JP2017517248A - ブタパルボウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は新規ブタパルボウイルス、該ウイルスのタンパク質ならびに該ウイルスおよびそのタンパク質に基づくワクチンに関する。本発明はまた、該ウイルスの遺伝子を含むＤＮＡ断片、および該ウイルスの遺伝子に基づくＤＮＡワクチンに関する。更に、本発明は該新規ウイルスに対して反応性である抗体、および該ウイルスまたは該ウイルスに対する抗体の検出のための診断試験に関する。【選択図】なし

Description

本発明は新規ブタパルボウイルス、該ウイルスのタンパク質ならびに該ウイルスおよびそのタンパク質に基づくワクチンに関する。本発明はまた、該ウイルスの遺伝子を含むＤＮＡ断片、および該ウイルスの遺伝子に基づくＤＮＡワクチンに関する。更に、本発明は該新規ウイルスに対して反応性である抗体、および該ウイルスまたは該ウイルスに対する抗体の検出のための診断試験に関する。

過去数十年にわたって、世界中で豚肉の消費の著しい増加が見られる。結果として、市場の需要の増大を満たすために、養豚場の数および大きさの増大が見られる。畜産学全般から公知のとおり、互いに接近して生息する多数の動物はあらゆる種類の疾患に罹りやすく、大規模な商業的畜産の時代より前にはほとんど知られていなかった若しくは見られることがなかった又は更には未知であった疾患でさえもそうである。

６０年以上前から知られているブタにおける疾患の１つは出血性腸症候群（ＨＢＳ）である。この疾患は、疾患の原因が明らかでなく、種々の臨床徴候の一貫性が常に完全に明らかだとは限らないため、症候群と称される。ＨＢＳは、稀な爆発的発生において生じる疾患である。急速に成長する４〜６月齢のブタが主に罹患する。ほとんどの場合、該疾患は肥育ブタにおいて認められる。死亡率は様々であるが、ブタは下痢の証拠を伴うことなく急死する^{（１−３）}。１６０００頭を超えるブタに基づくブタ検死データは、ＨＢＳの頻度が２．６６％であることを示した。米国においては、ＨＢＳは成長終了期における全死亡の０．５％〜７％を引き起こすと報告されている^（３）。出血性腸症候群は単一の原因による単一の疾患とみなされるべきではない。ＨＢＳの最も顕著な症状は腸出血であり、しばしば、腸捻転（腸の捻じれ）を伴う。しかし、これらの症状は胃潰瘍および回腸炎の徴候でもあり、このことはＨＢＳの診断を複雑にする。腸全体の回転が生じて、鬱血および血液沈滞を引き起こしうる。腸捻転はＨＢＳ症例の８０％までで認められうる^{（１−３）}。該疾患の他の頻繁に認められる症状は薄い腸壁および腸内の血液含有流体である。ＨＢＳの厳密な病因は不明である。前記のとおり、症候群の病因は単一の原因によるというよりも大概は多因子性である。ストレス、過酷な環境的および管理的側面が一因でありうる。素因には、過酷な運動、取扱い、戦闘、パイリング（ｐｉｌｉｎｇ）または不規則な摂食が含まれうる。ＨＢＳに罹患している動物からクロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が分離されているものの、感染因子（細菌またはウイルス）がＨＢＳを引き起こしうるという決定的な証拠は存在しない^{（１，３）}。ＨＢＳに罹患している動物からの濾過腸内容物を健康な動物に静脈内または経口投与することにより疾患を再現させる試みは失敗した。感染ブタから分離された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）Ａ型の経口接種により疾患を再現させる試みも同様に失敗した。一方、該疾患の頻度は食餌中の抗生物質の投与により或る程度低下しうることが公知である。これは、該疾患が実際に多因子性である、すなわち、例えばストレスおよび１以上の病原体の組合せ効果であるという見解を補強するものである。

この疾患に関連した新規感染因子を提供すること、および該疾患と闘うための又は少なくとも該疾患の死亡率を減少させるためのワクチンを提供することが、本発明の目的である。更に、疾患関連感染因子を検出し特定するための手段を提供することが本発明の目的である。

最近、メキシコにおける疾患の突然発生中に、ＨＢＳと診断されたブタが幾つかの養豚場から集められた。罹患したブタは予め疾患の症状を示しておらず、最初の疾患の徴候の２〜６時間後に急死した。検死に際して、それらのブタは小腸における異常、とりわけ、出血症状、薄化腸壁および腸内血液含有流体を示した。他の器官においては、肥大し腫張した赤みがかったリンパ節が観察された以外は、異常は見出されなかった。

種々の養豚場からの検死罹患ブタからのサンプルがウイルスの存在に関して分析された。驚くべきことに、該動物の７６％において新規ウイルスが見出された。該ウイルスが全ての動物において検出されたわけではないことは、該動物の死亡時から、それらが死後解剖に送られた時点までの間に経過した時間の長さと関係している可能性がある。これは、とりわけ、動物１頭当たりに見出されるウイルスの量に著しいばらつきがあったことから結論づけられうる。該ウイルスが見掛け上は存在しないブタにおいては、これは、ウイルスの存在量がそれらのブタにおいては分析時に検出レベルを下回っていたことによる可能性がある、と本発明者らは考えている。更に、初期ウイルス複製の部位がこの新規ウイルスに関しては知られておらず、したがって、感染後のウイルス複製の主要部位がサンプリングされていなかった可能性がある。

該新規ウイルスはこれらのＨＢＳ診断ブタにおいて検出されたため、該ウイルスを更に、ＨＢＳ関連ウイルスと呼ぶことにする。出血性腸症候群は今や、ＨＢＳに罹患している動物の器官において、該疾患中の或る段階において、以下の臨床症状、すなわち、腸出血、およびしばしばこれに伴う腸捻転、薄化腸壁および腸内血液含有流体と組合された、本発明の新規ウイルスの存在により特徴づけられうる。

該ウイルスゲノムの配列を分析したところ、該新規ウイルスは、パルボウイルス科内のパルボウイルス亜科の最近特定された属に対して比較的低レベルではあるが或る程度の類似性を有することが示された。パルボウイルスは、５０００ヌクレオチドの平均ゲノムサイズおよび直径１８〜２６ｎｍの範囲のサイズを有する線状非分節化一本鎖ＤＮＡウイルスである。該新規ブタパルボウイルスの代表例のほぼ完全長のＤＮＡ配列を配列番号１０に示す。

該新規ウイルスは２つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。６６２アミノ酸からからなる非構造タンパク質１（ＮＳ１）をコードするＯＲＦ１は配列番号１０の０１３４−２１２２位に見出され、１１８９アミノ酸からなるカプシドタンパク質（ＣＰ）をコードするＯＲＦ２は配列番号１０の２１３０−５６９９位に見出される。

カプシドタンパク質をコードする遺伝子であるＯＲＦ２のＤＮＡ配列の一例を配列番号１に示す。配列番号２はカプシドタンパク質のアミノ酸配列を表す。非構造タンパク質ＮＳ１をコードするＯＲＦ１のＤＮＡ配列の一例を配列番号３に示す。配列番号４は非構造タンパク質ＮＳ１のアミノ酸配列を表す。

パルボウイルス亜科は現在、以下の７つの属を含む^（１５）：
１）ＰＡＲＶ４様ウイルス、
２）エリスロウイルス、
３）ボカウイルス、
４）デペンドウイルス、
５）アムドウイルス、
６）パルボウイルス
７）新たに提示されたパルボ・クレード。

現時点では、ブタに感染する以下の６つの異なるパルボウイルスが特定されている：
ａ）古典的ブタパルボウイルス１型（ＰＰＶ１）（パルボウイルス属のメンバー）、
ｂ）ブタパルボウイルス２型（ＰＰＶ２）（ＰＡＲＶ４様ウイルス属のメンバー）、
ｃ）ブタパルボウイルス３型（ＰＰＶ３；ブタＰＡＲＶ４、ホコウイルスまたはパルテトラウイルスとしても公知）（同様にＰＡＲＶ４様ウイルス属のメンバー）、
ｄ）ブタパルボウイルス４型（ＰＰＶ４）（新たに提示されたクレードのメンバー）、
ｅ）ブタパルボウイルス５型（ＰＰＶ５）（同様に、新たに提示されたクレードのメンバー））、
ｆ）ブタボカウイルス（ＰＢｏＶ）（ボカウイルス属のメンバー）。

ＰＰＶ１は、死産、ミイラ化、胚致死および不妊に関連した症候群であるＳＭＥＤＩの原因因子であることが公知である^{（４，５）}。ＰＰＶ２は、単独で疾患を引き起こすことは知られていないが、ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の発生における補因子であると示唆されている^{（６，７）}。ＰＰＶ３も、単独で疾患を引き起こすことは知られていないが、おそらく同様に、ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の発生における補因子である^{（８−１１）}。ＰＰＶ４は最初はブタの肺組織から分離された。該組織はブタサーコウイルスと同時感染しているようであった。それは疾患を引き起こすことが知られておらず、別の病原体により引き起こされる疾患に確実には関連づけられてもいない^{（１２−１４）}。ＰＰＶ５も何らかの症状または病変を引き起こすことは知られておらず、別の病原体により引き起こされる疾患に関連づけられていない^{（１５−１６）}。ブタボカウイルスは、臨床的重要性および病因が未だほとんど明らかにされていない、比較的新しいタイプのブタパルボウイルスである^（１７）。

