preparation base.
  • the external preparation for skin of the present invention is usually used for external preparations for skin, such as cosmetics and pharmaceuticals, for example, whitening agents, moisturizers, antioxidants, antiseptics, oily components, ultraviolet absorption. Agents, surfactants, thickeners, alcohols, powder ingredients, coloring materials, fragrances, aqueous ingredients, water, polymer compounds, chelating agents, pH adjusters, vitamins, amino acids, various skin nutrients Can be appropriately blended as necessary.
  • the topical skin preparation can be applied as pharmaceuticals, quasi drugs, and cosmetics, and the dosage forms are ointments, creams, emulsions, lotions, knocks, bath preparations, sheet preparations, mousses, sprays, sticks If it is conventionally used for skin external preparations, it will not be restrict
  • the amount of oyster mushroom compounded in these oral compositions or external skin compositions can be determined appropriately according to the purpose and application, etc., but as a normal oyster mushroom extract (dry mass), 0001% by mass or more. Preferably 0.001 to 20% by weight, Is 0.01 to 10 mass 0/0.
  • the power oyster mushroom strain FERM BP-10633 is a physico-biochemical test and a pharmacological activity test among test strains obtained by the cross breeding method using protoplast technology. It was selected and adopted as the most superior strain (test strain 1) compared to conventional varieties and parent strains.
  • the binuclear mycelium obtained by the general cross breeding method of mushrooms is examined under a microscope. Observed to obtain a plurality of test strains (hybrid strains).
  • the binuclear mycelium was aseptically isolated from the wild power oyster mushroom fruit body B that had grown naturally in the Kikuchi basin in Kumamoto Prefecture.
  • This mycelium was cultured for 7 days in SMY agar medium (containing 1% sucrose, 1% malt extract, 0.4% yeast extract, 2% agar).
  • the obtained mycelium was a cork borer with an inner diameter of 5 mm. I punched it with.
  • This was inoculated into 40 mL of SMY liquid medium (containing 1% sucrose, 1% malt extract, and 0.4% yeast extract) in an lOOmL Erlenmeyer flask. After stationary culture for 7 days, the mycelium was ground with a magnetic stirrer and a stirrer to prepare a mycelium suspension.
  • the mycelium for preparing protoplasts was collected by filtration through a nylon mesh (pore size 10 X 10 m).
  • the obtained mycelium 200 mg was mixed with 2% Novozym—234 (Novo Industry AZS), 0.5% Zymolyase—20T (Seikagaku Corporation), 0.2% Chitinase (Sigma Chemical Co., ) And 0.5 molZL of mannitol dissolved in 0.05 mol / L maleate buffer (pH 6.0), shaken for 1 hour at a shaking width of 40 mm, shaking frequency of 70 Zmin, shaking temperature of 28 ° C. Then, the enzyme treatment (protoplastization treatment) was performed.
  • the treatment solution was filtered through Miracloth (Calbiochem corporation), and the filtrate was centrifuged at 1100 g x 10 minutes.
  • the obtained precipitate (protoplast) was washed three times by repeating the centrifugation operation using 0.05 mol ZL maleic acid buffer (PH 6.0, containing an osmotic pressure regulator) to obtain a purified protoplast.
  • This purified protoplast was cultured on a multi-layered agar medium, and mononuclear hyphae were screened from the regenerated colonies to obtain a hybrid strain (parent strain B1).
  • test method is as follows.
  • Each mycelium was cultured on SMY agar medium for 7 days, and the obtained mycelium was punched with a cork borer having an inner diameter of 5 mm. This was inoculated onto 25 mL of fresh SM Y agar medium dispensed into a petri dish having an inner diameter of 90 mm.
  • the mycelial density is evaluated by “High: + + + +”, “Normal: + + +”, “Low: + +”, and “Very low: +”.
  • the mycelium was inoculated into SMY liquid medium containing ImM veratric acid and cultured for 13 days at a culture temperature of 26 ⁇ 2 ° C and a relative humidity of 80% or higher.
  • the laccase activity (n katZL) of the filtrate was measured using a spectrophotometer by a conventional method (see Journal of the Wood Society, 40 (1), 107-110 (1994), etc.).
  • Table 1 shows the test results.
  • Parent strain A1 and parent strain B1 are mononuclear mycelia obtained as described above.
  • Parent strain A2 and parent strain B2 are binuclear mycelia, and subculture the protozoa that had been isolated from power bracken fruit body A and power bracken fruit body B before creating parent strain A1 and parent strain B1, respectively. It is obtained.
  • Rikiwaratake I and Rikiwaratake II are isolates (binuclear hyphae) obtained from wild-strength Waratatake mushrooms collected in Takasaki, Gunma Prefecture and Okutama-cho, Tokyo, respectively.
  • test strain 1 is superior to parent strains and conventional varieties with higher hyphal growth and physiological functions. But it was very good.
  • Test strain 1 85.6 ⁇ 3.1 ++++ 351 ⁇ 21 1 89.7
  • Test strain 3 85.8 ⁇ 2.1 +++ 297 ⁇ 18 1 55.4
  • 40g of fine powder of dried oyster mushrooms was mixed with 750ml of distilled water and extracted with stirring at 90 ° C for 1-2 hours. Thereafter, the mixture was centrifuged (3000 rpm, 15 minutes), and the collected supernatant was concentrated (about 10 times) with an evaporator. The concentrated solution was frozen at ⁇ 80 ° C. and freeze-dried to recover 3.5 g of a power extract of hot straw mushroom hot water, which was used as a sample for testing.
  • Human blood was centrifuged at 1 lOOrpm for 20 minutes at room temperature to collect platelet-rich plasma (PRP), and then centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to collect platelet poor plasma (PPP).
  • PRP platelet-rich plasma
  • PPP platelet poor plasma
  • the induced aggregation was measured using an aggregometer (manufactured by MCM Hematracer MCM Medical Co., Ltd.). By comparing the maximum aggregation rate of the test sample (the maximum value obtained from the aggregation curve of the test sample with a PPP value of 100) with the maximum aggregation rate of the control, The inhibitory action was evaluated.
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium
  • 10% ushi fetal serum 10% ushi fetal serum
  • test medium To the test medium was added power bracken hot water extract extract powder (dissolved in an appropriate amount of DMSO), DMS o (negative control), or hyidocortisone (positive control). Each 0.01% final concentration of force Waratake hot water extract powder and DMSO (dry weight), the final concentration of Nono id port cortisone was 10 _ 7 M.
  • tumor necrosis factor TNF-a (IngZml), which is known to promote chemokine gene expression, was added and cultured at 37 ° C for 6 hours.
  • RNA was isolated from the cells according to a conventional method, cDNA was synthesized, and the expression level of IL 8 gene was measured by quantitative PCR (TaqMan PCR).
  • GAPDH Denriceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • Human skin fibroblasts can be obtained as a commercial product, for example, from Kurashiki Spinning Co., Ltd.
  • human fibroblasts are cultured according to a conventional method for culturing animal cells.
  • DMEM medium containing 10% ushi fetal serum is particularly preferred.
  • Salmonella TA98 solution His + back mutation, supplemented with DMSO to 5-7% concentration, 7% in the chart below
  • DMSO fetal sulfate
  • Antimutagenicity (%) [(NC—NB) — (NS—NB)] Z (NC—NB) X 100
  • NC Number of colonies when DMSO is obtained instead of sample solution (control)
  • NB Number of colonies when DMSO is obtained instead of sample solution and mutagen (blank)
  • test strain 1 has a very high activity regardless of platelet aggregation inhibitory activity, chemokine (IL 8) gene expression level inhibitory activity, and antimutagenic activity. Compared with other test strains, parent strains and conventional varieties.
  • arachidonic acid and its metabolites leukotrienes, thromboxane and prostaglandins are involved in the development of various inflammatory and allergic skin diseases and rough skin.
  • psoriasis which is an inflammatory abnormal keratotic disease
  • arachidonic acid metabolites are high in the affected epidermis
  • allergic skin diseases such as atopic dermatitis and contact skin
  • arachidonic acid metabolites are also involved in inflammation and eczema.
  • prostaglandins and thromboxanes aggregate platelets, compounds that also inhibit the synthesis of arachidonic acid power into prostaglandins and thromboxanes have an antithrombotic effect, that is, an improvement in blood flow. It is considered a thing.
  • chemokines that control the migration and activation of inflammatory cells are strongly involved in the development of various inflammatory and allergic skin diseases.
  • Chemokine is a generic name for basic proteins with a molecular weight of 8 to: LOkDa heparin-binding, and acts mainly on the migration and activation of various cells involved in inflammation in the living body. Play an important role It is considered a thing.
  • inflammatory cells such as neutrophils and eosinophils migrate and become active at the site of inflammation such as contact dermatitis and atopic dermatitis, and are involved in amplification of inflammation generation.
  • chemokines such as interleukin-8 (IL-8, interleukin-8) are produced from cells such as skin keratinocytes and fibroblasts.
  • psoriasis which is an inflammatory abnormal keratotic disease, is known to have a large amount of IL 8 in the affected skin area.
  • chemokines such as IL 8 are considered effective in improving or preventing these inflammatory or allergic disease symptoms.
  • test strain 1 In order to investigate the safety of the test strain 1 with the highest growth potential, physiological functionality, and activity based on the above tests, an acute toxicity test and a subacute toxicity test were conducted.
