KR102392649B1 - 돼지 파르보바이러스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 돼지 파르보바이러스, 상기 바이러스의 단백질, 및 상기 바이러스 및 그의 단백질에 기반한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 바이러스의 유전자를 포함하는 DNA 단편, 및 상기 바이러스의 유전자에 기반한 DNA 백신에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 신규 바이러스와 반응성인 항체, 및 상기 바이러스 또는 상기 바이러스에 대한 항체의 검출을 위한 진단 시험에 관한 것이다.

Description

돼지 파르보바이러스 {PORCINE PARVOVIRUS}

본 발명은 신규한 돼지 파르보바이러스, 상기 바이러스의 단백질, 및 상기 바이러스 및 그의 단백질에 기반한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 바이러스의 유전자를 포함하는 DNA 단편, 및 상기 바이러스의 유전자에 기반한 DNA 백신에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 신규 바이러스와 반응성인 항체, 및 상기 바이러스 또는 상기 바이러스에 대한 항체의 검출을 위한 진단 시험에 관한 것이다.

지난 수십년 동안 전 세계에서 돼지고기 소비가 강한 증가세를 보이고 있다. 그 결과, 증가하고 있는 시장 수요를 충족시키기 위해 농장 수 및 크기도 증가하고 있는 것으로 보인다. 일반적으로 축산업으로부터 알려진 바와 같이, 함께 가까이 살고있는 다수의 동물은 모든 종류의 질환에, 심지어 거의 알려지거나, 관찰된 적 없는 질환에도, 또는 심지어 대규모 상업적 영농을 하는 시절 이전에는 알려진 바 없었던 질환에 취약하다.

현재 60년 넘게 알려져 온 돼지 질환 중 하나는 출혈성 장 증후군 (HBS)이다. 이 질환은 상기 질환의 원인이 명확하지 않고, 다양한 임상적 증후의 일관성이 항상 완전하게 분명하지는 않다는 사실에 기인하여 증후군으로 지칭된다.

HBS는 낮은 빈도로, 폭발적 발병으로 발생하는 질환이다. 4-6개월된 빠르게 성장하는 돼지가 주로 이환된다. 대부분의 사례에서, 상기 질환은 비육 돼지에서 관찰된다. 비록 사망률 규모는 다양하기는 하지만, 돼지는 설사 증거도 없이 갑자기 사망하게 된다 ^(1-3). 16,000마리 초과의 돼지에 기반한 스위스 부검 데이터 결과, HBS의 발병률은 2.66%인 것으로 나타났다. 미국에서, HBS가 성장-종료 단계 동안 전체 사망건 중 0.5%-7%의 원인이 되는 것으로 보고되었다 ⁽³⁾.

출혈성 장 증후군은 단일 원인에 따른 단일 질환으로서 간주되지 않아야 한다.

HBS의 가장 두드러진 증상은 장 출혈로, 이는 대개 장 꼬임 (장 염전)을 동반한다. 그러나, 이들 증상은 또한 위 궤양 및 회장염의 적응증이기도 하며, 이는 HBS 진단을 복잡하게 만든다. 혈액 풀링 및 정체를 초래하면서, 전체 장의 회전이 발생할 수 있다. 장 꼬임은 HBS 사례 중 최대 80%에서 관찰될 수 있다 ^(1-3). 빈번하게 관찰되는 상기 질환의 다른 증상은 얇은 장벽, 및 장내 혈성 체액이다.

HBS의 정확한 병인은 불명확하다. 상기 명시된 바와 같이, 단일 원인에 기인한다기 보다는, 상기 증상의 병인은 다인성일 가능성이 크다. 스트레스, 수개의 환경적 및 관리 측면이 중요한 역할을 할 수 있다. 소인성 인자로는 격렬한 운동, 취급, 싸움, 적체 또는 불규칙적 사료 공급을 포함할 수 있다. 비록 클로스트리디움 종 (Clostridium sp.) 및 E. 콜라이(E. coli)가 HBS를 앓는 동물로부터 단리되기는 하였지만, 감염원 (박테리아성 또는 바이러스성)이 HBS를 유발할 수 있다는 결정적 증거는 없다 ^(1,3). HBS를 앓는 동물로부터의 여과된 장 내용물을 건강한 동물에게 정맥내로 또는 경구적으로 투여함으로써 질환을 재현시키고자 한 시도는 실패하였다. 감염된 돼지로부터 단리된 E. 콜라이 및 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) A형의 경구 접종에 의해 질환을 재현시키고자 한 시도도 똑같이 실패하였다.

한편, 상기 질환의 빈도는 사료 중의 항생제 투여에 의해 어느 정도까지는 하락시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이는 상기 질환이 실제로, 예컨대, 스트레스, 및 하나 이상의 병원체의 조합 효과인 다인성이라는 생각을 강화시킨다.

본 발명의 목적은 상기 질환과 연관된 신규 감염원 뿐만 아니라, 상기 질환을 퇴치하거나, 또는 적어도 상기 질환의 사망률을 감소시키고자 하는 것을 목적으로 하는 백신을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 질환 연관된 감염원을 검출 및 확인하기 위한 수단을 제공하고자 하는 것이다.

최근, 멕시코에서는 상기 질환이 발병한 동안 HBS 진단을 받은 돼지를 수개의 농장으로부터 수집하였다.

이환된 돼지는 질환의 사전 증상도 없었고, 질병의 최초 징후가 나타난 후 2 내지 6시간 사이에 갑자기 사망하였다.

부검시 돼지는 소장 이상, 그 중에서도 장에서 출혈성 증상, 얇은 장벽 및 혈성 체액을 보였다. 붉은 색을 띄는 종창성 비대 림프절이 관찰된 것을 제외하면, 다른 기관에서는 어떤 이상도 발견되지 않았다. 상기 질환은 HBS인 것으로 확진받았다.

다양한 농장으로부터의, 부검을 받은 이환된 돼지에서 수득한 샘플을 바이러스 존재에 대하여 분석하였고, 놀랍게도 동물 중 76%에서 신규 바이러스가 발견되었다. 모든 동물에서 상기 바이러스가 검출되지 않았다는 사실은 동물 사망 시점부터 사후 부검부로 제출되는 시점까지의 소요 시간량과 관련이 있을 수 있다. 이는 그 중에서도 동물 1마리마다 발견되는 바이러스의 양은 크게 달랐다는 사실로부터 결론지을 수 있다. 외관상으로는 바이러스가 없는 것으로 보이는 돼지에서, 상기 돼지에서는 분석 시점에 바이러스 존재량이 검출 수준 미만이었다는 사실에 기인할 가능성이 있다고 본 발명자들은 생각한다. 추가로, 상기 신규 바이러스에 대한 초기 바이러스 복제 부위가 알려져 있지 않고, 따라서, 감염 후의 1차 바이러스 복제 부위는 샘플링되지 않을 수 있다.