該新規ウイルスのＯＲＦ１およびＯＲＦ２のアミノ酸配列を使用して、最大尤度法、ポアソン補正モデルおよびブートストラップ解析（５００重複）に基づいて系統樹を作成した。これらの系統樹は、標準的な設定を用いるＭＥＧＡバージョン５（ＭＥＧＡ５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｄｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｋｏｉｃｈｉｒｏ Ｔａｍｕｒａ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇｌｅｎ Ｓｔｅｃｈｅｒ，Ｍａｓａｔｏｓｈｉ ＮｅｉおよびＳｕｄｈｉｒ Ｋｕｍａｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２８（１０）：２７３１−２７３９．２０１１ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｒ１２１ Ａｄｖａｎｃｅ Ａｃｃｅｓｓ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｙ ４，２０１１）を使用して作成した。

ＯＲＦ１の系統樹を図１に示し、ＯＲＦ２の系統樹を図２に示す。ブートストラップサポートの比率はノードにおいて特定されている。距離棒線は部位当たりのヌクレオチド置換の数を示す。

これらの系統樹によると、該新規ブタパルボウイルスはブタパルボウイルス５（ＰＰＶ５）およびブタパルボウイルス４（ＰＰＶ４）にＰＰＶ１、２もしくは３またはボカウイルスより近い。ＮＳ１コード配列およびカプシドタンパク質コード配列は共に、無関係なウイルスであるＰＰＶ４およびＰＰＶ５をも含むパルボウイルス亜科系統樹のその部分において一定の合致を示すことが判明した。この理由により、本発明者らは該新規ウイルスを新規クレードウイルスの群に取りあえず含めることにした。しかし、該新規クレードウイルスの群内でさえも、既存ブタパルボウイルスに対する配列同一性は比較的低い。この理由により、該新規ウイルスはパルボウイルス亜科内の新たな属に属するとさえも考えられる。

配列番号１および３は、本発明のウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質ＮＳ１をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の典型例を示す。これらのタンパク質においては、ＨＢＳ関連ウイルスの個々の代表例の間で自然変異が存在しうると理解されるであろう。例えばカプシドタンパク質配列内の小さな変化を招く遺伝的変異が実際に存在する。これはＮＳ１遺伝子にも同じことが言える。第一に、いわゆる「第２および第３塩基におけるゆらぎ」が存在し、これは、それらがコードするアミノ酸配列においては気づかないヌクレオチド変化が生じうる原因であり、例えば、トリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＧおよびＴＣＣは全てロイシンをコードする。また、本発明の新規ブタパルボウイルスの代表例における僅かな変異はアミノ酸配列においても見られうる。これらの変異は全配列におけるアミノ酸相違によって、または該配列内のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加によって表されうる。生物学的および免疫学的活性を実質的に改変しないアミノ酸置換は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈら，“Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）に記載されている。関連アミノ酸の間のアミノ酸置換、または進化において頻繁に生じた置換としては、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌが挙げられる（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３を参照されたい）。他のアミノ酸置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／ＶａｌおよびＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは迅速かつ高感度なタンパク質比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７，１４３５−１４４１，１９８５）および相同タンパク質間の機能的類似性の決定のための方法を方法を開発した。本発明の典型的な実施形態のそのようなアミノ酸置換ならびに欠失および／または挿入を有する変異は本発明の範囲内である。これは、カプシドタンパク質および非構造タンパク質ＮＳ１が、本発明のブタパルボウイルスの種々の代表例から単離された場合に、本発明のブタパルボウイルスのカプシドタンパク質および非構造タンパク質ＮＳ１に尚も相当する一方で、１００％より有意に低い相同性を有しうる理由を説明するものである。これは、例えばＸｉａｏら^（６）による論文の図１における系統樹において明白に表されており、それにおいては、単一の属内でさえも、高度に関連したパルボウイルスからなるＰＡＲＶ４様ウイルス属が、有意に異なる全体的なゲノムヌクレオチド配列および有意に異なるＮＳ１遺伝子ヌクレオチド配列を有する。

したがって、本発明のウイルスは、とりわけ、パルボウイルス科のパルボウイルス亜科のメンバーである分離されたウイルスとして記載されており、該ウイルスは、
ａ）該ウイルスがＨＢＳ関連ウイルスであること、および
ｂ）該ウイルスが、カプシドタンパク質（ＣＰ）をコードする遺伝子を含むウイルスゲノムを有することを特徴とし、ここで、ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有する。

本発明の目的においては、同一性のレベルは、配列番号１の配列と、同一性のレベルの決定を要するブタパルボウイルスのカプシドタンパク質をコードする対応領域との同一性のレベルとして理解されるべきである。同一性のレベルの決定のための適当なプログラムとしては、「２以上の配列のアライメント」のオプションおよび標準的な設定を用いるＮＣＢＩのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌのヌクレオチドｂｌａｓｔプログラム（ｂｌａｓｔｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）が挙げられる。

本発明の目的においては、分離（単離）は、天然で該ウイルスに伴っている組織からの遊離を意味する。分離されたウイルスの一例は、細胞培養内に存在するウイルスである。

この実施形態の好ましい形態は、配列番号１に示されているカプシドタンパク質のヌクレオチド配列に対して少なくとも８２％、より好ましくは８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順に好ましくなる）の同一性のレベルを有するカプシドタンパク質遺伝子を有するウイルスに関する。

本発明のウイルスを記載するためのもう１つの方法は該ウイルスのＮＳ１遺伝子の配列に関するものである。配列番号３は、本発明のウイルスのＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列の典型例を示す。しかし、前記のとおり、ＮＳ１配列における小さな変化を招く自然変異が見出される。

したがって、本発明のウイルスは、パルボウイルス科のパルボウイルス亜科のメンバーである分離されたウイルスとして記載されることも可能であり、該ウイルスは、
ａ）該ウイルスがＨＢＳ関連ウイルスであること、および
ｂ）該ウイルスが、非構造タンパク質１（ＮＳ１）をコードする遺伝子を含むウイルスゲノムを有することを特徴とし、ここで、ＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有する。

この実施形態の好ましい形態は、配列番号３に示されているＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８２％、より好ましくは８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順に好ましくなる）の同一性のレベルを有するＮＳ１遺伝子を有するそのようなウイルスに関する。

したがって、要約すると、本発明のウイルスは、パルボウイルス科のパルボウイルス亜科のメンバーである分離されたウイルスであり、該ウイルスは、
ａ）該ウイルスがＨＢＳ関連ウイルスであること、および
ｂ）該ウイルスが、カプシドタンパク質（ＣＰ）をコードする遺伝子と非構造タンパク質１（ＮＳ１）をコードする遺伝子とを含むウイルスゲノムを有することを特徴とし、ここで、ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有し、またはＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有する。

この実施形態の好ましい態様は、パルボウイルス科のパルボウイルス亜科のメンバーである分離されたウイルスであり、該ウイルスは、
ａ）該ウイルスがＨＢＳ関連ウイルスであること、および
ｂ）該ウイルスが、カプシドタンパク質（ＣＰ）をコードする遺伝子と非構造タンパク質１（ＮＳ１）をコードする遺伝子とを含むウイルスゲノムを有することを特徴とし、ここで、ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有し、かつ、ＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有する。

本発明のウイルスを特徴づけるための更にもう１つの代替的方法は、本発明のウイルスのカプシドタンパク質遺伝子配列またはＮＳ１遺伝子配列に特異的なプライマーセットを使用するＰＣＲ試験によるものである。配列番号５〜６および配列番号７〜８に配列が示されている２つの異なるプライマーセットを該ウイルスに対するそれらの特異性に関して選択した。該ウイルスのカプシドタンパク質遺伝子と特異的に反応する第１プライマーセット（配列番号５〜６）を使用するＰＣＲ試験は以下の２つのプライマーを使用する：Ｂｏｗｌ Ｑ ＯＲＦ２ ＦＷ：ＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＣおよびＢｏｗｌ Ｑ ＯＲＦ２ ＲＥＶ：ＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＣ。定量的（Ｑ）−ＰＣＲ実験のために、これらの２つのプライマーに加えて、配列番号９に示されているＰＣＲプローブＢｏｗｌ Ｑ ＯＲＦ２ ＰＲＯＢＥ：６ＦＡＭ−ＣＡＣＧＡＧＣＴＡＧＡＧＣＧＴＧＣＴＡＡＡＣＡＧ−ＢＨＱ１を使用する。

第２プライマーセット（配列番号７〜８）を使用するＰＣＲ試験は該ウイルスのＮＳ１遺伝子と特異的に反応し、以下の２つのプライマーを使用する：Ｂｏｗｌ ＯＲＦ１ ７７４ Ｆ：ＴＧＴＴＧＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＴＧＧおよびＢｏｗｌ ＯＲＦ１ １６２６ Ｒ：ＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＧＡＧ。

該試験は実施例に更に詳細に記載されており、標準的なＰＣＲ試験である。

前記のプライマーセットを使用してパルボウイルス科内のパルボウイルス亜科のメンバーを分析する場合、以下のことが言える：第１プライマーセットのＰＣＲ産物の分析が約１４０塩基対のＰＣＲ産物を示す場合、または第２プライマーセットのＰＣＲ産物の分析が約８５３塩基対のＰＣＲ産物を示す場合、これは、分析されたウイルスが本発明のウイルスに属することを明白に示す。単なる一例に過ぎないが、約８５３塩基対のＰＣＲ産物は、８５３＋１０塩基対〜８５３−１０塩基対の長さのＰＣＲ産物である。約１４０塩基対のＰＣＲ産物は１４０＋１０塩基対〜１４０−１０塩基対の長さのＰＣＲ産物である。