  • OECD Guidelines for Toxicity of Chemical Substances (1987) As a sample, the above-described power oyster hot water extract extract powder was used. Single doses were administered at doses of 200, 400, 600, 800 and 2000 mgZkg. Individual observation was performed until 24 days after administration.
  • the doses were 200, 400, 600, 800, and 2000 mgZkg ', and were administered once a day for 28 days.
  • Test strain 1 has been confirmed to be highly safe in acute toxicity studies, even in the case of an oral dose of 2000 mgZkg! .
  • test strain 1 was confirmed to be extremely safe, with no degeneration in the dead individuals and organs even in the oral dose of 2000 mgZkg!
  • Hyde mouth cortisone has a strong action as a chemokine gene expression inhibitor! Even in the above chemokine gene expression suppression test, the gene expression level of Hyde mouth cortisone was as high as 0.13, showing a high suppression effect. However, long-term use of steroid hormones causes side effects such as inflammation, tissue damage, and ulceration. On the other hand, although test strain 1 has a stronger inhibitory effect than Hyde Cortisone, it can be used for a long period of time because it is safe with no side effects.
  • test strain 1 counterculture was performed on parent strain A, parent strain B, and conventional varieties.
  • the homology of both can be easily determined by observing the presence or absence of band lines (zone lines) at the contact surfaces of the opposing fungus cells (colony). The test was conducted as follows.
  • test strain 1 formed a band line for any parent strain and conventional varieties, and thus the homology with them was low, and it was considered that they were different varieties.
  • FIG. 2 shows the results of the pharmacological activity test of a power oyster mushroom extract extract powder prepared by the same method as described above except that the extraction solvent was hydrous ethanol and the extraction temperature was room temperature (25 ° C.). As can be seen from Fig. 2, the highest activity was obtained with hot water extraction. The activity was also observed with hydrous ethanol extraction. In addition, hot water extraction tended to be preferable in terms of the recovery rate of the extracted extract powder.
  • MEM Earl medium glucose-free, multi-layered: INC Biomedicals Inc. 87%, fetal bovine serum (inactivated for 30-60 minutes at 56 ° C: GIBCO) 10%, 2 OOmM gnoretamine A mixed solution (29.23 mg / mL: INC Biomedicals Inc.) 2% and penicillin'streptomycin (10,000 units / mL: GIBCO) 1% was used as a test medium.
  • a solution prepared by diluting force extract of hot water extract (FERM BP-10633) with hot water 1000 times with PBS and sterilizing with an autoclave was used as a sample solution.
  • FERM BP-10633 A solution prepared by diluting force extract of hot water extract (FERM BP-10633) with hot water 1000 times with PBS and sterilizing with an autoclave was used as a sample solution.
  • a solution in which PBS alone was similarly sterilized was used as a control.
  • test medium was dispensed into each 96-well plate by 180 ⁇ L, and sarcoma 180 cancer cell line 10 ⁇ L and sample solution 10 ⁇ L were added.
  • the number of sarcoma 180 cancer cells was 5 ⁇ loScells / well ⁇ OO / z L). Number of cells after standing at 37 ° C, 5% CO for 48 hours
  • mice Twenty-four weeks old female mice were used as test animals. From 5 weeks of age, sarcoma 180 cancer cells were transplanted into the left abdomen of mice at 1 x 10 6 cells Z0. 05 ml and administered in the following 3 groups.
  • Control group Forced oral administration of water (non-administration of power bracken fruit body hot water extract extract powder)
  • 500mgZkg administration group 500mgZkg per day (20mgZ0.2ml per 40g mouse) of 5 weeks-old force-waratake fruiting body hot water extract powder was orally administered daily.
  • tumor growth was significantly suppressed in the test group (administered group) compared to the control group (non-administered group).
  • the power oyster mushroom strain FERM BP-10633 which is effective in the present invention, has very high activity, but it can be used in combination with microalgae and other basidiomycetes for the purpose of further improving the activity. After all, it was examined.
  • Chlorella pyrenoidosa 40 kg and distilled water (750 L) were placed in a chlorella extraction tank, heated to 90 ° C, and extracted for 30 minutes. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation to obtain a chlorella extract. Concentrate this extract to about 45 L (about 18 times) with an evaporator, add 40 kg of
  • shitake extract tank 40 kg of dried shiitake (Lentinus edodes) chips and 750 L of distilled water were placed, heated to 85 ° C, and extracted for 60 minutes. Thereafter, the extract was collected while squeezing with a shitake squeezer, and the supernatant was further collected by centrifugation to obtain a shiitake extract.
  • the chlorella extract 650 L and the shiitake extract 620 L were mixed and concentrated to 70 L with an evaporator. Add 27.5 kg of ⁇ -cyclodextrin and stir with a kneader to dry the drum (drum surface temperature approximately 150 ° C, reaction temperature approximately 90 ° C) until the water content is 5% or less. Dried. The chip-like dried product generated in the dried product was pulverized by a pulverizer to obtain about 40 kg of chlorella shitake extract powder.
  • a drink was prepared according to the following Formulation Examples 1 and 2, and the test was performed in the same manner as described above. As a result, as shown in Table 4, all of the drinks showed very high activity in the platelet aggregation inhibitory action, chemokine gene inhibitory action, and antimutagenic action.
  • Formulation example 2 72.9 0.1 8 82.1 Formulation Example 1
  • Functional drink (Contain the following ingredients in 50 mL of purified water.) Power oyster mushroom (FERM BP-10633) Hot water extract extract powder 200 mg Agaritas hot water extract 10 Shiitake mycelium hot water extract 10 Meshimakob mycelium heat Water extract 20 Cordyceps mycelium hot water extract 10 Chlorella extract 200 Carotec 1.
  • the test was conducted in vivo using spontaneously hypertensive rats (Spontaneously Hypertensive Rat: SHR (4 weeks old), obtained from Japan chili Sliver Co., Ltd.).
  • SHR is 7-15 weeks of age and 100% of individuals develop spontaneous hypertension.
  • the blood pressure averages about 171 mmHg at 10 weeks of age, and the maximum blood pressure reaches about 200 mmHg or more.
  • SHR mice also show abnormal cholesterol metabolism and insulin resistance.
  • the mean systolic blood pressure of the control group (non-administered group) is zero, and the mean systolic blood pressure of the test group (administered group) is plotted.
  • Blood pressure began to decrease more than control at 30 minutes, and blood pressure decreased most at 4 to: LO time after administration. After that, the increase in blood pressure gradually increased, and the increase in power was slow. It took about 48 hours to reach the same blood pressure as the control.
  • FIG. 5 shows changes in mean systolic blood pressure for each week in the control group (non-administration group) and the test group (administration group).
  • control group blood pressure gradually increased with increasing age, and blood pressure exceeded 220 mmHg at 16 weeks of age (11 weeks of administration).
  • test group the blood pressure gradually increased until 8 weeks of age (3 weeks of administration), and then remained stable in the range of 170 to 180 mmHg.
  • test patients were 10 hypertensive patients (7 males and 3 females) whose systolic blood pressure was constantly around 150 to 170 mmZHg.
  • the subjects had a mean systolic blood pressure of 162 mmHg and a mean diastolic blood pressure of 96 mmHg, which were almost the same for 10 days before the start of treatment.
  • the subject patient was orally ingested the drink of Prescription Example 2 once a day for 70 days from the administration start date (day zero).
  • the intake was 50 mL per day (200 mg as a power extract of hot straw mushroom hot water).
  • blood pressure was measured immediately before administration.
  • the patient's blood was collected in a blood collection tube containing a coagulation inhibitor, and the blood renin concentration and blood angiotensin I concentration were also measured based on general laboratory test methods.
  • composition containing power oyster mushroom extract of the present invention lowers the blood pressure of hypertensive patients, but there is very little concern that the blood pressure will be excessively lowered even when chronically ingested.
  • Fig. 7 shows changes in blood renin concentration and blood angiotensin I concentration in the subjects. As the number of administration days increased, renin concentration increased, while angiotensin I concentration decreased. This suggests that blood pressure can be controlled without excessive secretion or excessive suppression of endocrine renin, angiotensin and other hormones.
  • the test patients were 30 healthy adults.
  • the test patient was orally ingested the drink of Formulation Example 2 once a day for one month every day.
  • the intake was 50 mL per day (200 mg as a power extract of hot oyster mushroom extract). Thereafter, intake was stopped for 2 months.
  • blood of the test patient is collected into a blood collection tube containing a blood coagulation inhibitor, and T cells and NK cells based on general laboratory test methods The percentage of immune cells was measured.
  • FIG. 8 shows the number of T cells (%) and the number of NK cells (%) during the administration period (1 month) and the subsequent administration suspension period (2 months).
  • the number of T cells and NK cells both increased as the number of administration days increased.
  • both the number of NK cells and the number of T cells began to decrease, but the decrease was slow, and it took two months to return to the level before the start of administration.
  • the composition containing the oyster mushroom extract has an immunostimulatory effect, and the sustained effect is high by continuous ingestion.
  • further examples of the composition containing the extract of power oyster mushroom (FERM BP-10633) of the present invention are further omitted.