신규 바이러스는 이들 HBS 진단을 받은 돼지에서 검출되었기 때문에, 바이러스는 HBS 연관 바이러스로 추가로 지칭될 것이다. 이제, 출혈성 장 증후군은 하기 임상 증상: 대개는 장에서 장 꼬임을 동반하는 장 출혈, 얇은 장벽 및 혈성 체액과 함께 조합하여, 상기 질환 동안 일부 단계에서 HBS를 앓는 동물의 기관 중 본 발명에 따른 신규 바이러스의 존재에 의해 특징화될 수 있다.

바이러스 게놈의 서열을 분석하였고, 그 결과, 신규 바이러스는 비록 비교적 낮은 수준이기는 하지만, 최근 확인된 파르보비리다에(Parvoviridae) 내의 파르보비리나에(Parvovirinae) 아과 속과 다소 유사한 것으로 밝혀졌다.

파르보바이러스는, 평균 게놈 크기는 5,000개의 뉴클레오티드이고, 직경의 크기 범위는 18-26 nm인, 선형, 비분절 단일 가닥 DNA 바이러스이다.

대표적인 신규 돼지 파르보바이러스의 거의 전장의 DNA 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 10에 제시되어 있다.

신규 바이러스는 2개의 큰 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는데: 662개의 아미노산으로 이루어진 비구조 단백질 1 (NS1)을 코딩하는 ORF1은 서열식별번호: 10의 0134-2122번 위치에서 발견되고, 1,189개의 아미노산으로 이루어진 캡시드 단백질 (CP)을 코딩하는 ORF2는 서열식별번호: 10의 2130-5699번 위치에서 발견된다.

캡시드 단백질을 코딩하는 유전자인, ORF2의 DNA 서열의 한 예는 서열식별번호: 1에 도시되어 있다. 서열식별번호: 2는 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

비구조 단백질 NS1을 코딩하는 ORF1의 DNA 서열의 한 예는 서열식별번호: 3에 도시되어 있다. 서열식별번호: 4는 비구조 단백질 NS1의 아미노산 서열을 나타낸다.

파르보비리나에의 아과는 현재 하기 7종의 속을 포함한다 ⁽¹⁵⁾:

1) PARV4 유사 바이러스

2) 에리트로바이러스

3) 보카바이러스

4) 데펜도바이러스

5) 암도바이러스

6) 파르보바이러스

7) 새롭게 제안된 파르보 분류군.

지금 현재는 돼지를 감염시키는 6종의 상이한 파르보바이러스가 확인되어 있다:

a) 파르보바이러스 속의 구성원인, 대표적인 돼지 파르보바이러스 1형 (PPV1)

b) PARV4 유사 바이러스 속의 구성원인, 돼지 파르보바이러스 2형 (PPV2)

c) 이 또한 PARV4 유사 바이러스 속의 구성원인, 돼지 파르보바이러스 3형 (PPV3, 이는 또한 돼지 PARV4, 호코바이러스 또는 파르테트라바이러스로도 알려져 있다)

d) 새롭게 제안된 분류군의 구성원인, 돼지 파르보바이러스 4형 (PPV4)

e) 이 또한 새롭게 제안된 분류군의 구성원인, 돼지 파르보바이러스 5형 (PPV5)

f) 보카바이러스 속의 구성원인, 돼지 보카바이러스 (PBoV).

PPV1은 사산, 미라화, 배아 사망 및 불임증과 관련된 증후군인, SMEDI의 원인 인자인 것으로 알려져 있다. ^(4,5)

PPV2는 그 자체가 질환을 유발하는 것으로는 알려져 있지 않지만, 돼지 써코바이러스 연관 질환 (PCVAD) 발생에서 보조인자인 것으로는 제안된다 ^(6,7).

PPV3 또한 그 자체가 질환을 유발하는 것으로는 알려져 있지 않지만, 가능하게는 돼지 써코바이러스 연관 질환 (PCVAD) 발생에서 보조인자일 가능성이 있다 ^(8-11).

PPV4는 원래 돼지의 폐 조직으로부터 단리되었다. 이 조직은 돼지 써코바이러스와 함께 공동으로 감염된 것으로 보였다. PPV4가 질환을 유발하는 것으로는 알려져 있지 않고, 이는 또한 또 다른 병원체에 의해 유발된 질환과 연관이 있다고 설득력있게 설명되지는 않았다 ^(12-14).

PPV5는 또한 어떤 증상 또는 병변을 유발하는 것으로는 알려져 있지 않으며, 또 다른 병원체에 의해 유발된 질환과 연관이 없다 ^(15-16).

돼지 보카바이러스는 아직까지는 임상적 중요성 및 역학적 성질에 대해 크게 연구되지 않은, 비교적 새로운 유형의 돼지 파르보바이러스이다 ⁽¹⁷⁾.

신규 바이러스의 ORF1 및 ORF2의 아미노산 서열을 사용하여 최대 우도 방법, 푸아송(Poisson) 보정 모델, 및 부트스트랩 분석에 기반한 계통수를 작성하였다 (500개의 복제물).

표준 설정을 이용하여 프로그램 MEGA 버전 5를 이용함으로써 상기 계통수를 작성하였다 (MEGA5: 최대 우도(Maximum Likelihood), 진화 거리(Evolutionary Distance), 및 최대 최소 경로법(Maximum Parsimony Methods)을 이용하는 분자 진화 유전학 분석(Molecular Evolutionary Genetics Analysis). 문헌 [Koichiro Tamura, Daniel Peterson, Nicholas Peterson, Glen Stecher, Masatoshi Nei and Sudhir Kumar. Mol. Biol. Evol. 28(10): 2731-2739. 2011 doi:10.1093/molbev/msr121 Advance Access publication May 4, 2011]).

ORF1의 계통수는 도 1에, ORF2의 계통수는 도 2에 제시되어 있다. 부트스트랩 서포트 비율(%)은 노드로 명시되어 있다. 거리 막대는 부위당 뉴클레오티드 치환 횟수를 나타낸다.