したがって、再び、本発明のこの実施形態のもう１つの形態は、パルボウイルス科内のパルボウイルス亜科のメンバーである分離されたウイルスであり、該ウイルスは、
ａ）該ウイルスがＨＢＳ関連ウイルスであること、および
ｂ）該ウイルスゲノムＤＮＡが、配列番号５および６に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して１４０＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与え、または配列番号７および８に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して８５３＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与えることを特徴とする。

この実施形態の好ましい形態は、ウイルスゲノムＤＮＡが、配列番号５および６に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して１４０＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与え、かつ、配列番号７および８に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して８５３＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与える、本発明のウイルスに関する。

この実施形態のより好ましい形態は、該ウイルスが、カプシドタンパク質（ＣＰ）をコードする遺伝子と非構造タンパク質１（ＮＳ１）をコードする遺伝子とを含むウイルスゲノムを有し、ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号１に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有し、またはＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号３に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有し、該ウイルスゲノムＤＮＡが、配列番号５および６に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して１４０＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与え、かつ、配列番号７および８に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して８５３＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与える、本発明のウイルスに関する。

本発明のウイルスは生形態、生弱毒化形態または不活化形態でありうる。

前記のとおり、該ウイルスのＣＰおよびＮＳ１をコードする遺伝子のＤＮＡ配列は今や特徴づけされている。これらの遺伝子の特定は非常に有用である。なぜなら、以下に詳細に説明するとおり、それらは、とりわけ、ＤＮＡワクチンのための基礎として、またはこれらのタンパク質に基づくサブユニットワクチンの製造における使用のために、または診断目的で、今や使用されうるからである。

本発明のもう１つの実施形態は、カプシドタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片であって、その遺伝子が、配列番号１に示されているＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有することを特徴とするＤＮＡ断片に関する。

この実施形態の好ましい形態は、配列番号１に示されているＣＰのヌクレオチド配列に対して少なくとも８２％、より好ましくは８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順に好ましくなる）の同一性のレベルを有する遺伝子を含むそのようなＤＮＡ断片に関する。

再び、本発明のもう１つの実施形態は、ＮＳ１をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片であって、その遺伝子が、配列番号３に示されているＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有することを特徴とするＤＮＡ断片に関する。

この実施形態の好ましい形態は、配列番号３に示されているＮＳ１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８２％、より好ましくは８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順に好ましくなる）の同一性のレベルを有する遺伝子を含むそのようなＤＮＡ断片に関する。

本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明のＣＰをコードするＤＮＡ断片によりコードされることを特徴とするＣＰに関する。本発明のウイルスのそのようなＣＰは非常に好適である。なぜなら、後記のとおり、そられはワクチン、より詳しくはサブユニットワクチンにおける使用に好適であり、そららは、抗体を産生させるために使用可能であり、それらは診断試験を可能にするからである。

この実施形態の好ましい形態は、配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するＣＰに関する。

再び、本発明のもう１つの実施形態は、本発明のＮＳ１をコードするＤＮＡ断片によりコードされることを特徴とするＮＳ１に関する。

本発明のウイルスのそのようなＮＳ１は非常に好適である。なぜなら、とりわけ、それらは、後記のとおり、診断試験を可能にするからである。

この実施形態の好ましい形態は、配列番号４に示されているアミノ酸配列を有するＮＳ１に関する。

ウイルス感染の経過を追跡すること、ならびにＨＢＳに罹患したブタの種々の器官および体液における該新規ウイルスの存在または非存在を分析することが今や初めて可能となったことは本発明の利点の１つである。これは、疾患の進行における、より深い洞察を得るのに役立つ。個々のブタがＨＢＳの十分な臨床徴候を示す前の数週間または更には数日間以内には、異常は全く見出されないことが公知である。最初の症状から動物の死亡までの平均時間は約２〜６時間である。死亡直前に、動物は腹部膨満を患っているようであり、それらの何頭かは死亡前に叫び声を上げる。臨床徴候を示した養豚場の動物を、それらが該疾患で死亡する前に安楽死させた。ＨＢＳブタが集められた種々のメキシコの養豚場では、ＨＢＳの発生率は１〜２％の間で変動した。種々の養豚場から集めた合計３３頭［１８〜２７週齢の１７頭の一群（実施例１）および１２〜２６週齢の１６頭の一群（実施例２）］の安楽死させたＨＢＳ診断動物を分析した。前記のプライマーセットでのＰＣＲ反応は、群１においては、１４個中５個の血清（３個の血清は収集に含まれていなかった）が該ウイルスに関して陽性であることが判明し、１個の直腸スワブが陽性であることが判明した。合計８個の全血サンプルが陽性であることが判明し、１５個中１２個のリンパ節が陽性であることが判明した。群２においては、１６個中５個の血清が該ウイルスに関して陽性であり、１個の直腸スワブが陽性であることが判明した。各群の代表的動物（群１の動物２、群２の動物１０）からの器官を該ウイルスの存在に関して分析した。リンパ節、肺、脾臓、腸、腎臓および肝臓を含む全てのサンプリングされた器官ならびに糞便が該ウイルスに関して陽性の試験結果を示すことが判明した。

健康なブタに該新規ウイルスを感染させること、およびウイルス感染の経路を調べることが今や可能となったことは本発明のもう１つの利点である。この目的のために、ＨＢＳ動物からの器官物質および糞便を組織培養培地内でホモジナイズした。ホモジネートを１回（−７０℃）凍結−融解させ、遠心分離し、５μｍ、０．４５μｍおよび０．２２μｍのフィルター上で濾過して残存組織物質を除去した。接種物Ａは代表的動物の以下の物質から構成されるものであった：群２の動物１０の糞便、リンパ節、肺、脾臓および腸。接種物Ｂは別の代表的動物の以下の物質から構成されるものであった：群１の動物２の糞便、リンパ節、肺、腎臓および肝臓。これらの実験の全詳細を後記実施例（実施例３）に示す。

接種物（ＡまたはＢ）を４×２ｍＬのＩＭ用量および２０ｍｌの経口用量として合計４頭の雄ブタおよび８頭の若雌ブタ（ランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）／高い健康状態／ＳＰＦ）（接種時に１２〜１４週齢）に以下のとおりに投与した。群１：５頭の動物；そのうちの３頭の動物には接種物Ａを投与し、２頭を接触センチネル（ｃｏｎｔａｃｔ ｓｅｎｔｉｎｅｌ）として使用した。群２：４頭の動物；そのうちの３頭の動物には接種物Ｂを投与し、１頭を接触センチネルとして使用した。群３：３頭の動物；それら全てに接種物Ｂを投与した。１頭の動物（雄）を接種前に犠死させ、陰性対照として使用した。接種前に血清、糞便、鼻腔スワブおよび眼スワブにおける該新規ウイルスの存在に関して該動物をスクリーニングした。血液サンプル、直腸／鼻腔／眼スワブを種々の時点で採取した。該動物実験の全詳細を後記実施例に記載する。

接種動物６頭中６頭で、血清ならびに直腸、鼻腔および眼スワブにおいて接種の７日後に該ウイルスが検出されうることが判明した。３頭の未接種動物（センチネル）の全てにおいて、その他の動物の接種の１４日後に血清において該ウイルスが検出可能であった。全てのセンチネル動物の直腸／鼻腔および眼スワブは接種の７日後に陽性であった（実施例３、群１、２）。接種の３日後の接種動物の血清の３個中３個において、ウイルスが検出された（実施例３、群３）。したがって、ＨＢＳの頻度は比較的低いと報告されているのは事実だが、該ウイルスの高い伝染性とその高い感染速度とを組合せて考慮すると、ＨＢＳが生じる養豚場のブタの全てではなくても大部分は該ウイルスによる感染を経験すると予想されうる。したがって、ＨＢＳが生じる養豚場の全ての動物を、本発明のＨＢＳ関連ブタパルボウイルスによる感染に対してワクチン接種することが非常に望ましい。そのようなワクチン接種は該多因子性症候群の少なくともウイルス成分を根絶するであろう。そしてこれは該疾患を予防し、または少なくとも該疾患の重症度を低減するであろう。

また、該新規ブタパルボウイルスが今や分離され、ＨＢＳに関連づけられたため、該ウイルスおよび／または該ウイルスの防御サブユニットがワクチン接種目的のための出発物質として使用可能となったことも、本発明の利点の１つである。

したがって、本発明のもう１つの実施形態は、ブタにおけるＨＢＳと闘うためのワクチンであって、本発明のウイルスと医薬上許容される担体とを含むワクチンに関する。

本発明のワクチンにおける使用に適した医薬上許容される担体の例としては、無菌水、食塩水、水性バッファー、例えばＰＢＳなどが挙げられる。また、本発明のワクチンは後記の他の添加剤、例えば補助剤、安定剤、抗酸化剤などを含みうる。

この点における闘いは広義に解釈されるべきであり、ＨＢＳとの闘いは、該疾患の徴候を予防するためのワクチン接種、および該疾患の徴候を低減するためのワクチン接種（前記のとおり）を含むとみなされる。該症候群に未だ罹患していない感染動物において該ウイルスが検出された場合の治療用ワクチン接種も、もちろん同様に有効である。最初の臨床徴候から死亡までの時間が非常に短いことを考慮すると、該症候群が診断された後の治療用ワクチン接種は有効でないであろう。