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Abstract

　本発明は、生物学的活性に優れる新規なカワラタケ（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０６３３）であるカワラタケ株を提供する。本カワラタケ株は、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用、抗高血圧作用、免疫調節作用に優れる。さらに、微細藻類や他の担子菌類と組み合わせれば、その作用が相乗的に向上する。本発明のカワラタケ株は安全性が高く、長期の連用によっても副作用を生じる可能性は非常に低く、抗炎症、アレルギー、抗腫瘍、その他の疾病の予防、改善を目的とした飲食物、化粧料、医薬品などに有用である。また、本発明のカワラタケ株は、従来品種に比べて菌糸の成長性や生理的機能が非常に高いので、安定的に利用することができる。

Description

明 細 書
力ワラタケ株及びその抽出物及びその利用
関連出願
[0001] 本出願は、 2005年 7月 28日付け出願の日本国特許出願 2005— 218554号の優 先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。
技術分野
[0002] 本発明は、力ワラタケ株、その抽出物、ならびにその利用に関し、特に血小板凝集 抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗癌作用、抗高血 圧作用などの生物学的活性に優れた力ワラタケ株に関する。
背景技術
[0003] 従来より、キノコ類は食用ば力りでなく薬用にも用いられ、様々な薬効を有するキノ コ類が知られている。そのうち、力ワラタケは漢方では「雲芝（ゥンシ)」と呼ばれ、抗腫 瘍活性があるとされている。また、臨床的にも、力ワラタケ由来の蛋白多糖体力も開発 された抗腫瘍剤（一般名： PSK、商品名：クレスチン)が使用されている。
また、近年では、 TGF- βや PDGFへの選択的結合作用（特許文献 1)、免疫系 未熟期動物への投与による癌や感染症の予防効果 (特許文献 2)、前駆脂肪細胞分 化抑制効果 (特許文献 3)なども報告されて!ヽる。
[0004] し力しながら、力ワラタケの薬効についてその全てが明らかにされたものではなぐ また既知の効果についてもより優れた効果を有する菌株が求められていた。
特許文献 1 :特開平 8— 113540号公報
特許文献 2：特開平 11― 60495号公報
特許文献 3：特開平 2004 - 75640号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は上記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、有用な活 性に非常に優れる新規な力ワラタケ株ならびにその利用について提供することにある 課題を解決するための手段
[0006] 前記目的を達成するために、本発明者らは巿販あるいは野生の力ワラタケについ て交雑育種を重ね鋭意研究を行った結果、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝 子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用、抗高血圧作用、免疫調節作用な どにおいて特に優れる力ワラタケ株を得ることに成功した。また、本発明者らは、この 力ワラタケにさらに微細藻類や他の担子菌類などを組み合わせることにより、その作 用が相乗的に向上することも見出し、本発明を完成するに至った。
[0007] すなわち、本発明に力かる力ワラタケ株は、受託番号力 SFERM BP— 10633であ る力ワラタゲ株である。
本発明の血小板凝集抑制剤、ケモカイン遺伝子発現抑制剤、抗変異原性剤、抗腫 瘍剤、抗高血圧剤、あるいは免疫調節剤は、前記力ワラタケ及び Z又はその抽出物 を有効成分として含む。
また、前記力ワラタケ及び Z又はその抽出物は、飲食物、医薬組成物などの経口 用組成物に配合できる。
また、前記力ワラタケ及び Z又はその抽出物は、化粧料、医薬用外用剤などの皮 膚外用組成物に配合できる。
また、本発明において、前記力ワラタケ及び Z又はその抽出物とともに、さらに微細 藻類及び他の担子菌類及びこれらの抽出物力 なる群力 選ばれる一つ以上を併 用することが好適である。
発明の効果
[0008] 本発明の特定の力ワラタケ及び Z又はその抽出物は、優れた血小板凝集抑制作 用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用、抗高血圧作 用、免疫調節作用を有する。さらに、微細藻類や他の担子菌類などを組み合わせれ ば、その作用が相乗的に向上する。本発明の力ワラタケは安全性が高ぐ長期の連 用によっても副作用を生じる可能性は非常に低ぐ炎症、アレルギー、腫瘍、その他 の疾病の予防、改善を目的とした飲食物、化粧料、医薬品などに有用である。また、 本発明の力ワラタケ株は、従来品種に比べて菌糸の成長性や生理的機能が非常に 高いので、安定的に利用することができる。 図面の簡単な説明
[0009] [図 1]本発明の力ワラタケ株（試験株 1、FERM BP— 10633)、その他の作出雑種 株 (試験株 2〜4)、試験株作出に使用した親株 A及び親株 B、従来品種である力ワラ タケ I及び力ワラタケ Πについて、その子実体熱水抽出物の血小板凝集抑制作用、ケ モカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用を比較した図である（コントロールは DMSO)。
[図 2]本発明の力ワラタケ株 (試験株 1、 FERM BP— 10633)の子実体の熱水抽出 物及び含水エタノール抽出物の血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制 作用、抗変異原性作用を比較した図である（コントロールは DMSO)。
[0010] [図 3]本発明の力ワラタケ株（試験株 1、 FERM BP— 10633)の子実体の熱水抽出 物にクロレラ及び Z又はシィタケ子実体の熱水抽出物を混合した場合の、血小板凝 集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用、抗変異原性作用における相乗効果 を示す図である（コントロールは DMSO)。
[図 4]本発明の力ワラタケ株 (試験株 1、 FERM BP— 10633)の子実体の熱水抽出 物を含有する組成物を SHRに単回投与した後の、コントロール (非投与）に対する収 縮期血圧の経時的変化を示す図である。
[図 5]本発明の力ワラタケ株 (試験株 1、 FERM BP— 10633)の子実体の熱水抽出 物を含有する組成物を SHRに慢性投与した場合と、非投与 (コントロール)の場合の 収縮期血圧の経時的変化を示す図である。
[0011] [図 6]本発明の力ワラタケ株（試験株 1、 FERM BP— 10633)の子実体の熱水抽出 物を含有する組成物を高血圧症患者に慢性投与した場合の (a)拡張期血圧、及び（ b)収縮期血圧の経時的変化を示す図である。
[図 7]本発明の力ワラタケ株 (試験株 1、 FERM BP— 10633)の子実体の熱水抽出 物を含有する組成物を高血圧症患者に慢性投与した場合の (a)血中レニン濃度、及 び (b)血中アンジォテンシン I濃度の経時的変化を示す図である。
[図 8]本発明の力ワラタケ株 (試験株 1、 FERM BP— 10633)の子実体の熱水抽出 物を含有する組成物を 30名の健常人に 1ヶ月間慢性投与し次いで 2ヶ月間投与停 止した場合の、 T細胞数及び NK細胞数の経時的変化を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明で用いる力ワラタケは、サルノコシカケ科（Polyporaceae)力ワラタケ属 (Cor iolus)に属する Trametes versicolor (L. ： Fr. ) Pilatであり、独立行政法人産業 技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、平成 18年 6月 28日に受 託された受託番号 FERM BP— 10633である力ワラタケ株（商標名：タナカヨシホ株 )である。これは、同センターに国内寄託された受託番号 FERM P— 20377 (平成 17年 1月 26日受託)から移管されたものである。何れも本発明者の一人である江口 文陽によって寄託された。
[0013] 本力ワラタケ株は、熊本県に自生していた野生の力ワラタケから、プロトプラストィ匕技 術を利用した交雑育種により得られた新規な力ワラタケ株であり、従来品種や親株に 比べて、菌糸の成長性や生理的機能、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発 現抑制作用、抗変異原性作用、抗腫瘍作用において最も高い活性を有するもので ある。また、抗高血圧作用、免疫抑制作用においても高い活性を有する。本株の作 出方法や選定方法ならびに効果については、実施例に詳細に記載されている。
[0014] 本発明に力かる受託番号 FERM BP— 10633の力ワラタケ株の科学的性質等は 以下の通りである。
1.科学的性質…菌の特徴:炭素源と窒素源を含む栄養培地下において、白色のコ 口-一を形成する。また、光学顕微鏡下において、クランプコネクション (かすがい連 結）が観察される。