상기 계통수에 따르면, 신규한 돼지 파르보바이러스는 PPV1, 2 또는 3, 또는 보카바이러스보다 돼지 파르보바이러스 5 (PPV5) 및 돼지 파르보바이러스 4 (PPV4)와 더 밀접한 관계가 있다. NS1 코딩 서열 및 캡시드 단백질 코딩 서열, 둘 모두는 비관련 바이러스 PPV4 및 PPV5를 또한 포함하는 파르보비리나에 계통수 일부에 어느 정도 들어맞는 것으로 나타났다. 이러한 이유에서, 본 발명자들은 신규 바이러스를 신규 분류군의 바이러스 군에 잠정적으로 배치하기로 결정하였다.

그러나, 심지어 신규 분류군의 바이러스 군 내에 있는 현 돼지 파르보바이러스와의 서열 동일성조차도 비교적 낮다. 이러한 이유에서, 심지어는 신규 바이러스가 파르보비리나에 과 내의 신규한 속에 속한다고 고려해 볼 수 있다.

서열식별번호: 1 및 3은 본 발명에 따른 바이러스의 캡시드 단백질 및 비구조 단백질 NS1을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열의 전형적인 예를 나타낸다.

이들 단백질의 경우, HBS 연관 바이러스를 나타내는 대표 개체들 사이에 천연 변이가 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예컨대, 캡시드 단백질 서열 중 부차적 변이를 유도하는 유전자 변이가 존재한다. 이는 NS1 유전자에도 동일하게 적용된다. 무엇보다도, 예컨대, 트리플렛 TTA, TTG, TCA, TCT, TCG 및 TCC 모두가 류신을 코딩하는 것과 같이, 뉴클레오티드 변이가 발생할 수 있음을 설명하는 소위 "두번째 및 세번째 염기에서의 동요"가 아미노산 서열 중에서 간과된 상태 그대로 남아있다. 추가로, 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스를 대표하는 것들 사이의 부차적 변이가 아미노산 서열에서 관찰될 수 있다. 이러한 변이는 전체 서열 중의 아미노산(들) 차이에 의해, 또는 상기 서열 중의 아미노산(들)의 결실, 치환, 삽입, 역전 또는 부가에 의해 반영될 수 있다. 생물학적 및 면역학적 활성을 본질적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환은 예컨대, 문헌 [Neurath et al., in "The Proteins" Academic Press New York (1979)]에 기술되어 있다. 관련된 아미노산 사이의 아미노산 치환, 또는 진화에서 빈번하게 발생했던 치환은 그 중에서도 특히 Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val이다 (문헌 [Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3] 참조). 다른 아미노산 치환으로는 Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val 및 Ala/Glu를 포함한다. 이러한 정보에 기초하여, 립맨(Lipman) 및 피어슨(Pearson)은 신속하게 고감도로 단백질을 비교할 수 있고 (Science 227, 1435-1441, 1985) 및 상동성 단백질 사이의 기능적 유사성을 측정할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 발명의 예시적인 실시양태의 상기 아미노산 치환 뿐만 아니라, 결실 및/또는 삽입이 있는 변이는 본 발명의 범주 내에 포함된다.

이는 캡시드 단백질 및 비구조 단백질 NS1이 본 발명에 따른 돼지 파르보바이러스를 나타내는 상이한 대표 개체로부터 단리되었을 때, 본 발명에 따른 돼지 파르보바이러스의 캡시드 단백질 및 비구조 단백질 NS1을 여전히 그대로 나타내면서, 유의적으로 100% 미만의 상동성을 가질 수 있는 이유를 설명해준다.

이는, 심지어 하나의 단일 속 내에서 고도로 관련된 파르보바이러스로 이루어진 PARV4 유사 바이러스 속이 그럼에도 불구하고 유의적으로 상이한 전체 게놈 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 유의적으로 상이한 NS1 유전자 뉴클레오티드 서열을 가진다고 밝힌, 샤오(Xiao) 등의 논문의 도 1에 제시된 계통수에 명확하게 반영되어 있다 ⁽⁶⁾.

따라서, 본 발명에 따른 바이러스는 그 중에서도,

a) 바이러스는 HBS 연관 바이러스이고,

b) 바이러스는 캡시드 단백질 (CP)을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 게놈을 가지며, 여기서 CP 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지는 것을 특징으로 하는 것인, 파르보비리다에 과의 파르보비리나에 아과의 구성원인 단리된 바이러스로서 기술된다.

본 발명의 목적을 위해, 동일성 수준은 서열식별번호: 1의 서열과, 동일성 수준이 측정되어야 하는 돼지 파르보바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 상응하는 영역의 동일성 수준으로서 이해되어야 한다.

동일성 수준을 측정하는 데 적합한 프로그램은 "얼라인 투 오어 모어 시퀀시스(Align two or more sequences)" 옵션 및 표준 환경을 이용하는 NCBI의 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(NCBI's Basic Local Alignment Search Tool)의 뉴클레오티드 blast 프로그램 (blastn)이다 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

본 발명의 목적을 위해, 단리된이라는 것은 바이러스가 자연 상태에서 회합되어 있는 조직으로부터 유리되게 하는 것을 의미한다. 단리된 바이러스의 예는 세포 배양물 중에 존재하는 것과 같은 바이러스이다.

본 실시양태에서 바람직한 형태는 서열식별번호: 1에 제시된 캡시드 단백질의 뉴클레오티드 서열과 82% 이상, 더욱 바람직하게, 84%, 바람직한 순서로 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어는 100%의 동일성 수준을 가지는 캡시드 단백질 유전자를 가지는 바이러스에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바이러스를 기술하는 대안적 방법은 바이러스의 NS1 유전자의 서열에 관한 것이다.

서열식별번호: 3은 본 발명에 따른 바이러스의 NS1 유전자의 뉴클레오티드 서열의 전형적인 예를 보여주는 것이다. 그러나, 상기 설명된 바와 같이, NS1 서열에서 부차적 변화를 유도하는 천연 변이가 있다.

그러므로, 본 발명에 따른 바이러스는 이에 따라서 또한

a) 바이러스는 HBS 연관 바이러스이고,

b) 바이러스는 비구조 단백질 1 (NS1)을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 게놈을 가지고, 여기서, NS1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지는 것을 특징으로 하는 것인, 파르보비리다에 과의 파르보비리나에 아과의 구성원인 단리된 바이러스로서 기술될 수 있다.

본 실시양태에서 바람직한 형태는 서열식별번호: 3에 제시된 NS1 유전자의 뉴클레오티드 서열과 82% 이상, 더욱 바람직하게, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어는 100%의 동일성 수준을 가지는 NS1 유전자를 가지는 상기 바이러스에 관한 것이다.