本発明のワクチンは弱毒化生形態または不活化形態の本発明のウイルスを含みうる。弱毒化生ウイルスワクチン、すなわち、生弱毒化形態の本発明のウイルスを含むワクチンは、感染の自然様態を最良に模倣しているため、不活化ワクチンより優れた利点を有する。また、その複製能は少量のウイルスでのワクチン接種を可能にし、その数は、それが免疫系の惹起レベルに達するまで自然に増加する。その瞬間から、免疫系が惹起され、最終的には該ウイルスを排除する。

生弱毒化ウイルスは、野外から分離されたウイルスと比較して低減した毒性レベルを有するウイルスである。低減した毒性レベルを有するウイルスは、ＨＢＳに関与する他の因子と組合された場合でさえもブタにおいて致死を誘発しないウイルスとみなされる。

したがって、本発明のこの実施形態の好ましい形態の１つは、生弱毒化形態である本発明のウイルスを含むワクチンに関する。

弱毒化ウイルスは、例えば、突然変異誘発物質の存在下で本発明のウイルスを増殖させ、ついで、後代レベルおよび／または複製速度の低下を示すウイルスを選択することにより得られうる。多数のそのような物質が当技術分野で公知である。もう１つの非常に頻繁に用いられる方法はインビトロ連続継代である。その後、ウイルスは、連続継代に使用された細胞系に馴化して、それは、ワクチンとして再び自然宿主に与えられた場合に弱毒化様態で挙動する。弱毒化ウイルスを得るための更にもう１つの方法は、その自然生息環境の温度から逸脱した温度で、それを増殖に付すことである。温度感受性突然変異体（Ｔｓ突然変異体）のための選択方法は当技術分野でよく知られている。そのような方法は、突然変異誘発物質の存在下でウイルスを増殖させ、ついで準最適温度および最適温度でそれを増殖させ、細胞層上で後代ウイルスを力価測定し、最適温度でより遅く増殖するプラークを視覚的に選択することを含む。そのような小さなプラークは、増殖の遅い、従って所望の生弱毒化ウイルスを含む。

ブタパルボウイルス型ＰＰＶと闘うための生弱毒化ワクチンは、とりわけ、Ｐａｕｌ ＆ Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ^（３２）、Ｐａｕｌ ＆ Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ^（３３）およびＦｕｊｉｓａｋｉ ＆ Ｍｕｒａｋａｍｉ^（３４）により記載されている。

しかし、生弱毒化ウイルスの使用の考えられうる欠点は、本質的に或るレベルの毒性が残ることであろう。毒性のレベルが許容されうる限り、すなわち、ワクチンがブタの死亡を少なくとも予防する限り、これは真の欠点ではない。もちろん、生弱毒化ワクチンの残留毒性が低ければ低いほど、ワクチン接種がワクチン接種の途中／後の体重増加に及ぼす影響は小さくなる。

不活化ワクチンは、生弱毒化対応物とは対照的に、本質的に安全である。なぜなら、残留毒性が残らないからである。それは通常、生弱毒化ワクチンより幾らか高いウイルス用量を含むにもかかわらず、例えば、他の疾患に既に罹患しているブタにおけるワクチンの好ましい形態でありうる。準最適条件下（例えば、不完全な栄養または準最適な収容）に維持されているブタも不活化ワクチンから利益を受けるであろう。

したがって、この実施形態のもう１つの好ましい形態は、不活化形態である本発明のウイルスを含むワクチンに関する。全不活化パルボウイルスは全般的に、それがブタまたはイヌパルボウイルスである場合、ワクチンのための非常に有効かつ安全な基礎となることが公知である。一例に過ぎないが、ＭＳＤ ＡＨ（Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、商業的に入手可能な不活化ブタパルボウイルス型ＰＰＶワクチンであるＰｏｒｃｉｌｉｓ Ｐａｒｖｏを製造している。Ｈｉｐｒａ（Ｓｐａｉｎ）も、商業的に入手可能な不活化ブタパルボウイルス型ＰＰＶワクチンであるＰＡＲＶＯＳＵＩＮ（登録商標）ＭＲ／ＡＤを製造している。Ｚｏｅｔｉｓは、不活化イヌパルボウイルスであるＰＡＲＶＡＣ、および不活化ブタパルボウイルス型ＰＰＶワクチンであるブタＰＡＲＶＡＣを製造している。Ｎｏｖａｒｔｉｓは米国特許ＵＳ４１９３９９１においてパルボウイルスの不活化のための方法を提供している。そのような不活化全ウイルスワクチンは本発明の新規ブタパルボウイルスの場合でも同様に製造されうる。公知パルボウイルスワクチンの場合と同様に、該製造は、基本的に、感受性ブタ細胞上で該新規パルボウイルスを増殖させ、該ウイルスを集め、該ウイルスを不活化し、該不活化ウイルスを医薬上許容される担体と混合する工程を含む。不活化の標準的な方法はホルムアルデヒドでの古典的な処理である。不活化のための当技術分野でよく知られた他の方法としては、ＵＶ照射、ガンマ線照射、二成分エチレン−イミン、チメロサールなどでの処理が挙げられる。これらの方法の適用方法は当業者に公知である。好ましくは、該ウイルスはβ−プロピオラクトン、グルタルアルデヒド、エチレン−イミンまたはホルムアルデヒドで不活化される。言うまでもなく、該ウイルスを不活化する他の方法も本発明において用いられる。

前記のとおり、該ウイルスを感受性ブタ細胞または細胞系上の細胞培養内で増殖させることが可能である。

したがって、本発明のもう１つの実施形態は、本発明のＨＢＳ関連ブタパルボウイルスを含む細胞培養に関する。細胞および細胞系の例としては、ＳＫ６、ＰＫ１５、初代または不死化ブタ腎臓細胞、初代または不死化ブタ肺胞マクロファージが挙げられる。実際に、該新規ブタパルボウイルスの全ウイルスゲノムは今や決定されており、該新規ウイルスの代表例のＤＮＡ配列が配列番号１０に示されている。該ゲノムの逆位末端反復（ＩＴＲ）はここには示されていない。名称が示すとおりパルボウイルスは公知の最小ウイルスに属するため、本発明のパルボウイルスをコードする全ｓｓ−ＤＮＡは合成的に容易に製造されうる。この理由により、パルボウイルスは、ウイルスＤＮＡを出発物質として使用してインビボで容易に製造されうる。例えば、とりわけＱｉｕら^（３７）およびＷａｎｇら^（３８）に記載されているような他の公知パルボウイルスのゲノムの逆位末端反復（ＩＴＲ）が、配列番号１０に示されているウイルスゲノムを完全なものにするために使用されうる。ＩＴＲはウイルスゲノムの複製において役割を果たしているに過ぎず、したがって、それは免疫学の観点からは重要ではない。したがって、本発明のウイルスの製造の目的のためには、ＩＴＲは交換可能である。プラスミド、例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ内への完全長パルボウイルスＤＮＡのクローニング、およびそれに続く、該新規ブタパルボウイルスをコードする発現プラスミドでのブタ細胞のトランスフェクションによる全パルボウイルスの産生は、とりわけ、Ｑｉｕら^（３７）およびＷａｎｇら^（３８）に記載されている。許容性細胞系、例えばＳＫ６、ＰＫ１５、初代または不死化ブタ腎細胞、初代または不死化ブタ肺胞マクロファージがこの目的に好ましい細胞系であろう。それでも、所望により、非許容性細胞系も使用可能であり、該新規パルボウイルスのゲノムは、とりわけ、Ｇｕａｎら^（３９）に記載されているとおり、アデノウイルス遺伝子の補助により非許容細胞内で複製されうる。

全不活化パルボウイルスはワクチンのための良好な基礎となるが、その産生は、とりわけ、使用される宿主細胞のタイプ、基質および使用される細胞培養培地に応じて、高い費用を要しうる。パルボウイルスの特定の場合においては、全ウイルスの使用の魅力的な代替手段は、パルボウイルスＣＰサブユニット、より好ましくは、いわゆる中空カプシドの形態のサブユニットの使用である。そのような中空カプシドは、基本的には、パルボウイルスゲノムを含まないウイルス様粒子である。結果として、パルボウイルス中空カプシド粒子はワクチンにおける使用の前に不活化される必要がなく、したがって、それは、本質的に安全であるという追加的な利点を有する。中空カプシドは、適当な発現系においてカプシドタンパク質をコードするＯＲＦ２の単なる発現により得られうる。そのようにして形成されたカプシドタンパク質は中空ウイルス粒子へと自己集合する。パルボウイルス中空カプシドは容易に大量に製造可能であり、それは高免疫原性である。パルボウイルス中空カプシドを製造するために現在使用されている大部分の発現系は、バキュロウイルスに基づく発現系である。

バキュロウイルスに基づく発現系における高免疫原性パルボウイルス中空カプシドの製造方法は、例えば、ブタパルボウイルス型ＰＰＶに関しては、Ｍａｒｔｉｎｅｚ^（１８）、Ｃａｓａｌ^（１９）、Ｚｈｏｕら^（２０）およびＨａｏ Ｆｅｎｇ^（２１）に記載されている。他のパルボウイルスに関しては、そのような方法は例えばＳａｌｉｋｉ^（２２）およびＢｒｏｗｎ^（２３）に記載されている。更に、バキュロウイルス発現系およびバキュロウイルス発現ベクターの全般的なことは例えばＯ‘Ｒｅｉｌｌｙら（２４）およびＭｕｒｈａｍｍｅｒ（２５）によるテキストに詳細に記載されている。