2.分類学上の位置…担子菌
[0015] 3.培養条件
(1)培地名 · · 'SMYA培地（S：サッカロース、 M：マルトエキストラタト、 Y：イーストェキ ストラタ K A:寒天）
S, A→巿販品 M, Y→ディフコ社製（Difco)
( 2)培地の組成 · · '培地 1000ml当たり
1% サッカロース （10gに相当）
1% マルトエキストラタト （10gに相当）
0. 4% イーストエキストラタト（ 4gに相当） 2% 寒天 （20gに相当）
(3)培地の ρΗ· ··5. 0〜7. 0 (最適 ρΗ5. 5)
(4)培地の殺菌条件… 121°C 20分
(5)培地温度… 28°C
(6)培養期間… 10日間
(7)酸素要求性…好気性
[0016] 4.保管条件
凍結法にて保管できる。
(1)凍結条件… 80°C
(2)保護剤" · 10〜20%グリセリン水溶液 (最適は 20%)
(3)凍結後の復元率 · · · 1年で 100%、 3年で 99%
5.生存試験の条件
(1)微生物の復元… 40°C
(2)接種 '培養'確認法…培養条件と同一条件による。
[0017] 本発明において、力ワラタケは子実体、該子実体の抽出物、あるいは該抽出物の 乾燥物を用いてもよぐまた、子実体は生のままあるいは乾燥したもののいずれでもよ いが、取り扱い性、保存性及び抽出効率等の点から乾燥子実体が望ましい。有効量 を効率的に摂取するためには、子実体の乾燥粉末あるいはその抽出物を用いること が好適であり、特に抽出物の利用が好ましい。
また、本発明においては、好適には子実体を用いるが、その菌糸体にも効果が期 待できる。菌糸体は炭素源および窒素源を含む培地で種菌を培養して得られる生あ るいは乾燥菌糸体を利用できる。乾燥したものが簡便である。
[0018] 力ワラタケ抽出物を得るに先立ち、力ワラタケの組織を破壊処理することが好適であ る。これによつて効率よく抽出することが出来る。力ワラタケの組織を破壊する手段とし ては、ビーズミル、ワーリンダブレンダー、ホモジナイザー等の各種粉砕混合機による 粉枠処理、爆砕機等による衝撃破砕処理、凍結処理、超音波処理等の物理的処理 、水酸ィ匕ナトリウム等の水溶液によるアルカリ処理、セルラーゼゃぺクチナーゼ等の 細胞壁分解作用のある酵素による処理、浸透圧処理等の化学的処理があり、これら を単独であるいは適宜に組み合わせて行なうことができる。これらの組織破壊処理の うち、力ワラタケの子実体を原料とした場合は粉砕処理または酵素処理が、また菌糸 体を原料とした場合は酵素処理が好適である。
[0019] 酵素処理では、公知の細胞壁分解酵素あるいは多糖分解酵素を利用でき、セルラ ーゼ、へミセノレラーゼ、キチナーゼ、 a一および j8—グノレクロニダーゼ、ぺクチナ一 ゼ、キシラナーゼ、 (X一および |8—ダルカナーゼ等のうちの 1種または 2種以上を用 いることができる。力ワラタケを酵素処理するには、適宜に細断あるいは粉砕処理を 施した力ワラタケに前記酵素を水溶液として加え、振とうある!/、は撹拌すればよ!、。 本発明の力ワラタケ抽出物を得るためには、前述のように組織を破壊処理したカヮ ラタケに、抽出溶媒を加え適宜攪拌し、抽出処理すればよい。
抽出溶媒としては特に限定されず、例えば、水、メタノール、エタノール等の一級ァ ルコール、 1, 3—ブチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール、酢 酸ェチル等の低級アルキルエステル、ベンゼン、へキサン等の炭化水素、ェチルェ 一テル、アセトン等が挙げられ、これらを 2種以上組み合わせて用いることもできる。 好ましい抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、 1, 3—ブチレングリコール又 はこれらの混合溶媒が挙げられる。特に、力ワラタケ子実体乾燥粉末を熱水で抽出し たものが好ましい。
[0020] また、抽出操作は常圧下、常温下で行っても良いが、 1〜5気圧、 60〜150°Cの加 圧、加熱下で行なっても良い。具体的には、例えば、熱水等で抽出した後、遠心分 離や減圧濾過により抽出液と残渣に分離することが好ましい。
なお、抽出残渣に対して前記と同様の条件下再抽出処理を行ない、この抽出操作 を数回繰り返してもよい。
また、抽出物は、抽出液でもその乾燥物でもよい。乾燥物とする場合には、抽出液 を減圧濃縮、殺菌、フリーズドライ、スプレードライ等の処理に供して抽出溶媒を除去 する。
[0021] 力ワラタケの菌糸体の伸長は 27°C付近で最も良好で、子実体発生には 10〜12°C の低温処理が適している。栽培期間は菌糸蔓延に 20〜25日間、続いての子実体発 生に 20日程度を要する。 2. 5kg容量の袋栽培で 200g位の収穫が期待できる。培地 基材のおが屑は大部分の広葉樹が適し、スギでも加水堆積したものは使用可能であ る。
[0022] 本発明の力ワラタケ株は血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制作用に 優れるので、血栓形成の予防'改善、血流改善、炎症性あるいはアレルギー性疾患 の予防'改善などに有用である。また、皮膚外用剤として経皮的に投与すれば炎症 性あるいはアレルギー性の皮膚疾患に対して予防 ·改善効果が期待できる。
[0023] また、本発明の力ワラタケ株は、抗変異原性作用、抗腫瘍作用にも優れる。環境中 には様々な変異原性物質が存在し、これが生体内で DNAを傷つけることが、ガンや その他の疾病の原因の一つであると考えられている。よって、変異原の活性を抑制 することができる本発明の力ワラタケ株はこのような病気の予防に有用である。また、 腫瘍細胞の増殖抑制にも有用である。
また、本発明の力ワラタケ株は、抗高血圧作用を有し、高血圧症を改善することが できる。
また、本発明の力ワラタケ株は、免疫調節作用を有するので、生体内における免疫 系のノ《ランスを整えて疾病予防や健康体維持に寄与することができる。
本発明の力ワラタケ株を、経口により摂取する場合には、個々の状態により異なり特 に限定されるものではないが、力ワラタケ抽出物（乾燥質量）としては、成人（60kg体 重） 1日当たり 0. 001〜lg、さらには 0. 01-0. 5gとすること力 Sできる。
[0024] さらに、本発明の力ワラタケ及び Z又はその抽出物に、微細藻類及び他の担子菌 類及びこれらの抽出物力 選ばれる少なくとも一つを併用することにより、その活性が 相乗的に向上することが明らかとなった。
微細藻類としては、クロレラ属が好適に使用でき、特にクロレラピレノイドーサ (Chlo rella pyrenoidaosa)が好適に使用できる力 これに限定されるものではない。 また、他の担子菌類としては、ァガリタス (Agaricus blazei)、メシマコブ（Phellinu s linteus)、シィタケ (Lentinus edodes)及び冬虫夏草 (Cordyceps sinesis)力 ら選ばれる少なくとも一つが好適に使用できる。
これら微細藻類や担子菌類の抽出方法については、前期力ワラタケの抽出方法あ るいはその他の公知の方法により行うことができる。 [0025] 上記微細藻類や担子菌類には抗腫瘍活性が報告されているものがあるが、本発明 の力ワラタケと併用することにより、それらをそれぞれ単独で用 、た場合に比べてその 活性は相乗的に向上する。また、血小板凝集抑制作用、ケモカイン遺伝子発現抑制 作用、抗変異原性作用においても相乗的向上効果が認められる。
両者の混合比は特に限定されるものではないが、力ワラタケ及び Z又はその抽出 物と、微細藻類、他の担子菌類及びこれら抽出物の合計量との比率は、質量比で 1： 1〜25 : 1、さらには 5 : 3〜15 : 1の範囲が好ましい。
[0026] 本発明の力ワラタケ又はその抽出物を用いて経口用組成物を調製する場合には、 常法により散剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、茶剤、懸濁化剤、流エキス剤、液剤、 シロップ剤等とすることができる。なお、製剤化の際には、通常の製剤化担体、例え ば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、賦香剤等を必要に応 じて用いることができる。また、必要に応じて適当なコーティング剤等で剤皮を施すこ とちでさる。
なお、これらは医薬用途に限らず、機能性食品、健康食品、サプリメントなどとしても 摂取することができる。これらは例えば、ゼリー、キャンディー、グミ、クラッカー、ジュ ース、その他様々な形態で摂取される。
[0027] また、皮膚外用剤とする場合には、通常公知の皮膚外用剤基剤に力ワラタケ抽出 物を配合すればよい。本発明の皮膚外用剤には、上記必須成分以外に、通常化粧 品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止 剤、防腐剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末 成分、色材、香料、水性成分、水、高分子化合物、キレート剤、 pH調整剤、ビタミン 類、アミノ酸類、各種皮膚栄養剤'薬剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
[0028] 皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品として適用可能であり、その剤型は 軟膏、クリーム、乳液、ローション、ノ ック、浴用剤、シート状製剤、ムース、スプレー、 スティック等、従来皮膚外用剤に用いられるものであれば特に制限されない。