따라서, 요약하면, 본 발명에 따른 바이러스는

a) 바이러스는 HBS 연관 바이러스이고,

b) 바이러스는 캡시드 단백질 (CP)을 코딩하는 유전자 및 비구조 단백질 1 (NS1)을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 게놈을 가지며, 여기서 CP 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지거나, 또는 NS1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지는 것을 특징으로 하는 것인, 파르보비리다에 과의 파르보비리나에 아과의 구성원인 단리된 바이러스이다.

본 실시양태에서 바람직한 형태는

a) 바이러스는 HBS 연관 바이러스이고,

b) 바이러스는 캡시드 단백질 (CP)을 코딩하는 유전자 및 비구조 단백질 1 (NS1)을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 게놈을 가지며, 여기서 CP 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지고, NS1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지는 것을 특징으로 하는 것인, 파르보비리다에 과의 파르보비리나에 아과의 구성원인 단리된 바이러스에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바이러스를 특징화하는 추가의 또 다른 대안적 방법은 본 발명에 따른 바이러스의 캡시드 단백질 유전자 서열 또는 NS1 유전자 서열에 특이적인 프라이머 세트를 사용하는 PCR 시험에 의존한다. 서열이 서열식별번호: 5-6 및 서열식별번호: 7-8에 제시된 2개의 상이한 프라이머 세트를 바이러스에 대한 그의 특이성에 대하여 선택하였다. 바이러스의 캡시드 단백질 유전자와 특이적으로 반응하는 제1 프라이머 세트 (서열식별번호: 5-6)를 이용하는 PCR 시험은 2개의 프라이머 Bowl_Q_ORF2_FW: CTACATCTGCGCCTGAC 및 Bowl_Q_ORF2_REV: GTGGTGAGAAGGCAAGAC를 이용한다. 정량적(Q)-PCR 시험을 위해, 상기 2개의 프라이머 이외에도, 서열식별번호: 9에 제시된 PCR 프로브 Bowl_Q_ORF2_프로브: 6FAM-CACGAGCTAGAGCGTGCTAAACAG-BHQ1이 사용된다.

프라이머 세트 (서열식별번호: 7-8)를 이용하는 PCR 시험은 바이러스의 NS1 유전자와 특이적으로 반응하고, 2개의 프라이머 Bowl_ORF1_774_F: TGTTGAGTGTGGTGGATTGG 및 Bowl_ORF1_1626_R: AAGGAAGCTGGACCGAGAG를 이용한다.

실시예 섹션에서 더욱 상세하게 기술되는 본 시험은 표준 PCR 시험이다.

파르보비리다에 내의 파르보비리나에 아과의 아과의 구성원을 상기 기술된 프라이머 세트를 이용하여 분석할 경우, 하기와 같이 언급될 수 있다: 제1 프라이머 세트의 PCR 생성물 분석 결과, PCR 생성물이 대략 140개의 염기쌍으로 이루어진 것으로 밝혀졌거나, 또는 제2 프라이머 세트의 PCR 생성물 분석 결과, PCR 생성물이 대략 853개의 염기쌍으로 이루어진 것으로 밝혀졌다면, 이는 분석된 바이러스가 본 발명에 따른 바이러스에 속하는 것이라고 명백하게 입증한다.

단지 한 예로서: 대략 853개의 염기쌍으로 이루어진 PCR 생성물은 길이가 853 + 10개의 염기쌍 내지 853 - 10개의 염기쌍인 PCR 생성물이다. 대략 140개의 염기쌍으로 이루어진 PCR 생성물은 길이가 140 + 10개의 염기쌍 내지 140 - 10개의 염기쌍인 PCR 생성물이다.

따라서, 본 발명의 본 실시양태의 추가의 또 다른 형태는

a) 바이러스는 HBS 연관 바이러스이고,

b) 바이러스 게놈 DNA가 PCR 반응에서 서열식별번호: 5 및 6에 제시된 프라이머 세트와 반응하여 140 +/- 10개의 염기쌍으로 이루어진 PCR 생성물을 생성하거나, 또는 PCR 반응에서 서열식별번호: 7 및 8에 제시된 프라이머 세트와 반응하여 853 +/- 10개의 염기쌍으로 이루어진 PCR 생성물을 생성하는 것을 특징으로 하는 것인, 파르보비리다에 내의 파르보비리나에 아과의 구성원인 단리된 바이러스에 관한 것이다.

본 실시양태의 바람직한 형태는, 바이러스 게놈 DNA가 PCR 반응에서 서열식별번호: 5 및 6에 제시된 프라이머 세트와 반응하여 140 +/- 10개의 염기쌍으로 이루어진 PCR 생성물을 생성하고, PCR 반응에서 서열식별번호: 7 및 8에 제시된 프라이머 세트와 반응하여 853 +/- 10개의 염기쌍으로 이루어진 PCR 생성물을 생성하는 것인, 본 발명에 따른 바이러스에 관한 것이다.

본 실시양태의 더욱 바람직한 형태는, 바이러스가 캡시드 단백질 (CP)을 코딩하는 유전자 및 비구조 단백질 1 (NS1)을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 게놈을 가지며, 여기서 CP 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지고, NS1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지며, 여기서 바이러스 게놈 DNA가 PCR 반응에서 서열식별번호: 5 및 6에 제시된 프라이머 세트와 반응하여 140 +/- 10개의 염기쌍으로 이루어진 PCR 생성물을 생성하고, PCR 반응에서 서열식별번호: 7 및 8에 제시된 프라이머 세트와 반응하여 853 +/- 10개의 염기쌍으로 이루어진 PCR 생성물을 생성하는 것인, 본 발명에 따른 바이러스에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바이러스는 생, 생 약독화된 또는 불활성화된 형태일 수 있다.

이에, 바이러스의 CP 및 NS1을 코딩하는 유전자의 DNA 서열은 상기 명시된 바와 같이 특징화되었다. 이들 유전자를 확인하는 것은 고도로 유용한데, 그 이유는 이제, 하기에서 광범위하게 설명되는 바와 같이, DNA-백신을 위한, 상기 단백질에 기반하는 서브유니트 백신의 제조에서 사용하기 위한 또는 진단 목적을 위한 기초로서 그 유전자를 사용할 수 있기 때문이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 유전자가 서열식별번호: 1에 제시된 CP 유전자의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지는 것을 특징으로 하는 것인, 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편에 관한 것이다.

