JP6938155B2 - ブタパルボウイルス - Google Patents
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Description
1)PARV4様ウイルス、
2)エリスロウイルス、
3)ボカウイルス、
4)デペンドウイルス、
5)アムドウイルス、
6)パルボウイルス
7)新たに提示されたパルボ・クレード。
a)古典的ブタパルボウイルス1型(PPV1)(パルボウイルス属のメンバー)、
b)ブタパルボウイルス2型(PPV2)(PARV4様ウイルス属のメンバー)、
c)ブタパルボウイルス3型(PPV3;ブタPARV4、ホコウイルスまたはパルテトラウイルスとしても公知)(同様にPARV4様ウイルス属のメンバー)、
d)ブタパルボウイルス4型(PPV4)(新たに提示されたクレードのメンバー)、
e)ブタパルボウイルス5型(PPV5)(同様に、新たに提示されたクレードのメンバー))、
f)ブタボカウイルス(PBoV)(ボカウイルス属のメンバー)。
a)該ウイルスがHBS関連ウイルスであること、および
b)該ウイルスが、カプシドタンパク質(CP)をコードする遺伝子を含むウイルスゲノムを有することを特徴とし、ここで、CP遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号1に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の同一性のレベルを有する。
a)該ウイルスがHBS関連ウイルスであること、および
b)該ウイルスが、非構造タンパク質1(NS1)をコードする遺伝子を含むウイルスゲノムを有することを特徴とし、ここで、NS1遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号3に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の同一性のレベルを有する。
a)該ウイルスがHBS関連ウイルスであること、および
b)該ウイルスが、カプシドタンパク質(CP)をコードする遺伝子と非構造タンパク質1(NS1)をコードする遺伝子とを含むウイルスゲノムを有することを特徴とし、ここで、CP遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号1に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の同一性のレベルを有し、またはNS1遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号3に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の同一性のレベルを有する。
a)該ウイルスがHBS関連ウイルスであること、および
b)該ウイルスが、カプシドタンパク質(CP)をコードする遺伝子と非構造タンパク質1(NS1)をコードする遺伝子とを含むウイルスゲノムを有することを特徴とし、ここで、CP遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号1に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の同一性のレベルを有し、かつ、NS1遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号3に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の同一性のレベルを有する。
a)該ウイルスがHBS関連ウイルスであること、および
b)該ウイルスゲノムDNAが、配列番号5および6に示されているプライマーセットとPCR反応において反応して140+/−10塩基対のPCR産物を与え、または配列番号7および8に示されているプライマーセットとPCR反応において反応して853+/−10塩基対のPCR産物を与えることを特徴とする。
実施例1:サンプルセット1の罹患動物の分析
サンプルセット1の説明
サンプルセット1:17頭の動物、雄16頭/雌1頭のブタ、18〜27週齢。7つの養豚場。2013年7月31日に受領。臨床症状:動物は腹部膨満を急に発症し、それらの何頭かは死亡前に叫び声を上げた。死亡前の数週間の間に症状は認められなかった。最初の症状の観察から死亡までの時間は2〜6時間であった。症状の発現開始の後、動物を感電により安楽死させ、解剖した。器官症状:小腸における異常。出血症状、薄化腸壁、腸内血液含有流体。他の器官においては、肥大し発赤し腫脹したリンパ節以外は異常は認められなかった。図3を参照されたい。器官を−70℃で凍結した。血清を凝固血液から3000×gでの遠心分離により調製し、ついで−70℃で貯蔵した。
ウイルス配列から誘導されたプライマー(表1)を使用するPCRにより、単離DNAをスクリーニングした。Bowl ORF1 774 F/1626Rプライマーセットには58℃、およびBowl Q ORF2 FW/REVプライマーセットには52℃のアニーリング温度での標準的な方法を用いて、PCRを行った。Q−PCRのためのプローブを設計した(表1)。50℃のアニーリング温度での標準的な方法を用いて、Q−PCRを行った。Bio−Rad CFX Manager 2.0を使用してQ−PCRデータを分析した。
サンプルセット2の説明
16頭の動物、雄13頭/雌3頭のブタ、12〜26週齢。7つの養豚場(サンプルセット1と比較して4つの追加的な養豚場)(サンプルセット1+2で合計11個の養豚場)。2013年8月22日に受領。臨床症状:動物は腹部膨満を急に発症し、それらの何頭かは死亡前に叫び声を上げた。死亡前の数週間の間に症状は認められなかった。最初の症状の観察から死亡までの時間は2〜6時間であった。症状の発現開始の後、動物を感電により安楽死させ、解剖した。器官症状:小腸における異常。出血症状、薄化腸壁、腸内血液含有流体。他の器官においては、肥大し発赤し腫脹したリンパ節以外は異常は認められなかった。図3を参照されたい。全てのリンパ節および血液サンプルを試験したわけではなかった。器官を−70℃で凍結した。血清を凝固血液から3000×gでの遠心分離により調製し、ついで−70℃で貯蔵した。
ウイルス配列から誘導されたプライマー(表1)を使用するPCRにより、単離DNAをスクリーニングした。Bowl ORF1 774 F/1626Rプライマーセットには58℃、およびBowl Q ORF2 FW/REVプライマーセットには52℃のアニーリング温度での標準的な方法を用いて、PCRを行った。Q−PCRのためのプローブを設計した(表1)。50℃のアニーリング温度での標準的な方法を用いて、Q−PCRを行った。Bio−Rad CFX Manager 2.0を使用してQ−PCRデータを分析した。