これら経口用組成物中あるいは皮膚外用組成物中への力ワラタケ配合量は、目的 や用途などに応じて適宜決定することができるが、通常力ワラタケ抽出物 (乾燥質量） として、組成物中 0. 0001質量％以上とする。好ましくは 0. 001〜20質量％、さらに は 0. 01〜10質量0 /0である。
以下、具体例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな い。
実施例
[0029] I.力ワラタケ株及びその抽出物
本発明に力かる力ワラタケ株 FERM BP— 10633は、下記のように、プロトプラスト 化技術を利用した交雑育種法により得られた試験菌株のうち、生理生化学的試験及 び薬理活性試験お ヽて従来品種や親株に比べて最も優れた株 (試験株 1)として選 択、採用されたものである。
[0030] 1- 1.試験株の作出
下記胞子由来一核菌糸である親株 A1、及びプロトプラスト由来一核菌糸である親 株 B1を用いて、キノコ類の一般的な交雑育種法により得られた二核ィ匕菌糸体を顕微 鏡下で観察し、複数の試験株 (雑種株)を得た。
[0031] (1)胞子由来一核菌糸 (親株 A1)の調製
熊本県菊池巿に自生していた野生の力ワラタケ子実体 Aから、無菌的に胞子（一核 )を採取し、重層寒天培地で培養した。再生した一核菌糸のコロニーを培養し、交雑 用菌株 (親株 A1)とした。培養条件は、 26± 2°C、関係湿度 80%以上で行った。
[0032] (2)プロトプラスト由来一核菌糸 (親株 B1)の調製
熊本県菊池巿に自生していた野生の力ワラタケ子実体 Bから、無菌的に二核菌糸 体を分離した。
この菌糸体を、 SMY寒天培地（1%ショ糖、 1%麦芽抽出物、 0. 4%酵母抽出物、 2%寒天含有)で 7日間培養し、得られた菌糸体を内径 5mmのコルクボーラ一で打 ち抜いた。これを、 lOOmL容三角フラスコに入れた SMY液体培地（1%ショ糖、 1% 麦芽抽出物、 0. 4%酵母抽出物含有) 40mL中に接種した。 7日間静置培養後、菌 糸体をマグネチックスターラーと攪拌子で磨砕し、菌糸体懸濁液を調製した。
この懸濁液 2mLを別の SMY液体培地中に接種して、 3日間毎に継代培養を行い 、プロトプラスト調製用菌糸体を得た。なお、培養条件は 26± 2°C、関係湿度 80%以 上で行った。 [0033] プロトプラスト調製用菌糸体を、ナイロンメッシュ（孔径 10 X 10 m)で濾過、集菌し た。得られた菌糸体 200mg (生重量）を、 2%Novozym—234 (Novo Industry AZS)、0. 5%Zymolyase— 20T (生化学工業株式会社）、 0. 2%Chitinase (Sig ma Chemical Co. , )及び 0. 5molZLのマン-トールを溶解した 0. 05mol/L マレイン酸緩衝液 (pH6. 0) 2mL中に入れ、振盪幅 40mm、振盪回数 70Zmin、振 盪温度 28°Cで 1時間振盪して、酵素処理 (プロトプラスト化処理)を行った。
[0034] この処理液を、ミラクロス (Calbiochem corporation)で濾過し、濾液を 1100g X 10分間遠心分離した。得られた沈殿物（プロトプラスト）を、 0. 05molZLマレイン酸 緩衝液 (PH6. 0、浸透圧調節剤含む）を用い、遠心分離操作の繰り返しにより 3回洗 浄し、精製プロトプラストを得た。
この精製プロトプラストを重層寒天培地で培養し、再生したコロニーから一核菌糸を スクリーニングして、交雑用菌株 (親株 B1)とした。
[0035] 1- 2. 牛理牛化学試験
菌株を安定的に利用するには、菌糸の成長性や生理的機能の高いことが重要であ る。そこでまず、菌糸成長ならびにラッカーゼ活性を指標とするスクリーニングを行つ た。試験方法は、次の通りである。
(1)固体培地での菌糸成長
菌糸体をそれぞれ SMY寒天培地で 7日間培養し、得られた菌糸体を内径 5mmの コルクボーラ一で打ち抜いた。これを、内径 90mmのシャーレに分注した新しい SM Y寒天培地 25mLの上に接種した。培養温度 26± 2°C、関係湿度 80%以上で 8日 間培養を行った後の菌糸体成長量 (mm)と菌糸密度を肉眼で測定した (n= 10)。 菌糸密度は、「高い： + + + +」「普通： + + +」「低い： + +」「極めて低い： +」で評 価し 7こ。
[0036] (2)液体培地での菌糸成長
菌糸体をそれぞれ SMY寒天培地で 7日間培養し、得られた菌糸体を内径 5mmの コルクボーラ一で打ち抜 、た。 lOOmL容三角フラスコに入れた SMY液体培地 40m L中に接種した。培養温度 26± 2°C、関係湿度 80%以上で 21日間静置培養後、予 め恒量を計量した濾紙で菌糸体を濾過集菌した。乾燥機にて乾燥後、菌糸体を含 む濾紙の恒量を計量し、差し引き法によって菌糸体増殖量 (mg)を算出した (n= 10
) o
[0037] (3)ラッカーゼ活性
菌糸体を ImMベラトルム酸 (Veratric acid)を含む SMY液体培地に接種し、培 養温度 26 ± 2°C、関係湿度 80%以上で 13日間培養した。濾液のラッカーゼ活性 (n katZL)を、分光光度計を用いて常法 (木材学会誌， 40 (1) , 107— 110 (1994)等 参照）により測定した。
[0038] (4)結果
試験結果を表 1に示す。
親株 A1及び親株 B1は、上記のようにして得られた一核菌糸である。
親株 A2及び親株 B2は二核菌糸であり、それぞれ、親株 A1及び親株 B1を作出す る前に、力ワラタケ子実体 A及び力ワラタケ子実体 Bから分離しておいた原種菌を継 代して得られたものである。
力ワラタケ I、力ワラタケ IIは、それぞれ群馬県高崎巿、東京都奥多摩町で採取した 野性力ワラタケカゝら得られた分離株（二核菌糸）である。
試験の結果、得られた複数の試験株（表 1には試験株 1〜4のみを示す）の中でも、 特に試験株 1は菌糸の成長性、生理的機能が高ぐ親株や従来品種に比べても非 常に優れていた。
[0039] [表 1]
菌株 菌糸成長 菌糸密度 菌糸成長 ラッカ-ゼ活性
(固体培地、 mm) (固体培地） (液体培地、 mg) (nKat/L)
試験株 1 85.6 ±3.1 ++++ 351 ±21 1 89.7
試験株 2 82.4±2.4 +++ 288±33 147.5
試験株 3 85.8±2.1 +++ 297 ± 18 1 55.4
試験株 4 79.8±6.1 +++ 198±36 1 71.3
親株 A1 71 .6 ±3.6 ++ 158±55 142.3
親株 B 1 61 .3 ±2.9 ++ 207 ±44 138.6
親株 A2 81 .2±3.3 +++ 324±27 1 58.7
親株 B2 80.9 ±2.7 +++ 298±32 1 69.1
力ワラタケ I 83.6 ±3.1 +++ 257 ±35 1 54.2
力ワラタケ II 81 .4±2.8 ++++ 328± 1 7 138.6
[0040] 1- 3.靠¾活件試験
さらに、血小板凝集抑制試験、ケモカイン遺伝子発現抑制試験、抗変異原性試験 を行った。
(1)力ワラタケ熱水抽出エキス末の調製
力ワラタケ乾燥子実体の微粉末 40gを 750mlの蒸留水と混合し、 90°Cで 1〜2時間 攪拌しながら抽出を行った。その後、遠心分離 (3000rpm、 15分)し、回収した上清 をエバポレーターにて濃縮 (約 10倍)した。濃縮液を— 80°Cで凍結させ、凍結乾燥 して力ワラタケ熱水抽出エキス末 3. 5gを回収し、これを試料として試験に供した。 なお、試験株 1〜4の他に、親株である力ワラタケ子実体 A及び力ワラタケ子実体 B 、ならびに力ワラタケ I (群馬県高崎巿産)及び力ワラタケ II (東京都奥多摩町産）の子 実体についても同様に処理して熱水抽出エキス末を調製し、試験に供した。
[0041] (2)血小板凝集抑制試験
ヒト血液を室温にて 1 lOOrpmで 20分間遠心し、多血小板血漿（PRP)を分取した 後、さらに 3000rpmで 5分間遠心して乏血小板血漿（PPP)を分取した。 PRP 223 μ Lを 37°Cにて予備加温した後、力ワラタケ熱水抽出エキス末（2%濃度となるように DMSOに溶解したもの）又はコントロールとして DMSOをそれぞれ 2 μ L添加し、さら に 3分間 37°Cでインキュベートした後、凝集誘発物質であるァラキドン酸ナトリウム水 溶液 (500nM)を 25 μ L添加した。
惹起された凝集はァグリゴメーター（MCMへマトレーサー MCMメディカル株式 会社製)を用いて測定した。被験試料の最大凝集率 (PPPの値を 100として被験試 料の凝集曲線より求められた最大値)をコントロールの最大凝集率と比較することに より、被験物質のァラキドン酸ナトリウム水溶液惹起血小板凝集に対する抑制作用を 評価した。
[0042] (3)ケモカイン遺伝子発現抑制試験
ヒト皮膚線維芽細胞を直径 6cmの培養皿で、 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培 地（ダルベッコ変法イーグル培地）でコンフルェントになるまで培養し、被験培地とし て実験に供した。