본 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 1에 제시된 CP의 뉴클레오티드 서열과 82% 이상, 더욱 바람직하게, 바람직한 순서로 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어는 100%의 동일성 수준을 가지는 유전자를 포함하는 상기 DNA 단편에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 또 다른 실시양태는 유전자가 서열식별번호: 3에 제시된 NS1 유전자의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성 수준을 가지는 것을 특징으로 하는 것인, NS1을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편에 관한 것이다.

본 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 3에 제시된 NS1의 뉴클레오티드 서열과 82% 이상, 더욱 바람직하게, 바람직한 순서로 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어는 100%의 동일성 수준을 가지는 유전자를 포함하는 상기 DNA 단편에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 또 다른 실시양태는 CP가 본 발명에 따른 CP를 코딩하는 DNA 단편에 의해 코딩된 것을 특징으로 하는 CP에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바이러스의 상기 CP는 하기에서 설명되는 바와 같이, 백신에서, 더욱 구체적으로 서브유니트 백신에서 사용하기에 적합하고, 항체를 일으키는 데 사용될 수 있고, 진단 시험을 가능하게 만들기 때문에, 고도로 적합하다.

본 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 가지는 CP에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 또 다른 실시양태는 NS1이 본 발명에 따른 NS1을 코딩하는 DNA 단편에 의해 코딩된 것을 특징으로 하는 NS1에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바이러스의 상기 NS1은 하기에서 설명되는 바와 같이, 그 중에서도 진단 시험을 가능하게 만들기 때문에, 고도로 적합하다.

본 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 가지는 NS1에 관한 것이다.

본 발명의 장점 중 하나는 이제 최초로 바이러스 감염 과정을 추적할 수 있고, HBS를 앓는 돼지의 다양한 기관 및 체액 중 신규 바이러스의 존재 또는 부재를 분석할 수 있다는 점이다. 이는 질환 발생에 대해 더욱 잘 이해하는 데 도움을 주었다.

개별 돼지가 HBS에 대한 전체적인 임상적 징후를 보이기 전 몇 주 또는 심지어 며칠 동안에도 어떤 이상도 관찰되지 않는다는 것은 알려져 있다. 최초 증상부터 동물 사망까지의 평균 소요 시간은 약 2-6시간이다. 사망 직전, 동물은 복부 팽만으로 고생하는 것으로 보이며, 그 중 일부는 사망 전에 날카로운 소리로 운다. 농장에 있는 임상적 징후가 발생한 동물은 이 동물이 상기 질환으로 사망하기 이전에 안락사시켰다.

HBS 돼지가 수집된 멕시코에 있는 다양한 농자에서의 HBS 발병률은 1-2%로 다양하였다.

상이한 농장으로부터 수집된, 총 33마리 (17마리로 이루어진 한 군은 18-27주령된 것이고 (실시예 1) 및 16마리로 이루어진 한 군은 12-26주령된 것이다 (실시예 2))의 안락사된 HBS 진단을 받은 동물을 분석하였다. 상기 기술된 바와 같은 프라이머 세트를 이용하여 수행된 PCR 반응 결과, 1군에서는 14개의 혈청 중 5개 (혈청 3개는 수집소로부터 분실하였다)가 바이러스에 대해 양성인 것으로 나타났고, 1개의 직장 면봉 채취물은 양성인 것으로 나타난 것으로 밝혀졌다. 총 8개의 전혈 샘플은 양성인 것으로 나타났고, 15개의 림프절 중 12개가 양성인 것으로 나타났다. 2군에서, 16개의 혈청 중 5개가 바이러스에 대해 양성인 것으로 나타났고, 1개의 직장 면봉 채취물이 양성인 것으로 나타났다. 각 군의 대표 동물 1마리 (1군의 동물 2, 2군의 동물 10)로부터의 기관을 바이러스 존재에 대하여 분석하였다. 림프절, 폐, 비장, 장, 신장 및 간을 비롯한 샘플링된 모든 기관 뿐만 아니라, 대변도 바이러스에 대해 양성 반응을 보인 것으로 나타났다.

본 발명의 또 다른 장점은 이제 건강한 돼지를 신규 바이러스로 감염시키고, 바이러스 감염 경로를 조사할 수 있다는 점이다. 이를 목표로 하여, HBS 동물로부터 얻은 기관 물질 및 대변을 조직 배양 배지 중에서 균질화하였다. 균질액을 1회에 걸쳐 냉동 해동시키고 (-70℃), 원심분리하고, 5 ㎛, 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 필터 상에서 여과하여 남은 조직 물질을 제거하였다.

대표 동물의 하기 물질로 접종물 A를 제조하였다: 2군의 동물 10의 대변, 림프절, 폐, 비장 및 장.

또 다른 대표 동물의 하기 물질로 접종물 B를 제조하였다: 1군의 동물 2의 대변, 림프절, 폐, 신장 및 간. 본 실험에 대한 상세한 설명은 하기 실시예 섹션 (실시예 3)에서 기술한다.

하기와 같이 접종물 (A 또는 B)을 접종 시점에 12-14주령된 총 4마리의 수퇘지 및 8마리의 암퇘지 (랜드레이스(Landrace)/좋은 건강 상태/SPF)에 4 x 2 mL IM 용량으로서 및 20 ml의 경구 용량으로서 제공하였다: 1군: 5마리의 동물, 그 중 동물 3마리는 접종물 A를 받았고, 2마리는 접촉 감시 동물로서의 역할을 하였다. 2군: 4마리의 동물, 그 중 동물 3마리는 접종물 B를 받았고, 1마리는 접촉 감시 동물로서의 역할을 하였다. 3군: 3마리의 동물, 3마리 모두 접종물 B를 받았다. 동물 1마리 (수컷)를 접종 전에 희생시켰고, 이는 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 동물을 접종 전 혈청, 대변, 비강 면봉 채취물 및 눈 면봉 채취물 중의 신규 바이러스의 존재에 대하여 스크리닝하였다.

혈액 샘플, 직장/비강/눈 면봉 채취물을 여러 시점에 채취하였다. 동물 실험에 관한 상세한 설명은 하기 실시예 섹션에 기술되어 있다.