また、バキュロウイルスに基づく発現系は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２００８，ＵＳＡから商業的に入手可能である。

バキュロウイルスに基づく発現系の代替手段は、酵母に基づく発現系である。酵母発現系は例えばＧｅｌｌｉｓｓｅｎら^（２９）に記載されている。そのまま使用できる発現系は、とりわけ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，５２１０ Ｅａｓｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｃｉｒｃｌｅ，Ｓｕｉｔｅ ２４０，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ ８５７１１−４４１０ ＵＳＡから商業的に入手可能である。酵母および昆虫細胞発現系はＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７，ＵＳＡからも商業的に入手可能である。

カプシドタンパク質の発現は、もちろん、当技術分野で公知の哺乳類細胞に基づく発現系においても可能であるが、これらの系は大抵は、バキュロウイルスに基づく発現系と比較して、使用するのに高い経費を要するであろう。

したがって、この実施形態のもう１つの形態は、本発明のカプシドタンパク質の免疫学的に有効な量と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ブタにおけるＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチンに関する。

この実施形態の好ましい形態は、ブタにおけるＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチンに関するものであり、該ワクチンは中空カプシドの形態の本発明のカプシドタンパク質の免疫学的に有効な量を含む。

ワクチン中の中空カプシドの量および投与経路は不活化全ウイルス粒子の場合と同等であろう。なぜなら、該カプシドの免疫原性および類似性の点で、それは不活化全ウイルス粒子と同等だからである。

通常、１〜１００μｇの量の該新規パルボウイルス中空カプシドがワクチン用量として非常に好適であろう。経費の観点からは、好ましい量は中空カプシド１〜５０μｇの範囲、より好ましくは１〜２５μｇの範囲であろう。Ｃａｓａｌ^（１９）は、通常のアジュバントの存在下の僅か１〜３μｇのイヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルスの用量が共に、該疾患に対する対応宿主における全体的防御をもたらすと記載している。

不活化全ウイルスまたは中空カプシドに基づく本発明のワクチンは、好ましくは、アジュバントを含む。当技術分野でよく知られた通常のアジュバントとしては、例えば、フロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロック重合体、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ Ａ^（Ｒ）、鉱油、例えばＢａｙｏｌ^（Ｒ）またはＭａｒｋｏｌ^（Ｒ）、植物油およびＣａｒｂｏｐｏｌ^（Ｒ）（ホモポリマー）またはＤｉｌｕｖａｃ^（Ｒ） Ｆｏｒｔｅが挙げられる。該ワクチンは、いわゆる「ビヒクル」をも含みうる。ビヒクルは、該ポリペプチドに、それに共有結合することなく付着する化合物である。頻繁に使用されるビヒクル化合物としては、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、シリカ、カオリンおよびベントナイトが挙げられる。

Ｃａｓａｌ^（１９）は、とりわけ、水酸化アルミニウムおよびＱｕｉｌｌ Ａを彼のパルボウイルスワクチンにおいて成功裏に使用した。

原則として、本発明のワクチンは１回だけ投与されうる。しかし、特に不活化ワクチンの場合には、それが全ウイルスまたは中空カプシドワクチンのいずれである場合も、好ましくは、第１の、そして恐らくは第２のブースター（追加）ワクチン接種を行う。第１ブースターは通常、初回ワクチン接種の少なくとも２週間後に投与されるであろう。ブースターワクチン接種のための非常に好適な時機は初回ワクチン接種の３〜１６週間後である。第２ブースターは、必要に応じて、通常、第１ブースターの４〜５０週間後に投与されるであろう。

不活化全ウイルスワクチンアプローチおよび中空カプシドワクチンアプローチの代替手段は、対応宿主動物がブタである生組換え非パルボウイルスベクターを該新規ブタパルボウイルスカプシドタンパク質遺伝子の担体として使用することである。対応宿主動物がブタである好適な組換え非パルボウイルスベクターのうち、以下の２つのベクターが特に担体として適している：仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）およびブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）。ワクチンにおけるそのような組換えウイルスの使用は、ワクチン接種動物がＰＲＶとＰＰＶとの両方またはＣＳＦＶとＰＰＶとの両方に対して同時にワクチン接種されるという追加的な利点を有する。

Ｃｈｅｎら^（２７）は、ブタパルボウイルス型ＰＰＶカプシドタンパク質を発現する生弱毒化ＰＲＶ組換えベクターの構築および使用を記載している。このＰＲＶ組換え体を５×１０^５ ＴＣＩＤ_５０の量で８日齢の子ブタに投与したところ、ワクチンのこの量は安全であることが判明し、ＰＲＶとＰＰＶとの両方に対する優れた免疫を付与した。

生弱毒化ＣＳＦＶベクターも生組換えベクターとして非常に適している。一例に過ぎないが、Ｎ^ｐｒｏ遺伝子が欠失している生弱毒化ＣＳＦＶがＭａｙｅｒら^（２８）に記載されている。そのような生弱毒化ウイルスは、とりわけ、Ｎ^ｐｒｏ遺伝子の欠失の部位において、カプシドタンパク質をコードする遺伝子の挿入を可能にする。そのような生組換えＣＳＦＶベクターは同様に該新規ブタパルボウイルスカプシドタンパク質遺伝子のための好適な担体を構成する。

該カプシドタンパク質遺伝子の発現は、哺乳類細胞内で機能的であるいずれかの適当な異種プロモーター（後記を参照された）の制御下でもたらされうる。異種プロモーターは、本発明の新規ブタパルボウイルスの野生型形態におけるＣＰ遺伝子の転写を引き起こすプロモーターではないプロモーターである。それは、本発明のパルボウイルスに属さない別のパルボウイルスのＣＰまたはＮＳ１の転写を引き起こすパルボウイルスプロモーターでありうる。あるいは、それは非パルボウイルスプロモーターでありうる。

したがって、本発明のもう１つの実施形態は、本発明のＣＰをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片であって、該遺伝子が機能的異種プロモーターの制御下にあることを特徴とするＤＮＡ断片に関する。

Ｃｈｅｎら^（２７）は、カプシドタンパク質遺伝子の発現を駆動するためにＣＭＶプロモーターを利用したが、哺乳類細胞において機能的な他の適当なプロモーターが当技術分野において公知である。哺乳類細胞において機能的であるプロモーターは、哺乳類細胞において該プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写を駆動しうるプロモーターである。哺乳類細胞において機能的である適当なプロモーターの例には、古典的プロモーター、例えば（ヒト）サイトメガロウイルス最初期プロモーター（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．ら，ＰＮＡＳ ９０，１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ＲＳＶ、Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ら，ＰＮＡＳ ７９，６７７７−６７８１，１９８２；Ｆｙｎａｎら，前掲；Ｕｌｍｅｒら，前掲）、ＭＰＳＶ ＬＴＲ（Ｓｔａｃｅｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５０，７２５−７３２，１９８４）、ＳＶ４０最初期プロモーター（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｊ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５，７７３，１９８３）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主要後期プロモーターおよびβ−アクチンプロモーター（Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３５６，１５２−１５４，１９９２）が含まれる。調節配列にはターミネーターおよびポリアデニル化配列も含まれうる。使用可能な配列としては、よく知られたウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ターミネーターおよびポリアデニル化配列が挙げられる。

したがって、この実施形態のもう１つの形態は、機能的プロモーターの制御下で本発明のＣＰをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む生組換え非パルボウイルスベクターと医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ブタにおけるＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチンに関する。言うまでもなく、該生組換え非パルボウイルスベクターは免疫学的に有効な量のカプシドタンパク質を発現するべきである。

不活化全ウイルスワクチン、中空カプシドワクチンまたは生組換え非パルボウイルスベクターでのワクチン接種の代替手段はＤＮＡワクチン接種の使用である。そのようなＤＮＡワクチン接種は、適当なプロモーターの制御下でカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片を宿主動物内に導入することに基づく。ＤＮＡが宿主の細胞により取り込まれたら、宿主の細胞内で、カプシドタンパク質をコードする遺伝子が転写され、転写産物はカプシドタンパク質へと翻訳される。これはパルボウイルスの自然感染過程を厳密に模倣している。適当なプロモーターとしては、前記で例示されているとおり、哺乳類細胞において機能的であるプロモーターが挙げられる。適当なプロモーターの制御下でカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片は例えばプラスミドでありうるであろう。このプラスミドは環状または線状形態でありうる。

ブタのおけるＤＮＡワクチン接種の成功例としては、とりわけ、Ｇｅｒｄｔｓら^（３０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２１３９−２１４６（１９９７）に記載されているオーエスキー病に対するワクチン接種の成功が挙げられる。彼らは、ヒトサイトメガロウイルスの主要最初期プロモーターの制御下で糖タンパク質を含有するＤＮＡ断片を使用するＤＮＡワクチンを記載している。ワクチン接種は５０μｇのＤＮＡの量で２週間間隔で４回実施された。ワクチン接種動物は、免疫ブロットにおいてそれぞれの抗原を認識する、および中和活性を示す血清抗体を産生した。

ＤＮＡワクチン接種の成功のもう１つの例はＧｏｒｒｅｓら^（３１）により示されている。彼らは流行性および古典的なブタＨ１Ｎ１インフルエンザの両方に対するブタにおけるＤＮＡワクチン接種の成功を記載している。彼らは、機能的プロモーターの制御下でインフルエンザＨ１Ｎ１のＨＡ遺伝子を含むＤＮＡワクチンの初回ワクチン接種および初回接種の３および６週間後の２回の同種ブーストでワクチン接種した。