被験培地に力ワラタケ熱水抽出エキス末 (適量の DMSOに溶解したもの）、 DMS o(陰性対照）、又はハイド口コルチゾン（陽性対照）を添加した。力ワラタケ熱水抽出 エキス末及び DMSOの終濃度はそれぞれ 0. 01 % (乾燥質量）、ノヽイド口コルチゾン の終濃度は 10_ 7Mであった。
[0043] さらに、ケモカイン遺伝子発現を促進することが知られている腫瘍壊死因子 TNF— a ( IngZml)を添カ卩し、 37°Cで 6時間培養した。
次に常法に従って、細胞から RNAを単離し、 cDNAを合成したのち、定量的 PCR 法 (TaqMan PCR法）により、 IL 8遺伝子の発現量を測定した。なお、内部標準 遺伝子として GAPDH (ダリセルアルデヒド 3リン酸脱水素酵素）遺伝子を用い、得ら れたデータを補正した。
なお、ヒト皮膚線維芽細胞は市販品として入手可能であり、例えば倉敷紡績株式会 社から入手可能である。また、ヒト線維芽細胞の培養は、動物細胞を培養するための 常法に従って行えばょ 、が、 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地が特に好ま 、
[0044] (4)抗変異原性試験
試験管に変異原 (0. 2Mの 2 アミノー 3—メチルイミダゾ (4, 5— f)キノリンを含有 する DMSO溶液) 0. lmL及び力ワラタケ熱水抽出エキス末 (0. 25〜1 %濃度となる ように DMSOで溶解したもの。後記図表においては 1 %) 1. 9mLを混合し、 37°Cで 6時間静置した。
その後、この試験管にサルモネラ TA98株液 (His +復帰変異、 5〜7%濃度となる ように DMSOに添カ卩したもの、後記図表においては 7%) 0. lmL、 S9mixO. 5mL、 及び軟寒天 2mLを加えて混合した。
この混合液 0. 05mLを最小グルコース寒天培地に播種し、 37°Cで 48時間培養し た。増殖したヒスチジン非要求性コロニー数をカウントし、抗変異原性 (％)を次式によ り算出した。
[0045] 抗変異原性 (%)= [ (NC— NB)—（NS— NB) ]Z(NC— NB) X 100
NS：試料液を加えた時のコロニー数
NC：試料液の代わりに DMSOをカ卩えた時のコロニー数（コントロール） NB：試料液と変異原の代わりに DMSOをカ卩えた時のコロニー数（ブランク）
[0046] (5)結果
結果を図 1に示す。図 1からわ力るように、試験株 1は血小板凝集抑制作用、ケモカ イン (IL 8)遺伝子発現量の抑制作用、抗変異原性作用の何れにぉ 、ても非常に 高い活性を有しており、他の試験株や親株、従来品種に比べて非常に優れていた。
[0047] 種々の炎症性 ·アレルギー性皮膚疾患や肌荒れの発症には、ァラキドン酸やその 代謝物であるロイコトリェンゃトロンボキサン、プロスタグランジンが関与して 、ることが 明らかにされつつある。例えば炎症性異常角化性疾患である乾癬では、その患部表 皮にお 、て高 、ァラキドン酸代謝物の存在が認められており、アレルギー性皮膚疾 患であるアトピー性皮膚炎や接触性皮膚炎、湿疹にもァラキドン酸代謝物の関与が 示唆されている。また、プロスタグランジン類やトロンボキサン類は血小板を凝集させ ることから、ァラキドン酸力もプロスタグランジン類やトロンボキサン類への合成を抑制 する化合物は、抗血栓効果、すなわち血流改善効果を有するものと考えられる。
[0048] また、近年、種々の炎症性 ·アレルギー性皮膚疾患の発症に炎症性細胞の遊走- 活性化を支配するケモカイン（Chemotactic Cytokine, Chemokine)が強く関与 することが明らかにされつつある。ケモカインは分子量 8〜： LOkDaのへパリン結合性 を有する塩基性蛋白の総称であり、生体において炎症に関わる様々な細胞の炎症 部位への遊走 ·活性化に中心的に作用し、炎症の惹起に重要な役割を果たして 、る ものと考えられている。
皮膚疾患においては、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎などの炎症部位に好中球 や好酸球などの炎症細胞が遊走'活性化し、炎症の発生'増幅に関与していると考 えられている。そして、この場合に皮膚の角化細胞、線維芽細胞などの細胞からイン ターロイキン 8 (IL-8, interleukin-8)等のケモカインが産生されることが知られ ている。また、炎症性異常角化性疾患である乾癬ではその皮膚患部に IL 8が多量 に存在して 、ることが知られて!/、る。
[0049] 従って、 IL 8等のケモカインの発現を抑制することは、これらの炎症性あるいはァ レルギ一性の疾患症状の改善や予防に有効であると考えられる。
また、環境中には様々な変異原性物質が存在しており、これが生体内で DNAを傷 つけることが、ガンやその他の疾病の原因の一つであると考えられている。よって、変 異原の活性を抑制することができる抗変異原性物質はこのような病気の予防に有用 である。
[0050] I 4.安全件試験
以上の試験により、成長性、生理的機能性、及び活性の最も優れていた試験株 1 の安全性を調べるため、急性毒性試験、亜急性毒性試験を行った。
(1)試験方法
(a)急性毒性
OECD化学物質毒性試験指針（1987)に準拠して、マウスにおける急性経口毒性 試験を行った (n= 10)。試料としては、前記力ワラタケ熱水抽出エキス末を用いた。 投与量は 200、 400、 600、 800及び 2000mgZkgで単回投与を行った。投与後、 24日まで個体観察を行った。
(b)亜急性毒性
OECD化学物質毒性試験指針（1987)に準拠して、マウスによる亜急性毒性試験 (経口投与)も行った (n= 10)。試料としては、前記力ワラタケ熱水抽出エキス末を用 いた。投与量は 200、 400、 600、 800及び 2000mgZkg'曰で、一曰一回、 28曰 間毎日投与を行った。
[0051] (2)結果 (a)急性毒性
試験株 1は、急性毒性試験にお!、て 2000mgZkgの経口投与量にお!ヽても死亡 個体ならびに臓器 '血液における変性は認められず、非常に安全性が高いことが確 f*i¾ れ 。
(b)亜急性毒性
試験株 1は、亜急性毒性試験にぉ 、て 2000mgZkgの経口投与量にお!、ても死 亡個体ならびに臓器 '血液における変性は認められず、非常に安全性が高いことが 確認された。
[0052] 例えば、ケモカイン遺伝子発現抑制剤としてハイド口コルチゾンが強い作用を有す ることが知られて!/、る。上記ケモカイン遺伝子発現抑制試験にぉ 、てもハイド口コル チゾンの遺伝子発現量は 0. 13と高い抑制作用を示した。しかし、ステロイドホルモン は長期連用すると、炎症、組織障害、潰瘍形成等の副作用を引き起こす。これに対し て、試験株 1は抑制効果はハイド口コルチゾンほどではな力つたものの、副作用の心 配がなく安全性が高いので長期連用が可能である。
[0053] I 5. 対峙培着試験
また、試験株 1について、親株 A、親株 B、ならびに従来品種に対してそれぞれ対 畤培養を行った。この試験では、対畤させた両者の菌そう（コロニー）の接触面での 帯線 (ゾーンライン)形成の有無を観察することにより、両者の相同性を簡便に判定 することができる。試験は次のようにして行った。
径 0. 8mm (20メッシュ）のふるいを通過したブナ（Fagus crenata Blume)の木 粉と米糠とを 5： 1 (質量比）の割合で混合し、含水率が 75%となるように水を加えた。 これを長さ 250mm、径 30mmのガラス管の中央に詰め、 120°C、 1. 2気圧の条件で 30分間オートクレープ滅菌した。この木粉培地の両端力ゝら菌株をそれぞれ接種して 、温度 26°C、関係湿度 75%以上の条件で培養した。帯線形成の有無は肉眼で観察 した。
その結果、試験株 1は、何れの親株及び従来品種に対しても帯線を形成し、よって これらとの相同性は低く、異なる品種であると考えられた。
[0054] 以上の結果から、本発明者らはこの試験株 1を選択し、独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センターに国内寄託し (受託番号 FERM P— 20377)、さ らにこれを国際寄託に移管し (受託番号 FERM BP— 10633)、本発明の力ワラタ ケとして採用したものである。
図 2は、抽出溶媒を含水エタノールとし、抽出温度を室温（25°C)とした以外は前記 と同様の方法で力ワラタケ抽出エキス末を調製し、薬理活性試験を行った結果である 。図 2からわ力るように、熱水抽出の場合が最も活性は高力つた力 含水エタノール 抽出でも活性が認められた。また、抽出エキス末の回収率の点でも熱水抽出が好ま しい傾向が認められた。
[0055] 1-6.抗腫瘍試験（in vitro)
さらに、力ワラタケ株 FERM BP— 10633の抗腫瘍作用について、サルコ一マ 18 0培養細胞を用いて試験を行った。
(1)被験培地の調製
MEMアール液体培地（グルタミン不含、重層含： INC Biomedicals Inc. ) 87% 、ゥシ胎児血清（56°Cで 30〜60分間の不活性化処理をしたもの： GIBCO) 10%、 2 OOmMグノレタミン液（29. 23mg/mL :INC Biomedicals Inc. ) 2%、ペニシリン 'ストレプトマイシン（10, 000unit/mL： GIBCO) 1%の割合で添カ卩混合したものを 被験培地として使用した。
[0056] (2)試料液の調製
力ワラタケ（FERM BP— 10633)熱水抽出エキス末を、 PBSで 1000倍希釈し、 オートクレーブにて滅菌処理した溶液を試料液として用いた。コントロールとしては、 PBSのみを同様に滅菌処理した溶液を用いた。