접종 후 7일째 접종받은 동물 6마리 중 6마리의 혈청에서 뿐만 아니라, 직장, 비강 및 눈 면봉 채취물에서 바이러스가 검출될 수 있는 것으로 나타났다. 다른 동물 접종 후 14일째, 접종받지 않은 동물인 감시 동물 3마리 모두의 혈청에서 바이러스가 검출될 수 있다. 접종 후 7일째 감시 동물 모두의 직장/비강 및 눈 면봉 채취물은 양성이었다 (실시예 3, 1군, 2군). 접종 후 3일째, 접종받은 동물의 3개의 혈청 중 3개에서 바이러스가 검출되었다 (실시예 3, 3군). 따라서, HBS의 발병률이 비교적 낮다고 보고된 것은 사실이지만, 그의 감염 속도가 빠르다는 것과 함께 조합하여 고도로 전염성인 바이러스 성질을 고려해 볼 때, HBS가 발생한 농장내 돼지는 모두가 그러한 것은 아니지만, 단연코 가장 많은 돼지들이 바이러스에 의한 감염을 경험할 것이라고 예상할 수 있다. 그러므로, HBS가 발생한 농장내 모든 동물을 본 발명에 따른 HBS 연관 돼지 파르보바이러스에 의한 감염에 대해 백신접종하는 것이 매우 권할만하다. 상기 백신접종은 적어도 다인성 증후군의 바이러스 성분을 박멸시킬 것이다. 또한, 이는 결국에는 상기 질환을 예방하거나, 또는 적어도 그의 중증도를 감소시킬 것이다.

또한, 본 발명의 장점들 중 하나는 이제 신규한 돼지 파르보바이러스는 단리된 것이고, HBS와 연관이 있는 것이기 때문에, 바이러스 및/또는 바이러스의 보호 서브유니트가 백신접종용의 출발 물질로서 사용될 수 있다는 점이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는, 본 발명에 따른 바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 돼지에서 HBS를 퇴치하기 위한 백신에 관한 것이다.

본 발명에 따른 백신에서 사용하기에 적합한 제약상 허용되는 담체의 예로는 멸균수, 염수, 수성 완충제, 예컨대, PBS 등이 있다. 추가로, 본 발명에 따른 백신은 하기 기술되는 바와 같이, 다른 첨가제, 예컨대, 애주번트, 안정제, 항산화제 등을 포함할 수 있다.

이와 관련하여 퇴치한다는 것은 넓은 의미로 해석되어야 한다: HBS를 퇴치한다는 것은 질환의 징후를 예방하기 위한 백신접종 뿐만 아니라, 상기 개략적으로 설명된 바와 같이 질환의 징후를 감소시키기 위한 백신접종을 포함하는 것으로 간주된다.

일단 아직 증후군을 앓지 않는 감염된 동물에서 바이러스 진단을 받고 난 후의 치료학적 백신접종도 물론 동등하게 효율적이다. 최초 임상 징후부터 사망까지의 시간이 매우 짧다고 가정하면, 증후군 진단을 받은 이후의 치료학적 백신접종은 비효율적인 것으로 보일 것이다.

본 발명에 따른 백신은 약독화된 생 또는 불활성화된 형태의 본 발명에 따른 바이러스를 포함할 수 있다.

약독화된 생 바이러스 백신, 즉, 생 약독화된 형태의 본 발명에 따른 바이러스를 포함하는 백신은 자연적인 감염 방식을 가장 잘 모방한다는 점에서 불활성화된 백신보다 우수한 장점을 가진다. 추가로, 그의 복제 능력을 통해 소량의 바이러스로도 백신접종이 가능하며; 그의 개수는 면역계의 유발(trigger) 수준에 도달할 때까지 자동적으로 증가할 것이다. 그 시점부터 면역계는 유발될 것이고, 최종적으로는 바이러스를 제거하게 될 것이다.

생 약독화된 바이러스는 야생의 것으로부터 단리된 바이러스와 비교하였을 때 병독성 수준이 감소된 바이러스이다. 병독성 수준이 감소된 바이러스는 심지어 HBS에 관여하는 다른 인자와 조합된 경우에도 돼지에서 사망을 유도하지 않는 바이러스인 것으로 간주된다.

그러므로, 본 발명의 본 실시양태의 한 바람직한 형태는 바이러스가 생 약독화된 형태인 것인, 본 발명에 따른 바이러스를 포함하는 백신에 관한 것이다.

약독화된 바이러스는 예컨대, 돌연변이 유인제의 존재하에서 본 발명에 따른 바이러스를 성장시킨 후, 감소된 자손 수준 및/또는 복제 속도를 보이는 바이러스를 선별함으로써 수득할 수 있다. 상기 유인제 다수가 관련 기술분야에 공지되어 있다.

빈번하게 사용되는 또 다른 방법은 시험관내 연속 계대접종이다. 바이러스는 이어서 연속 계대접종에 사용되는 세포주에 적합화되고, 이로써, 바이러스는 다시 백신으로서 천연 숙주 내로 전달되었을 때에는 약독화된 상태로 작용하게 된다. 약독화된 바이러스를 수득하는 추가의 또 다른 방법은 그의 천연 서식지의 온도에서 벗어난 온도하에서 그를 성장시키는 것이다. 온도 감수성 돌연변이체 (Ts-돌연변이체) 선별 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 상기 방법은 돌연변이 유발원의 존재하에서 바이러스를 성장시킨 후, 차선 온도 및 최적의 온도에서 성장시키고, 세포층 상에서 자손 바이러스를 적정하고, 최적 온도에서 더 느리게 성장하는 상기 플라크를 시각적으로 선별하는 것을 포함한다. 상기의 작은 플라크는 느리게 성장하며, 따라서 원하는 생 약독화된 바이러스를 포함한다.

돼지 파르보바이러스 유형 PPV를 퇴치하기 위한 생 약독화된 백신은 그 중에서도 폴(Paul) & 멩겔레(Mengeling)에 의해 ⁽³²⁾, 폴 & 멩겔레에 의해 ⁽³³⁾ 및 후지사키 에(Fujisaki e) & 무라카미(Murakami)에 의해 ⁽³⁴⁾ 기술되었다.

그러나, 생 약독화된 바이러스 사용이 가지는 가능한 단점은 본질적으로는 어느 정도 일정 수준으로는 병독성이 남아있을 수 있다는 점이다. 이는 병독성 수준이 허용되는 한, 즉, 백신이 적어도 돼지 사망을 막는 한, 실제 단점이 되지는 않는다. 물론, 생 약독화된 백신의 남아있는 병독성이 낮을수록, 백신접종 동안/그 이후에 백신접종이 체중 증가에 미치는 영향은 더 작아진다.

불활성화된 백신은 그의 생 약독화된 대응물과 달리, 본질적으로 안전한데, 그 이유는 병독성이 남아있지 않기 때문이다. 불활성화된 백신은 생 약독화된 백신과 비교하였을 때, 다소 더 많은 고용량의 바이러스를 포함한다는 사실에도 불구하고, 예컨대, 이미 다른 질환을 앓고 있는 돼지에서는 바람직한 형태의 백신일 수 있다. 예컨대, 불충분한 영양 공급 또는 차선의 하우징과 같은 차선의 조건하에서 유지되고 있는 돼지 또한 불활성화된 백신으로부터 이익을 얻을 수 있을 것이다.