したがって、再び、この実施形態のもう１つの形態は、機能的プロモーターの制御下で本発明のカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ブタにおけるＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチンに関する。言うまでもなく、カプシドタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は免疫学的に有効な量のカプシドタンパク質を発現するべきである。

本発明の全パルボウイルス、本発明の中空カプシド、本発明の生組換えベクターまたはＤＮＡワクチンに基づく本発明のワクチンに関する「免疫原性的に有効な量」を構成するものは所望の効果および標的生物に左右される。本明細書中で用いる「免疫原性的に有効な量」なる語は、非免疫化ブタにおける野生型ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスの感染により引き起こされる病的効果と比較して野生型ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスの感染により引き起こされる病的効果を低減する程度のブタにおける免疫応答を誘導するのに必要な、パルボウイルス、中空カプシド、生組換えベクターまたはＤＮＡワクチンの量を意味する。例えば、実験的チャレンジ感染をワクチン接種動物に対して行い、次に標的動物の臨床疾患徴候、血清学的パラメータを判定し、または病原体の再分離を測定し、ついでこれらの所見を、野外感染ブタにおいて観察されたものと比較することにより、処理（治療）が「免疫学的に有効」であるかどうかを決定することは、当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。

投与されるウイルスの量は投与経路、アジュバントの存在および投与時機に左右されるであろう。本発明のウイルスを含む生ワクチンの好ましい量は例えば組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として表される。例えば、生ウイルスの場合、ウイルスの残留毒性に応じて、動物用量当たり１０〜１０^９ ＴＣＩＤ５０の用量範囲が有利に用いられうる。好ましくは、１０^２〜１０^６ ＴＣＩＤの範囲が用いられる。多数の投与方法が適用可能であり、それらは全て当技術分野で公知である。本発明のワクチンは、好ましくは、注射（筋肉内または腹腔内経路）により又は経口的に動物に投与される。投与のためのプロトコルは標準的なワクチン接種慣例に従い最適化されうる。全ての場合において、皮内注射器（ＩＤＡＬ）による投与が好ましい投与方法である。

ワクチンが本発明の不活化ウイルスまたは中空カプシドを含む場合、用量は、投与されるウイルス粒子の数としても表されるであろう。用量は通常、生ウイルス粒子の投与と比較して若干高いであろう。なぜなら、生ウイルス粒子は、それが免疫系により除去される前に、標的動物内で一定の程度で複製されるからである。不活化ウイルスに基づくワクチンの場合、使用されるアジュバントに応じて約１０^４〜１０^９粒子の範囲のウイルス粒子の量が通常は適しているであろう。

ワクチンがサブユニット、例えば本発明のＣＰを含む場合、用量はタンパク質のマイクログラムでも表されうるであろう。サブユニットに基づくワクチンの場合、適当な用量は通常、この場合も使用アジュバントに応じて５〜５００マイクログラムのタンパク質の範囲であろう。

ワクチンが、カプシドタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む場合、用量はＤＮＡのマイクログラムで発現されるであろう。サブユニットに基づくワクチンの場合、適当な用量は通常、とりわけ、使用される発現プラスミドの効率に応じて５〜５００マイクログラムのＤＮＡの範囲であろう。多くの場合、有効なワクチン接種のために動物１頭当たり２０〜５０マイクログラムのプラスミドの量で十分であろう。

本発明のワクチンは、養豚の状況における投与に適した、所望の適用経路および所望の効果に合致したいずれかの形態をとりうる。本発明のワクチンの製造は当業者にとって通常の手段により行われる。

ワクチンの投与の容易さに関して言えば、経口経路が好ましい。経口投与の場合、該ワクチンは、好ましくは、経口投与のための適当な担体、すなわち、セルロース、食餌または代謝可能物質、例えばアルファ−セルロースまたは植物もしくは動物由来の種々の油と混合される。

実際には、幾つかの病原性ウイルスまたは微生物に対するワクチンをブタに接種する。したがって、実用性および経済性の両方の理由により、ブタに対する本発明のワクチンを、例えば、ブタに病原性のウイルスもしくは微生物の追加的免疫原または該ウイルスもしくは微生物の免疫原をコードする遺伝情報と組合せることが非常に魅力的である。

したがって、この実施形態の好ましい形態は、少なくとも１つの他のブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスおよび／または少なくとも１つの他の免疫原性成分および／または該ブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスの前記の他の免疫原性成分をコードする遺伝物質を含む、本発明のワクチンに関する。免疫原または免疫原性成分は、動物において免疫応答を誘導する化合物である。それは、例えば、全ウイルスもしくは細菌、またはそのウイルスもしくは細菌のタンパク質もしくは糖部分でありうる。

ブタに病原性である最も一般的な病原性ウイルスおよび微生物としては、ブラキスピラ・ヒオジセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカブタコレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ呼吸器および生殖症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄病ウイルス、伝染胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エリシペロ・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられる。

したがって、本発明のより好ましい形態は、ブタに病原性であるウイルスまたは微生物が、ブラキスピラ・ヒオジセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカブタコレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ呼吸器および生殖症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄病ウイルス、伝染胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エリシペロ・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択される、本発明のワクチンに関する。

更にもう１つの実施形態は、本発明のウイルスおよび／または中空カプシドおよび／または本発明のＣＰおよび／または本発明のＣＰをコードするＤＮＡ断片および／または本発明のＣＰをコードする生組換え非パルボウイルスベクターと医薬上許容される担体とを混合することを含む、本発明のワクチンの製造方法に関する。

更に本発明のもう１つの実施形態は、ワクチンにおける使用のための、本発明のウイルスおよび／または中空カプシドおよび／または本発明のＣＰおよび／または本発明のＣＰをコードするＤＮＡ断片および／または本発明のＣＰをコードする生組換え非パルボウイルスベクターに関する。

前記のとおり、出血性腸症候群は多因子性症候群である。それは、最終的にＨＢＳを誘発する因子の複合体である。これは、最初の臨床徴候が現れるより十分に前にＨＢＳ関連ブタパルボウイルスが或るブタ集団に存在するかどうかを知ることが重要であることを意味する。したがって、疾患に対する有効な防御のためには、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスの存在の迅速かつ正確な検出が重要である。

したがって、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスの検出に適した診断手段を提供することが本発明のもう１つの目的である。

これらの手段は、部分的に、該ウイルスに対する抗体の利用可能性に基づく。そのような抗体は、例えば、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスに関する診断試験において使用されうる。

本発明のＨＢＳ関連ブタパルボウイルスに対する抗体を含む抗体または抗血清は、本発明のウイルスでの例えばブタ、家禽または例えばウサギのワクチン接種、およびそれに続く約４週間後の放血、凝固血液の遠心分離および血清のデカントにより迅速かつ容易に得られうる。そのような方法は当技術分野でよく知られている。

ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスに対する抗体（これはポリクローナル抗体、単一特異性抗体またはモノクローナル抗体（またはそれらの誘導体）でありうる）の製造のための他の方法も当技術分野でよく知られている。ポリクローナル抗体が望まれる場合、ポリクローナル血清を産生させ加工するための技術は数十年前から当技術分野でよく知られている。例えば、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｔｅｒ^（３５）を参照されたい。本発明のウイルスに対して反応性であるモノクローナル抗体は、同様に当技術分野で古くから知られている技術により近交系マウスを免疫化することにより製造されうる。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ^（３６）を参照されたい。

したがって、本発明のもう１つの実施形態は、本発明のウイルスに対して反応性である抗体または抗血清に関する。

本発明のウイルスまたはそのウイルスの抗原性物質の検出に基づいており、したがって、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルス感染の検出に適している診断試験キットは、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ試験を含みうる。そのような試験の一例においては、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁を該ウイルスに対する抗体でコーティングする。試験される物質の存在下のインキュベーションの後、該ウイルスに対して反応性である標識抗体を該ウェルに加える。試験される物質が本発明の新規ブタパルボウイルスを実際に含む場合には、このウイルスは、ＥＬＩＳＡのウェルにコーティングされた抗体に結合するであろう。そして後で該ウェルに加えた、該ウイルスに対して反応性である標識抗体が該ウイルスに結合し、ついで発色反応が該ウイルスの抗原物質の存在を示すであろう。

したがって、本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明のウイルスまたは該ウイルスの抗原物質の検出のための診断試験キットであって、本発明のウイルスまたはその抗原物質に対して反応性である抗体を含む診断試験キットに関する。該ウイルスの抗原物質は広義に解釈されるべきである。それは、例えば、分解形態のウイルス、またはウイルス外膜タンパク質を含むウイルスエンベロープ物質でありうる。該ウイルスの物質が該ウイルスに対する抗血清と反応する限り、該物質は抗原物質であるとみなされる。

本発明のウイルスまたは該ウイルスの抗原物質に対して反応性である抗体の血清における検出に基づいており、したがって、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルス感染の検出に適している診断試験キットも、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ試験を含みうる。そのような試験の一例においては、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁を、例えば、本発明のウイルスまたはその抗原物質でコーティングすることが可能である。試験される物質、例えば、本発明の新規ブタパルボウイルスに感染している疑いのある動物の血清の存在下のインキュベーションの後、本発明のウイルスに対して反応性である標識抗体を該ウェルに加える。抗ＨＢＳ関連ブタパルボウイルス抗体が該試験血清中に存在する場合には、これらの抗体は、ＥＬＩＳＡのウェルにコーティングされたウイルスに結合する。結果として、該ウイルスに対して反応性である、後で加えた標識抗体は結合せず、発色反応は見出されないであろう。したがって、発色反応の欠如は、本発明のウイルスに対して反応性である抗体の存在を示すであろう。したがって、本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明のウイルスに対して、または該ウイルスの抗原物質に対して反応性である抗体の検出のための診断試験キットであって、本発明のウイルスまたはその抗原物質を含む診断試験キットに関する。