[0057] (3)試験方法
被験培地を 96wellプレートにそれぞれ 180 μ Lづっ分注し、さらにサルコ一マ 180 癌細胞株 10 μ L、及び試料液 10 μ Lを添カ卩した。サルコ一マ 180癌細胞数は、 5 X loScells/well ^OO /z L)であった。 37°C、 5%COで 48時間静置した後、細胞数
2
を計測した。
[0058] (4)結果
結果を表 2に示す。試料液はサルコ一マ 180癌細胞に対して著し 、増殖抑制効果 を発揮した。よって、本発明にかかる力ワラタケ FERM BP— 10633は抗腫瘍作用 を有するものと考えられる。
[0059] [表 2] 細胞数 (ee l I s/we l I )
培養前 培養後 コントロール （P B Sのみ） 5 X 1 0 3 5 . 2 X 1 0 4 1 0 . 4倍
試料液 5 X 1 0 3 1 . 2 1 0 4 2 . 4倍
[0060] 1- 7.抗腫瘍試験（in vivo)
また、力ワラタケ株 FERM BP— 10633のサルコ一マ 180癌細胞に対する増殖抑 制効果を in vivoで試験した。
(1)試験方法
BALBZc— nuZnu (ヌードマウス） 4週齢雌マウス 24個体を供試動物とした。 5週 齢よりマウスの左腹部にサルコ一マ 180癌細胞を l X 106cellsZ0. 05ml移植し、以 下のような 3群に分けて投与を行った。
(i)コントロール群：水を強制経口投与 (力ワラタケ子実体熱水抽出エキス末非投与）
(ii) 50mgZkg投与群：5週齢力も力ワラタケ子実体熱水抽出エキス末を一日当たり 5 Omg/kg (マウス 40g当たり 2mgZ0. 2ml)を毎日強制経口投与。
(iii) 500mgZkg投与群：5週齢力も力ワラタケ子実体熱水抽出エキス末を一日当た り 500mgZkg (マウス 40g当たり 20mgZ0. 2ml)を毎日強制経口投与。
サルコ一マ 180癌細胞移植後、 1週間ごとに腫瘍の体積測定を行った。
[0061] (2)結果
表 3のように、試験群 (投与群)では、コントロール群 (非投与群）に比して、腫瘍の 成長が顕著に抑制された。
[表 3] 腫瘍体積 (mm3)*
第 1週目 第 2週目 第 3週目
279.67±114.97 1608.98±559.22 5254.39 ±1077.34 コント口一ル群
(100%) (100%) (100%)
153.88±55.74 1012.58±220.44 3860.59 ±1046.93
50mg/kg投与群
(55.02%) (62.93%) (73.47%)
110.44±66.07 792.22±400.39 3076.94±989.23
500mg/kg投与群
(39.49%) (49.24%) (58.56%)
*腫瘍体積 (mm3) = (長径） X (短径） 2 X 1/2
[0062] Π.力ワラタケ柚出物含有 成物
上記のように、本発明に力かる力ワラタケ株 FERM BP— 10633は非常に高い活 性を有するものであるが、さらなる活性の向上を目的として、微細藻類や他の担子菌 類との併用につ ヽても検討を行った。
[0063] Π-1. rfn.小板凝暴 ¾ 験、ゲモカイン遣伝^ 街 ΙΙ 験、 ^ M
(1)試験 1
まず、被験試料として、前記力ワラタケ (FERM BP— 10633)熱水抽出物エキス 末、ならびに下記（i)〜（iii)のクロレラエキス末、シィタケエキス末、及びクロレラシイタ ケエキス末を用いて、前記と同様の方法により、血小板凝集抑制試験、ケモカイン遺 伝子発現抑制試験、ならびに抗変異原性試験を行った。
その結果、図 3に示すように、力ワラタケ（FERM BP— 10633)熱水抽出エキス末 に、クロレラ抽出エキス末ある ヽはシィタケ抽出エキス末あるいはクロレラシイタケェキ ス末を併用した場合には、それぞれ単独の場合に比べて、血小板凝集抑制試験作 用、ケモカイン遺伝子抑制作用、抗変異原性作用の相乗的な向上が認められた。特 に、クロレラシィタケエキス末を混合した場合には、その効果が顕著であった。
[0064] (i)クロレラエキス末の調製
クロレラ抽出槽に、クロレラ（Chlorella pyrenoidosa)40kgと蒸留水 750Lを入れ 、 90°Cに昇温後、 30分間抽出を行った。その後、遠心分離により上清を回収して、ク ロレラ抽出液を得た。 この抽出液をエバポレーターにて約 45L (約 18倍)まで濃縮し、これに |8—サイクロ デキストリン 40kgを添加して、エーダーで攪拌しながらドラム乾燥 (ドラム表面温度約 150°C、反応温度約 90°C)により水分含量 5%以下となるまで乾燥した。乾燥物中に 生じたチップ状乾燥物を粉砕機により粉砕し、約 50kgのクロレラエキス末を得た。
[0065] (ii)シィタケエキス末の調製
シィタケ抽出槽に、シィタケ (Lentinus edodes)のチップ状乾燥子実体 40kgと蒸 留水 750Lを入れ、 85°Cに昇温後、 60分間抽出を行った。その後、シィタケ絞り機に て絞りながらエキス分を回収し、これをさらに遠心分離により上清を回収して、シイタ ケ抽出液を得た。
この抽出液をエバポレーターにて約 45L (約 18倍)まで濃縮し、これに |8—サイクロ デキストリン 40kgを添加して、エーダーで攪拌しながらドラム乾燥 (ドラム表面温度約 150°C、反応温度約 90°C)により水分含量 5%以下となるまで乾燥した。乾燥物中に 生じたチップ状乾燥物を粉砕機により粉砕し、約 50kgのシィタケエキス末を得た。
[0066] (iii)クロレラシィタケエキス末の調製
前記クロレラ抽出液 650Lと、前記シィタケ抽出液 620Lとを混合し、エバポレータ 一にて 70Lまで濃縮した。これに、 β—サイクロデキストリン 27. 5kgを添カ卩し、ニー ダ一で攪拌しながらドラム乾燥 (ドラム表面温度約 150°C、反応温度約 90°C)により 水分含量 5%以下となるまで乾燥した。乾燥物中に生じたチップ状乾燥物を粉砕機 により粉砕し、約 40kgのクロレラシィタケエキス末を得た。
[0067] (2)試験 2
さらに、下記処方例 1〜2に従ってドリンク剤も調製し、前記と同様の方法により試験 を行った。その結果、表 4に示すように、何れのドリンク剤も血小板凝集抑制作用、ケ モカイン遺伝子抑制作用、抗変異原性作用において、非常に高い活性を示した。
[0068] [表 4] 血小板凝集 ケモカイン 抗変異原性率
抑制率（％) 遺伝子発現量 (%)
処方例 1 76.3 0.1 7 81 .4
処方例 2 72.9 0.1 8 82.1 処方例 1 機能性ドリンク (下記成分を精製水 50mL中に含む。 ) 力ワラタケ（FERM BP— 10633)熱水抽出エキス末 200mg ァガリタス熱水抽出物 10 シィタケ菌糸体熱水抽出物 10 メシマコブ菌糸体熱水抽出物 20 冬虫夏草菌糸体熱水抽出物 10 クロレラエキス 200 カロテ-ック 1。/0 ( 一力ロチン 1%含有乳液） 50 グリセリン脂肪酸エステル 100 果糖ブドウ糖液糖 5000 ハチミツ 1000 ヒハツエキス末 150 クェン酸 200 ビタミン Β6 10 香料 200 処方例 2 機能性ドリンク (下記成分を精製水 50mL中に含む。 ) 力ワラタケ（FERM BP— 10633)熱水抽出エキス末 200mg ァガリタス熱水抽出物 10 シィタケ菌糸体熱水抽出物 10 メシマコブ菌糸体熱水抽出物 20 冬虫夏草菌糸体熱水抽出物 10 クロレラエキス 200 カロテ-ック 1% ( 一力ロチン 1%含有乳液） 50 グリセリン脂肪酸エステル 100 果糖ブドウ糖液糖 5000 ハチミツ 1000 緑茶抽出物 (カテキン） 500 クェン酸 200 ビタミン B6 10
香料 200
[0071] II 2.抗高血圧作用（SHRモデル）
高血圧自然発症ラット（Spontaneously Hypertensive Rat:SHR(4週齢）、 日 本チヤ一ルスリバ一（株）から入手）を用いて in vivoで試験を行った。 SHRは 7〜15 週齢で 100%の個体が高血圧を自然発症する。その血圧は 10週齢で平均約 171m mHg、最高血圧は約 200mmHg以上に達する。 SHRマウスはコレステロール代謝 異常やインスリン抵抗性も示す。
[0072] (1)単回投与試験
SHR(10週齢、雄）〖こ、力ワラタケ（FERM BP— 10633)熱水抽出エキス末、クロ レラエキス末、またはその 1： 1混合物（質量比）をゾンデを用いてエキス末として 3. 3 mgZkg用量で経口投与し、血圧をモニターした (n= 6)。コントロールには水を投与 した。投与後 8時間の平均収縮期血圧を下記表 5に示す。
表 5のように、各投与群において血圧降下作用が認められ、混合物投与群で血圧 が最も低下した。
[0073] [表 5] 被験試料 平均血圧 （mm H g ) 力ワラタケ熱水抽出エキス末
ク口レラエキス末
1 ： 1混合物
コントロ一ル
[0074] また、 SHR(10週齢、雄）に、前記処方例 2のドリンク剤をゾンデを用いて力ワラタケ 熱水抽出エキス末として 3. 3mgZkg用量で経口投与した。投与開始直前及び投与 後 48時間までの血圧を経時的に測定した (n= 5)。