그러므로, 본 실시양태의 또 다른 바람직한 형태는 바이러스가 불활성화된 형태인 본 발명에 따른 바이러스를 포함하는 백신에 관한 것이다.

전체 불활성화된 파르보바이러스는 일반적으로 돼지 또는 개 파르보바이러스이며, 이는 백신을 위한 매우 효율적이며 안전한 기반이 되는 것으로 알려져 있다. 단지 한 예로서: MSD AH (네덜란드 박스미어)는 상업적으로 이용가능한 불활성화된 돼지 파르보바이러스 유형 PPV 백신: 포실리스 파르보(Porcilis Parvo)를 생산한다. 하이프라(Hipra: 스페인) 또한 상업적으로 이용가능한 불활성화된 돼지 파르보바이러스 유형 PPV 백신: 파르보수인(PARVOSUIN)^® MR/AD를 생산한다. 조에티스(Zoetis)는 불활성화된 개 파르보바이러스: 파르박(PARVAC), 및 불활성화된 돼지 파르보바이러스 유형 PPV 백신: 돼지 파르박을 생산한다. 노바티스(Novartis)는 미국 특허 US4193991에 파르보바이러스 불활성화 방법을 제공한다.

상기 불활성화된 전체 바이러스 백신은 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스에 대한 것과 동일하게 제조될 수 있다. 공지된 파르보바이러스 백신에 대한 경우와 같이, 제조는 기본적으로 신규한 파르보바이러스를 감수성 돼지 세포에서 성장시키는 단계, 바이러스를 수거하는 단계, 바이러스를 불활성화시키는 단계, 및 불활성화된 바이러스를 제약상 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.

표준 불활성화 방법은 고전적으로 포름알데히드로 처리하는 것이다. 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 다른 불활성화 방법은 UV-조사, 감마-조사, 이성분 에틸렌-이민으로 처리, 티메로살 등이다. 통상의 기술자는 상기 방법을 어떻게 적용해야 하는지 알고 있다. 바람직하게, 바이러스는 β-프로피오락톤, 글루타르알데히드, 에틸렌-이민 또는 포름알데히드로 불활성화된다. 바이러스를 불활성화시키는 다른 방법 또한 본 발명에서 구현된다는 것은 말할 필요도 없다.

상기 명시된 바와 같이, 바이러스를 세포 배양물 중 감수성 돼지 세포 또는 세포주에서 성장시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따른 HBS 연관 돼지 파르보바이러스를 포함하는 세포 배양물에 관한 것이다. 세포 및 세포주의 예로는 SK6, PK15, 1차 또는 무한증식 돼지 신장 세포, 1차 또는 무한증식 돼지 폐포 폐 대식세포가 있다. 실제로, 신규한 돼지 파르보바이러스의 전체 바이러스 게놈은 이제 측정되었고, 신규 바이러스의 대표의 DNA 서열은 서열식별번호: 10에 제시되어 있다. 게놈의 역위 말단 반복부 (ITR)는 본원에 제시되어 있지 않다. 정의에 따르면 파르보바이러스가 공지 바이러스 중 가장 작은 바이러스에 속하는 바, 본 발명에 따른 파르보바이러스를 코딩하는 전체 ss-DNA는 쉽게 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 이유에서, 파르보바이러스는 출발 물질로서 바이러스 DNA를 사용하여 생체내에서 쉽게 제조될 수 있다. 예컨대, 그 중에서도 치우(Qiu) 등 ⁽³⁷⁾ 및 왕(Wang) 등 ⁽³⁸⁾에 의해 기술된 것과 같은, 공지된 파르보바이러스의 게놈의 역위 말단 반복부(ITR)는 서열식별번호: 10에 제시된 바이러스 게놈을 완성시키는 데 사용될 수 있다. ITR은 단지 바이러스 게놈 복제에서 중요한 역할을 할 뿐이며, 면역학적 관점에서는 어떤 관련성도 없다. 따라서, 본 발명에 따른 바이러스를 제조하고자 하는 목적에서 ITR은 상호교환이 가능하다.

전장의 파르보바이러스 DNA를 플라스미드, 예컨대, 블루스크립트(Bluescript) II SK로 클로닝하고, 이어서, 신규한 돼지 파르보바이러스를 코딩하는 발현 플라스미드로 돼지 세포를 형질감염시킴으로써 전체 파르보바이러스를 생성하는 것은 그 중에서도 치우 등 ⁽³⁷⁾ 및 왕 등 ⁽³⁸⁾에 의해 기술되어 있다. 허용 세포주, 예컨대, SK6, PK15, 1차 또는 무한증식 돼지 신장 세포, 1차 또는 무한증식 돼지 폐포 폐 대식세포는 본 목적에 바람직한 세포주가 될 것이다. 그럼에도 불구하고, 원하는 비-허용 세포주 또한 사용될 수 있다면: 그 중에서도 신규한 파르보바이러스의 게놈은 구안(Guan) 등⁽³⁹⁾에 기술된 바와 같이 아데노바이러스 유전자의 도움으로 비-허용세포에서 복제될 수 있다.

비록 전체 불활성화된 파르보바이러스가 백신을 위한 우수한 기반을 제공하지만, 그 중에서도 사용되는 숙주 세포의 유형, 사용되는 기질 및 세포 배양 배지에 따라, 백신의 생산 비용은 고가일 수 있다. 파르보바이러스의 구체적인 경우에, 전체 바이러스 사용에 대하여 관심의 대상이 되는 대안은 파르보바이러스 CP 서브유니트, 더욱 바람직하게, 소위 중공 캡시드 (empty capsid)로 불리는 형태의 서브유니트를 사용하는 것이다.

상기 중공 캡시드는 기본적으로 바이러스 유사 입자지만, 파르보바이러스 게놈은 포함하지 않는 것이다. 그 결과, 파르보바이러스 중공 캡시드 입자는 백신에 사용되기 이전에 불활성화될 필요가 없으며, 따라서, 이는 본질적으로 안전하다는 추가의 이점을 갖는다.