イムノアッセイの設計は多種多様でありうる。例えば、イムノアッセイは競合または直接反応に基づくものでありうる。更に、プロトコルは固体支持体を使用することが可能であり、あるいは細胞物質を使用することが可能である。抗体−抗原複合体の検出は標識抗体の使用を含み、該標識は、例えば、酵素、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子または色素分子でありうる。サンプル中の本発明のウイルスに対して反応性である抗体の検出のための適当な方法には、前記のＥＬＩＳＡに加えて、免疫蛍光試験（ＩＦＴ）およびウエスタンブロット分析が含まれる。

本発明のウイルスの存在または非存在を診断するための代替的であるが迅速かつ簡便な診断試験は、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスのＣＰまたはＮＳ１遺伝子の特異的領域に対して反応性であるＰＣＲプライマーセットを含む、前記のＰＣＲ試験である。この文脈における特異的は、例えば、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスのＣＰまたはＮＳ１遺伝子に特有であること、すなわち、パルボウイルス科の他のメンバーには存在しないことを意味する。好ましくは、そのような試験は、該ウイルスのカプシドタンパク質と特異的に反応するプライマーセット（配列番号５〜６）、または該ウイルスのＮＳ１と特異的に反応するプライマーセット（配列番号７〜８）を使用するであろう。

言うまでもなく、前記で特定されているプライマーより多数のプライマーが使用可能である。本発明はＨＢＳ関連ブタパルボウイルスのＣＰおよびＮＳ１遺伝子の特有の配列を初めて提供する。これは、当業者が、いずれの追加的な労力をも伴うことなく、他の選択的プライマーを選択することを可能にする。パルボウイルス科の他の非ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスメンバーの公知ＣＰまたはＮＳ１遺伝子を使用する、本発明により提供されるＨＢＳ関連ブタパルボウイルス遺伝子配列のＣＰまたはＮＳ１遺伝子の単純なコンピューター解析により、当業者は、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスの検出および／またはＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと他のウイルス（ブタ）病原体との識別のための診断試験のための他の特異的ＰＣＲプライマーを開発することが可能である。ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスのＣＰまたはＮＳ１遺伝子と特異的に反応するＰＣＲプライマーは、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスのＣＰまたはＮＳ１遺伝子のみと反応し別の（ブタ）病原性ウイルスまたは（ブタ）病原性ウイルス群のＣＰまたはＮＳ１遺伝子とは反応しないプライマーであると理解されるべきである。

したがって、もう１つの実施形態は、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスのＣＰまたはＮＳ１遺伝子の領域と特異的に反応するＰＣＲプライマーセットを含むことを特徴とする、本発明のウイルスの検出のための診断試験キットに関する。

この実施形態の好ましい形態は、配列番号５〜６に示されているプライマーセットまたは配列番号７〜８に示されているプライマーセットを含むことを特徴とする、本発明のウイルスの検出のための診断試験キットに関する。

本発明の新規ブタパルボウイルスのＮＳ１の、他のパルボウイルスのＮＳ１に対する関連性を示す系統樹。本発明の新規ブタパルボウイルスは「ＢＯＷＬ」と称される。 本発明の新規ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質の、他のパルボウイルスのカプシドタンパク質に対する関連性を示す系統樹。本発明の新規ブタパルボウイルスは「ＢＯＷＬ」と称される。 サンプルセット１および２において見られる出血性腸症候群の一例。

実施例
実施例１：サンプルセット１の罹患動物の分析
サンプルセット１の説明
サンプルセット１：１７頭の動物、雄１６頭／雌１頭のブタ、１８〜２７週齢。７つの養豚場。２０１３年７月３１日に受領。臨床症状：動物は腹部膨満を急に発症し、それらの何頭かは死亡前に叫び声を上げた。死亡前の数週間の間に症状は認められなかった。最初の症状の観察から死亡までの時間は２〜６時間であった。症状の発現開始の後、動物を感電により安楽死させ、解剖した。器官症状：小腸における異常。出血症状、薄化腸壁、腸内血液含有流体。他の器官においては、肥大し発赤し腫脹したリンパ節以外は異常は認められなかった。図３を参照されたい。器官を−７０℃で凍結した。血清を凝固血液から３０００×ｇでの遠心分離により調製し、ついで−７０℃で貯蔵した。

ＰＣＲプロトコル：
ウイルス配列から誘導されたプライマー（表１）を使用するＰＣＲにより、単離ＤＮＡをスクリーニングした。Ｂｏｗｌ ＯＲＦ１ ７７４ Ｆ／１６２６Ｒプライマーセットには５８℃、およびＢｏｗｌ Ｑ ＯＲＦ２ ＦＷ／ＲＥＶプライマーセットには５２℃のアニーリング温度での標準的な方法を用いて、ＰＣＲを行った。Ｑ−ＰＣＲのためのプローブを設計した（表１）。５０℃のアニーリング温度での標準的な方法を用いて、Ｑ−ＰＣＲを行った。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ ２．０を使用してＱ−ＰＣＲデータを分析した。

ＰＣＲ分析の結果：
ＰＣＲ分析の結果を表２に示す。該サンプルの合計７６％が陽性であることが判明した。

実施例２：サンプルセット２の罹患動物の分析
サンプルセット２の説明
１６頭の動物、雄１３頭／雌３頭のブタ、１２〜２６週齢。７つの養豚場（サンプルセット１と比較して４つの追加的な養豚場）（サンプルセット１＋２で合計１１個の養豚場）。２０１３年８月２２日に受領。臨床症状：動物は腹部膨満を急に発症し、それらの何頭かは死亡前に叫び声を上げた。死亡前の数週間の間に症状は認められなかった。最初の症状の観察から死亡までの時間は２〜６時間であった。症状の発現開始の後、動物を感電により安楽死させ、解剖した。器官症状：小腸における異常。出血症状、薄化腸壁、腸内血液含有流体。他の器官においては、肥大し発赤し腫脹したリンパ節以外は異常は認められなかった。図３を参照されたい。全てのリンパ節および血液サンプルを試験したわけではなかった。器官を−７０℃で凍結した。血清を凝固血液から３０００×ｇでの遠心分離により調製し、ついで−７０℃で貯蔵した。

ＰＣＲプロトコル：
ウイルス配列から誘導されたプライマー（表１）を使用するＰＣＲにより、単離ＤＮＡをスクリーニングした。Ｂｏｗｌ ＯＲＦ１ ７７４ Ｆ／１６２６Ｒプライマーセットには５８℃、およびＢｏｗｌ Ｑ ＯＲＦ２ ＦＷ／ＲＥＶプライマーセットには５２℃のアニーリング温度での標準的な方法を用いて、ＰＣＲを行った。Ｑ−ＰＣＲのためのプローブを設計した（表１）。５０℃のアニーリング温度での標準的な方法を用いて、Ｑ−ＰＣＲを行った。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ ２．０を使用してＱ−ＰＣＲデータを分析した。

ＰＣＲ分析の結果：
ＰＣＲ分析の結果を表３に示す。該サンプルの合計２５％が陽性であることが判明した。血液は分析しなかった。２つのリンパ節のみを分析した。

実施例３：ブタにおける新規パルボウイルスの複製
動物材料の調製：
サンプルセット１および２の凍結器官材料および糞便を分析前に−７０℃で貯蔵した。全ての操作を氷上で行った。器官を解凍し、ついで組織培養培地内でホモジナイズ（１０％ ｗ／ｖ）した。ホモジネートを１回、凍結−融解した（−７０℃）。ついでホモジネートを遠心分離し、５μｍ、０．４５μｍおよび０．２２μｍフィルター上で濾過して残存組織材料を除去した。濾過されたホモジネートを接種まで−７０℃で貯蔵した。

接種物（ＡまたはＢ）を４×２ｍＬ ＩＭ用量（４つの異なる器官、左頸部、右頸部、左脚、右脚）および２０ｍＬの経口用量（１０個の糞便ホモジネート＋種々の器官の４×２．５ｍｌ ホモジネート）として投与した。接種物は室温で投与した。

接種物Ａ：動物１０ サンプルセット２（実施例２を参照されたい）。糞便、リンパ節、肺、脾臓、腸。

接種物Ｂ：動物２ サンプルセット１（実施例１を参照されたい）。糞便、リンパ節、肺、腎臓、肝臓。

動物
１３頭のブタ（雄ブタ５頭／若雌ブタ／ランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）／高い健康状態／ＳＰＦ／接種時に１２〜１４週齢）をＳｔｅｖｅｎｓｂｅｅｋ（オランダ国）のＭＳＤ養豚場において繁殖させ、飼育し、収容した（施設の指針に従い行った）。実施例１に記載されているとおり、接種前に、該動物を血清、糞便、鼻腔内スワブおよび眼スワブにおける該新規パルボウイルスの存在に関してスクリーニングした。１頭の雄動物を対照動物（未感染体）として犠死させた。残りの１２頭のブタを３つの別々の群において収容した。