図 4に、コントロール群 (非投与群)の平均収縮期血圧をゼロとして、試験群 (投与 群）の平均収縮期血圧をプロットした。この結果力 わ力るように、試験群では投与後 30分でコントロールよりも血圧が低下し始め、投与後 4〜： LO時間で血圧は最も低下 した。その後は徐々に血圧が上昇した力 上昇は緩慢で、コントロールと同レベルの 血圧になるまでに約 48時間を要した。
[0075] (2)慢性投与試験
SHR(5週齢、雄）に、前記処方例 2のドリンク剤をゾンデを用いて力ワラタケ熱水抽 出エキス末として 3. 3mgZkg用量で 16週齢まで 11週間、一日一回、毎日経口投 与した。投与開始直前及び各経口投与の直前に、血圧を測定した (n= 5)。
図 5に、コントロール群 (非投与群)及び試験群 (投与群)の 1週間毎の平均収縮期 血圧の変化を示した。コントロール群では週齢の増加とともに血圧が徐々に上昇し、 16週齢（11週間投与）では血圧が 220mmHgを超えた。これに対して、試験群では 8週齢（3週間投与）までは徐々に血圧が上昇した力 その後は 170〜180mmHgの 範囲で安定に推移した。
このことから、本発明の力ワラタケ抽出物含有組成物の継続的な摂取により、高血 圧が改善され、さらには血圧が一定の範囲にコントロールされることが示唆された。
[0076] II 3.杭高血圧作用（ヒト)
さらに、高血圧症患者に対する抗高血圧作用について臨床的に調べた。 (1)試験方法
被験患者は、収縮期血圧が常時 150〜170mmZHg前後の高血圧患者 10名（男 7名、女 3名）であった。被験者の平均収縮期血圧は 162mmHg、平均拡張期血圧 は 96mmHgであり、これらは投与開始前 10日間ほぼ同じであった。
投与開始日（dayゼロ）から 70日間、毎日、一日一回、被験患者に前記処方例 2の ドリンク剤を経口摂取してもらった。摂取量は、 1日に 50mL (力ワラタケ熱水抽出ェキ ス末として 200mg)であった。投与期間中は、投与直前に血圧を測定した。
また、患者の血液を凝固抑制剤入り採血管に採血し、一般的な臨床検査測定法に 基づ ヽて血中レニン濃度、血中アンジォテンシン I濃度も測定した。
[0077] (2)結果
図 6に、投与開始日（dayゼロ）の血圧をゼロとして、（a)拡張期血圧、及び (b)収縮 期血圧の変化を 5日毎にプロットした。収縮期血圧は投与開始 5日目には降下し始 め、 70日目まで徐々に低下する傾向があった。拡張期血圧も投与開始 10日目には 降下し始めたが、 30日目ぐらいからはほとんど低下せずに一定の範囲内で安定に推 移した。
この結果から、本発明の力ワラタケ抽出物含有組成物は高血圧患者の血圧を降下 させるが、慢性的に摂取しても血圧を低下させ過ぎる懸念が非常に少ないことが示 唆された。
また、図 7に、被験者の血中レニン濃度、血中アンジォテンシン I濃度の変化を示し た。投与日数の増加に伴って、レニン濃度は上昇し、一方、アンジォテンシン I濃度 は減少していた。このことから、内分泌におけるレニン、アンジォテンシン及びその他 ホルモンを生体内へ過剰に分泌あるいは過剰に抑制することなく血圧をコントロール できることが示唆された。
[0078] π-4. ^ ^
さらに、免疫調節作用についても調べた。
(1)試験方法
被験患者は、健常な成人 30名であった。被験患者に 1ヶ月間、毎日、一日一回、 前記処方例 2のドリンク剤を経口摂取してもらった。摂取量は、 1日に 50mL (力ワラタ ケ熱水抽出エキス末として 200mg)であった。その後、摂取を 2ヶ月間停止した。 摂取開始前、摂取開始後 10日及び 1ヶ月、摂取停止後 2ヶ月に、被験患者の血液 を血液凝固抑制剤入り採血管に採血し、一般的臨床検査測定法に基づいて T細胞 及び NK細胞の免疫細胞百分率をそれぞれ測定した。
[0079] (2)結果
図 8に、投与期間（1ヶ月間)及びその後の投与停止期間（2ヶ月）の T細胞数 (％)、 NK細胞数 (％)を示した。慢性投与期間中、投与日数の増加に伴って、 T細胞数と NK細胞数は共に増加した。そして、投与停止後は、 NK細胞数と T細胞数は共に低 下し始めたが、その低下は緩慢で、投与開始前のレベルに戻るまでに 2ヶ月を要した このことから、本発明の力ワラタケ抽出物含有組成物に免疫賦活効果があり、継続 的な摂取により効果の持続性が高いことが示唆された。 以下、本発明の力ワラタケ（FERM BP— 10633)の抽出物を含む組成物の例を さらに不す。
処方例 3 クリーム
ステアリン酸 2. 0 質量0 /0
ステアリルアルコール 7. 0
水添ラノリン 2. 0
スクヮラン 5. 0
2—オタチルドデシルアルコール 6. 0
POE (25)セチルエーテル 3. 0
グリセリンモノステアリン酸エステル 2. 0
プロピレングリコール 5. 0
力ワラタケ熱水抽出物 0. 05
亜硫酸水素ナトリウム 0. 03
ェチルパラベン 0. 3
香料 適量
イオン交換水 残余
処方例 4 乳液
マイクロクリスタリンワックス 1. 0 質量
ミツロウ 2. 0
ラノリン 20. 0
流動パラフィン 10. 0
スクヮラン 5. 0
ソノレビタンセスキ才レイン酸エステノレ 4. 0
POE (20)ソルビタンモノォレイン酸エステル 1. 0
プロピレングリコール 7. 0
力ワラタケ熱水抽出物 2. 0
クロレラ熱水抽出物 0. 5
シィタケ熱水抽出物 0. 5 亜硫酸水素ナトリウム 0. 01 ェチルパラベン 0. 3 香料 適量 イオン交換水 残余
[0082] 処方例 5 ジエル
エタノール 10. 0 質量％ ジプロピレングリコール 15. 0
POE (50)ォレイルエーテル 2. 0 カノレボキシビニノレポリマー 1. 0 水酸化ナトリウム 0. 15
Lーァノレギニン 0. 1 力ワラタケ熱水抽出物 7. 0 2 ヒドロキシ 4ーメトキシベンゾフエノン
スルホン酸ナトリウム 0. 05 エチレンジアミンテトラアセテート 'ナトリウム · 2水 0. 05 メチルパラベン 0. 2 香料 適量 イオン交換水 残余
[0083] 処方例 6 ローション
1, 3 ブチレングリコール 5. 0質量0 /0 グリセリン 2. 0 プロピレングリコール 2. 0 ォレイノレアノレコーノレ 0. 1 力ワラタケ熱水抽出物 0. 5 クロレラ熱水抽出物 0. 1 シィタケ熱水抽出物 0. 1 POE (20)ソルビタンモノラウリン酸エステル 0. 5
POE (15)ラウリルエーテル 0. 5 エタノーノレ 10. 0 香料 適重 防腐剤 適量 緩衝剤 適量 イオン交換水 残余
紙面による写し（注意 電子データが原本となります）
[この用紙は、国際出願の一部を構成せず、国際出願の用紙の枚数に算入しない]
Figure imgf000029_0001
差替え用紙（規則 26) 紙面による写し（注意 電子データが原本となります）
[この用紙は、国際出願の一部を構成せず、国際出願の用紙の枚数に算入しない] 国際事務局記入欄
0-5 この用紙が国際事務局に受理された日
0-5-1 権限のある職員
差替え用鉞（麵 26)

Claims

請求の範囲
[I] 受託番号が FERM BP— 10633である力ワラタケ株。
[2] 請求項 1記載の力ワラタケ及び/又はその抽出物を有効成分として含む血小板凝 集抑制剤。
[3] 請求項 1記載の力ワラタケ及び/又はその抽出物を有効成分として含むケモカイン 遺伝子発現抑制剤。
[4] 請求項 1記載の力ワラタケ及び/又はその抽出物を有効成分として含む抗変異原 性剤。
[5] 請求項 1記載の力ワラタケ及び Z又はその抽出物を有効成分として含む抗腫瘍剤
[6] 請求項 1記載の力ワラタケ及ひゾ又はその抽出物を有効成分として含む抗高血圧 剤。
[7] 請求項 1記載の力ワラタケ及び Z又はその抽出物を有効成分として含む免疫調節 剤。
[8] 請求項 1記載の力ワラタケ及び/又はその抽出物を含む経口用組成物。
[9] 請求項 8記載の組成物において、さらに微細藻類及び他の担子菌類及びこれらの 抽出物力 なる群力 選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする経口用組成物。
[10] 請求項 8又は 9記載の組成物からなる飲食物。
[II] 請求項 8又は 9記載の組成物からなる医薬組成物。
[12] 請求項 1記載の力ワラタケ及び/又はその抽出物を含む皮膚外用組成物。
[13] 請求項 12記載の組成物において、さらに微細藻類及ぴ他の担子菌類及びこれら の抽出物からなる群から選ばれる一つ以上を含むことを特徴とする皮膚外用組成物
差替え用紙 1 /7
血凝小板 ί抑制率杭変異原性率、
[図凝異血小板集抑制率抗変原性率、 1]
οοο B血小板國ケモカインロ抗変異原
%
Figure imgf000032_0001
[図 2]
血小板豳ケモカインロ抗変異原
ケモカイン発現量
Figure imgf000032_0002
ケモカ発現量イ
Figure imgf000032_0003
2/7
血小板凝集抑制率抗異原性率変、
[図 3]
豳血小板國ケモカインロ抗変異原
Figure imgf000033_0001
ケモカン発現量イ
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
5 8 9 0 2 3 4 5 6
投 ，始
Figure imgf000036_0001
20 30 40 50 60 20 30 40
(days) (days)
Figure imgf000037_0001
(days) (days)
霸 ( )％1
Figure imgf000038_0001
鹿暴 ( )％ ΉΝ
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