動物材料の調製:
サンプルセット1および2の凍結器官材料および糞便を分析前に−70℃で貯蔵した。全ての操作を氷上で行った。器官を解凍し、ついで組織培養培地内でホモジナイズ(10% w/v)した。ホモジネートを1回、凍結−融解した(−70℃)。ついでホモジネートを遠心分離し、5μm、0.45μmおよび0.22μmフィルター上で濾過して残存組織材料を除去した。濾過されたホモジネートを接種まで−70℃で貯蔵した。
13頭のブタ(雄ブタ5頭/若雌ブタ/ランドレース(Landrace)/高い健康状態/SPF/接種時に12〜14週齢)をStevensbeek(オランダ国)のMSD養豚場において繁殖させ、飼育し、収容した(施設の指針に従い行った)。実施例1に記載されているとおり、接種前に、該動物を血清、糞便、鼻腔内スワブおよび眼スワブにおける該新規パルボウイルスの存在に関してスクリーニングした。1頭の雄動物を対照動物(未感染体)として犠死させた。残りの12頭のブタを3つの別々の群において収容した。
群1:5頭の動物。3頭の動物に接種物Aを投与し、2頭を接触センチネルとして使用した。
群1、2:
血液サンプル、直腸/鼻腔/眼スワブを接種後第−3日、第0日、第7日、第14日、第21日、第28日に採取した(犠死させなかった場合)。直腸/鼻腔内/眼スワブは接種後第3日、第10日、第17日、第24日に採取した(犠死させなかった場合)。
血液サンプル、直腸/鼻腔内/眼スワブを接種後第−4日、第0日、第3日、第6日に採取した(犠死させなかった場合)。
接種:第10日p.i.;第25日p.i.;第31日p.i.;
センチネル:第18日p.i.;第31日p.i.。
接種:第14日p.i.;第29日p.i.(2頭の動物);
センチネル:第22日p.i.。
接種:第4日p.i.(1頭の動物);第7日p.i.(2頭の動物)。
PCR
動物10 サンプルセット2(接種物に使用):
全ての器官が新規パルボウイルスに関して陽性試験結果を示した:糞便、リンパ節、肺、脾臓、腸、腎臓、肝臓。
全ての器官が新規パルボウイルスに関して陽性試験結果を示した:糞便、リンパ節、肺、腎臓、肝臓。
スワブ/血清に関するPCRの結果:表4A−B−C
組織学的検査、PCR分析およびウイルス分離のために器官サンプルを採取した。ウイルス分離のための器官を−70℃で貯蔵した。PCRを用いて肝リンパ節(10% ホモジネート)を分析した。
センチネル 血清−(陰性)(第7日)
スワブ:表4Aを参照されたい。
センチネル 血清−(陰性)(第7日)
スワブ:表4Bを参照されたい。
スワブ:表4BC参照されたい。
剖検の時点で集めた全13頭の動物の肝リンパ節を培地内でホモジナイズした(10%(w/v))。ホモジネートからDNAを単離し、ウイルスの存在をPCRにより分析した。対照リンパ節は新規パルボウイルスに関して陰性であり、全12頭の接種またはセンチネルブタはウイルスに関して陽性であった。
前記のデータに基づいて、該新規パルボウイルスはブタにおいて複製されると結論づけられうる。伝染経路は大抵は直接接触による経口/鼻経路であるが、経口/糞便伝染および空気伝染も除外できない。しかし、糞便中排泄は限定的である。該ウイルスは複数の器官において見出される。実施例1〜3における結果の組合せに基づいて、動物の一部、すなわち、全感染動物の約1〜2%においては、該新規パルボウイルスの感染は血中における該ウイルスの出現(ウイルス血症)の時点周辺で疾患を引き起こすと予想される。糞便における放出は最小であるが、血中にはウイルスは感染の30日後以降も依然として存在する。また、鼻腔内および眼スワブは感染の30日後以降もPCR陽性のままである。実施例3に記載されている感染ブタにおいては出血性腸症候群は観察されなかったが、これは、実施例3において用いた動物が比較的若く、非常に良好な状態であったことと、該疾患の頻度が低い(一般集団において1〜2%)ことに基づけば、当然予想されたことである。それらは、商業的な養豚場の状況におけるブタ以外では、素因性リスク因子を有していなかった。
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Claims (4)
- カプシドタンパク質(CP)の免疫学的に有効な量と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ブタにおける出血性腸症候群(HBS)関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチンであって、前記CPが、そのヌクレオチド配列が配列番号1に示されているCP遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の同一性のレベルを有する遺伝子にコードされる前記ワクチン。
- 少なくとも1つの他のブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスおよび/または該ブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスの少なくとも1つの他の免疫原性成分および/または前記の他の免疫原性成分をコードする遺伝物質を含む、請求項1に記載のワクチン。
- 該ブタ病原性ウイルスまたはブタ病原性微生物が、ブラキスピラ・ヒオジセンテリエ(Brachyspira hyodysenteriae)、アフリカブタコレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ呼吸器および生殖症候群ウイルス(PRRS)、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)、口蹄病ウイルス、伝染胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌(Escherichia coli)、エリシペロ・ルシオパシエ(Erysipelo rhusiopathiae)、ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)およびアクチノバチルス・プルロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)からなる群から選択される、請求項2に記載のワクチン。
- アジュバントを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載のワクチン。
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