処理（治療）
群１：５頭の動物。３頭の動物に接種物Ａを投与し、２頭を接触センチネルとして使用した。

群２：４頭の動物。３頭の動物に接種物Ｂを投与し、２頭を接触センチネルとして使用した。

群３：３頭の動物。３頭の動物に接種物Ｂを投与した。

サンプリングおよび剖検
群１、２：
血液サンプル、直腸／鼻腔／眼スワブを接種後第−３日、第０日、第７日、第１４日、第２１日、第２８日に採取した（犠死させなかった場合）。直腸／鼻腔内／眼スワブは接種後第３日、第１０日、第１７日、第２４日に採取した（犠死させなかった場合）。

群３：
血液サンプル、直腸／鼻腔内／眼スワブを接種後第−４日、第０日、第３日、第６日に採取した（犠死させなかった場合）。

ＰＣＲの結果に基づいて、該動物を剖検に付す計画を立てた。

群１：
接種：第１０日ｐ．ｉ．；第２５日ｐ．ｉ．；第３１日ｐ．ｉ．；
センチネル：第１８日ｐ．ｉ．；第３１日ｐ．ｉ．。

群２：
接種：第１４日ｐ．ｉ．；第２９日ｐ．ｉ．（２頭の動物）；
センチネル：第２２日ｐ．ｉ．。

群３：
接種：第４日ｐ．ｉ．（１頭の動物）；第７日ｐ．ｉ．（２頭の動物）。

結果
ＰＣＲ
動物１０ サンプルセット２（接種物に使用）：
全ての器官が新規パルボウイルスに関して陽性試験結果を示した：糞便、リンパ節、肺、脾臓、腸、腎臓、肝臓。

動物２ サンプルセット１（接種物に使用）：
全ての器官が新規パルボウイルスに関して陽性試験結果を示した：糞便、リンパ節、肺、腎臓、肝臓。

動物実験
スワブ／血清に関するＰＣＲの結果：表４Ａ−Ｂ−Ｃ
組織学的検査、ＰＣＲ分析およびウイルス分離のために器官サンプルを採取した。ウイルス分離のための器官を−７０℃で貯蔵した。ＰＣＲを用いて肝リンパ節（１０％ ホモジネート）を分析した。

群１：全接種動物 血清＋（陽性）（第７日）
センチネル 血清−（陰性）（第７日）
スワブ：表４Ａを参照されたい。

群２：全接種動物 血清＋（陽性）（第７日）
センチネル 血清−（陰性）（第７日）
スワブ：表４Ｂを参照されたい。

群３：全接種動物 血清＋（陽性）（第４日）
スワブ：表４ＢＣ参照されたい。

ＰＣＲの結果

リンパ節の結果
剖検の時点で集めた全１３頭の動物の肝リンパ節を培地内でホモジナイズした（１０％（ｗ／ｖ））。ホモジネートからＤＮＡを単離し、ウイルスの存在をＰＣＲにより分析した。対照リンパ節は新規パルボウイルスに関して陰性であり、全１２頭の接種またはセンチネルブタはウイルスに関して陽性であった。

結論：
前記のデータに基づいて、該新規パルボウイルスはブタにおいて複製されると結論づけられうる。伝染経路は大抵は直接接触による経口／鼻経路であるが、経口／糞便伝染および空気伝染も除外できない。しかし、糞便中排泄は限定的である。該ウイルスは複数の器官において見出される。実施例１〜３における結果の組合せに基づいて、動物の一部、すなわち、全感染動物の約１〜２％においては、該新規パルボウイルスの感染は血中における該ウイルスの出現（ウイルス血症）の時点周辺で疾患を引き起こすと予想される。糞便における放出は最小であるが、血中にはウイルスは感染の３０日後以降も依然として存在する。また、鼻腔内および眼スワブは感染の３０日後以降もＰＣＲ陽性のままである。実施例３に記載されている感染ブタにおいては出血性腸症候群は観察されなかったが、これは、実施例３において用いた動物が比較的若く、非常に良好な状態であったことと、該疾患の頻度が低い（一般集団において１〜２％）ことに基づけば、当然予想されたことである。それらは、商業的な養豚場の状況におけるブタ以外では、素因性リスク因子を有していなかった。

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３０）Ｇｅｒｄｔｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２１３９−２１４６（１９９７）
３１）Ｇｏｒｒｅｓら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８：１９８７−１９９５（２０１１）
３２）Ｐａｕｌ ＆ Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．：４１：２００７−２０１１（１９８０）
３３）Ｐａｕｌ ＆ Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．：４５：２４８１−２４８５（１９８４）
３４）Ｆｕｊｉｓａｋｉ ｅ＆ Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｎａｔ．Ｉｎｓｔ．ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ ｑｕａｒｔｅｒｌｙ（Ｔｏｋｙｏ）２２：３６−３７（１９８２）
３５）ＭａｙｅｒおよびＷａｌｔｅｒ編，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）
３６）ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）
３７）Ｑｉｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１０３５−１１０４４（２００５）
３８）Ｗａｎｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．２００：４１−４６（２０１４）
３９）Ｇｕａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３：９５４１−９５５３（２００９）

Claims (26)

1. パルボウイルス科のパルボウイルス亜科のメンバーである分離されたウイルスであって、該ウイルスが、
   ａ）該ウイルスが出血性腸症候群（ＨＢＳ）関連ウイルスであること、および
   ｂ）該ウイルスが、カプシドタンパク質（ＣＰ）をコードする遺伝子と非構造タンパク質１（ＮＳ１）をコードする遺伝子とを含むウイルスゲノムを有すること
   を特徴とし、ここで、ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号１に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有し、またはＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号３に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有する、分離されたウイルス。
2. ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号１に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有し、かつ、ＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号３に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有する、請求項１記載の分離されたウイルス。
3. パルボウイルス科内のパルボウイルス亜科のメンバーである分離されたウイルスであって、該ウイルスが、
   ａ）該ウイルスがＨＢＳ関連ブタパルボウイルスであること、ならびに
   ｂ）ウイルスゲノムＤＮＡが、配列番号５および６に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して１４０＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与え、または配列番号７および８に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して８５３＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与えること
   を特徴とする、分離されたウイルス。
4. ウイルスゲノムＤＮＡが、配列番号５および６に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して１４０＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与え、かつ、配列番号７および８に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して８５３＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与える、請求項３記載の分離されたウイルス。
5. ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号１に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有し、かつ、ＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号３に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有し、ウイルスゲノムＤＮＡが、配列番号５および６に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して１４０＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与え、かつ、配列番号７および８に示されているプライマーセットとＰＣＲ反応において反応して８５３＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を与える、請求項１〜４のいずれか１項記載の分離されたウイルス。
6. ウイルスを含む細胞培養であって、請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスを含むことを特徴とする細胞培養。
7. ＣＰをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片であって、該遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号１に示されているＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有することを特徴とする、ＤＮＡ断片。
8. 請求項７記載のＤＮＡ断片によりコードされることを特徴とするＣＰ。
9. ＮＳ１をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片であって、該遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号３に示されているＮＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性のレベルを有することを特徴とする、ＤＮＡ断片。
10. 請求項９記載のＤＮＡ断片によりコードされることを特徴とするＮＳ１。
11. ＣＰ遺伝子が機能的異種プロモーターの制御下にある、請求項７記載のＤＮＡ断片。
12. 請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスの免疫学的に有効な量と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ブタにおけるＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチン。
13. 該ウイルスが生弱毒化形態である、請求項１２記載のワクチン。
14. 該ウイルスが不活化形態である、請求項１２記載のワクチン。
15. 請求項８記載のカプシドタンパク質の免疫学的に有効な量と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ブタにおけるＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチン。
16. 請求項１１記載のＤＮＡ断片を含む生組換え非パルボウイルスベクターと医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ブタにおけるＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチン。
17. 請求項１１記載のＤＮＡ断片と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ブタにおけるＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチン。
18. 少なくとも１つの他のブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスおよび／または少なくとも１つの他の免疫原性成分および／または該ブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスの前記の他の免疫原性成分をコードする遺伝物質を含む、請求項１２〜１７のいずれか１項記載のワクチン。
19. 該ブタ病原性ウイルスまたはブタ病原性微生物が、ブラキスピラ・ヒオジセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカブタコレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ呼吸器および生殖症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄病ウイルス、伝染胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エリシペロ・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択される、請求項１８記載のワクチン。
20. アジュバントを含む、請求項１２〜１９のいずれか１項記載のワクチン。
21. 請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスに対して反応性である抗体または抗血清。
22. ブタにおけるＨＢＳ関連ブタパルボウイルスと闘うためのワクチンにおける使用のための、請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスおよび／または請求項８記載のカプシドタンパク質および／または請求項１１記載のＤＮＡ断片および／または請求項１６記載のＣＰをコードする生組換え非パルボウイルスベクター。
23. 請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスおよび／または請求項８記載のカプシドタンパク質および／または請求項１１記載のＤＮＡ断片および／または請求項１６記載のＣＰをコードする生組換え非パルボウイルスベクターと医薬上許容される担体とを混合することを含む、請求項１２〜２０のいずれか１項記載のワクチンの製造方法。
24. 請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスに対して又はその抗原物質に対して反応性である抗体の検出のための診断試験キットであって、請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスまたはその抗原物質を含むことを特徴とする診断試験キット。
25. 請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスまたはその抗原物質の検出のための診断試験キットであって、請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスに対して又はその抗原物質に対して反応性である抗体を含むことを特徴とする診断試験キット。
26. 請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルスの検出のための診断試験キットであって、ＨＢＳ関連ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質遺伝子またはＮＳ１遺伝子の領域に対して特異的に反応性であるＰＣＲプライマーセットを含むことを特徴とする診断試験キット。

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