중공 캡시드는 단지, 적합한 발현 시스템에서 캡시드 단백질을 코딩하는 ORF2의 발현에 의해서 수득될 수 있다. 이렇게 형성된 캡시드 단백질은 중공 바이러스 입자로 어셈블리된다. 파르보바이러스 중공 캡시드는 쉽게 다량으로 제조될 수 있고, 고도한 면역원성을 띤다. 현재 파르보바이러스 중공 캡시드를 제조하는 데 사용되는 단연코 가장 많은 발현 시스템은 배큘로바이러스 기반 발현 시스템이다.

배큘로바이러스 기반 발현 시스템에서 고도한 면역원성을 띠는 파르보바이러스 중공 캡시드를 제조하는 방법은 예컨대, 마르티네즈(Martinez) ⁽¹⁸⁾, 카살(Casal) ⁽¹⁹⁾, 쥬(Zhou) 등⁽²⁰⁾에 의해 및 하오 펭(Hao Feng)⁽²¹⁾에 의해 돼지 파르보바이러스 유형 PPV에 대해 기술되었다. 다른 파르보바이러스에 대한 상기 방법은 살리키(Saliki)⁽²²⁾에 의해 및 브라운(Brown)⁽²³⁾에 의해 기술되었다.

추가로, 배큘로바이러스 발현 시스템 및 배큘로바이러스 발현 벡터는 일반적으로 예컨대, 오렐리(O'Reilly et al)⁽²⁴⁾ 및 뮤햄머(Murhammer)⁽²⁵⁾에 의한 서적에 광범위하게 기술되어 있다.

배큘로바이러스 기반 발현 시스템은 또한 예컨대, 인비크로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation: 미국 캘리포니아주 92008 칼즈배드 파라데이 애비뉴 1600)으로부터 상업적으로 이용가능하다.

배큘로바이러스 기반 발현 시스템에 대한 대안은 효모 기반 발현 시스템이다. 효모 기반 발현 시스템은 예컨대, 겔리센(Gellissen) 등⁽²⁹⁾에 의해 기술되어 있다. 즉석 발현 시스템은 그 중에서도 리서치 코포레이션 테크놀로지즈(Research Corp. Technologies: 미국 아리조나주 85711-4410 투손 스위트 240 이스트 윌리암스 써클 5210)로부터 상업적으로 이용가능하다. 효모 및 곤충 세포 발현 시스템 또한 예컨대, 클론테크 라보라토리즈, 인크.(Clontech Laboratories, Inc.: 미국 캘리포니아주 94303-4607 팔로 알토 파비안 웨이 4030)으로부터 상업적으로 이용가능하다.

캡시드 단백질의 발현은 물론 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 포유동물 세포 기반 발현 시스템에서도 또한 가능하지만, 배큘로바이러스 기반 발현 시스템과 비교하였을 때, 이들 시스템의 사용 비용이 더 고가일 가능성이 가장 클 것이다.

따라서, 본 실시양태의 또 다른 형태는 면역학상 유효량의, 본 발명에 따른 캡시드 단백질, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 돼지에서 HBS 연관 돼지 파르보바이러스를 퇴치하기 위한 백신에 관한 것이다.

본 실시양태의 바람직한 형태는 면역학상 유효량의, 중공 캡시드 형태의 본 발명에 따른 캡시드 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 돼지에서 HBS 연관 돼지 파르보바이러스를 퇴치하기 위한 백신에 관한 것이다.

캡시드의 면역원성 및 유사성 면에서 불활성화된 전체 바이러스 입자와 유사하기 때문에, 백신 중 중공 캡시드의 양 및 투여 경로는 불활성화된 전체 바이러스 입자의 것과 상용성일 것이다.

일반적으로, 1 내지 100 ㎍의 신규한 파르보바이러스 중공 캡시드인 양이 백신 용량으로서 매우 적합할 것이다. 비용 면에서, 바람직한 양은 1-50 ㎍ 범위의 중공 캡시드, 더욱 바람직하게는, 1-25 ㎍ 범위가 될 것이다.

카살 ⁽¹⁹⁾은 개 파르보바이러스 및 돼지 파르보바이러스, 둘 모두의 경우, 종래 애주번트의 존재하에서 1-3 ㎍ 만큼 소량인 용량이 상기 질환으로부터 상응하는 숙주를 전체적으로 보호하는 작용을 부여한다고 기술하였다.

불활성화된 전체 바이러스 또는 중공 캡시드에 기반하는 본 발명에 따른 백신은 바람직하게, 애주번트를 포함한다. 관련 기술분야에 널리 주지된 종래 애주번트로는 예컨대, 프로인트 완전 및 불완전 애주번트, 비타민 E, 비이온성 블록 중합체, 무라밀 디펩티드, 퀼 A(Quill A)^(R), 광유, 예컨대, 베이올(Bayol)^(R) 또는 마르콜(Markol)^(R), 식물성 오일, 및 카르보폴(Carbopol)^(R) (동종중합체), 또는 딜루박^(R) 포르테(Diluvac^(R) Forte)가 있다. 백신은 또한 소위 "비히클"이라 불리는 것 또한 포함할 수 있다. 비히클은 폴리펩티드가 그에 공유적으로 결합하지 않고, 부착되는 화합물이다. 자주 사용되는 비히클 화합물로는 예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알루미늄, 실리카, 카올린, 및 벤토나이트가 있다.

카살 ⁽¹⁹⁾은 그의 파르보바이러스 백신에서 그 중에서도 수산화알루미늄 및 퀼 A를 성공적으로 사용하였다.

원칙적으로, 본 발명에 따른 백신은 단 한 번 제공될 수 있다. 그러나, 전체 바이러스 백신 또는 중공 캡시드 백신일 수도 있는 불활성화된 백신인 경우에는 특히, 바람직하게는 또한 1차 및 가능하게는 2차 부스터 백신접종이 제공된다. 1차 부스터는 일반적으로 1차 백신접종 후 적어도 2주가 경과한 이후에 제공될 것이다. 부스터 백신접종에 매우 적합한 시점은 1차 백신접종 후 3 내지 16주이다. 필요한 경우, 2차 부스터는 일반적으로 1차 부스터 후 4 내지 50주 후에 제공될 것이다.

불활성화된 전체 바이러스 백신 접근법 및 중공 캡시드 백신 접근법에 대한 대안은 그의 숙주 동물로서 돼지를 가지는 생 재조합 비-파르보바이러스 벡터를 신규한 돼지 파르보바이러스 캡시드 단백질 유전자의 캐리어로서 사용하는 것이다.

그의 숙주 동물로서 돼지를 가지는 적합한 재조합 비-파르보바이러스 벡터 중에서, 캐리어로서 두 벡터: 가성 광견병 바이러스 (PRV) 및 고전적 돼지 열 바이러스 (CSFV)가 특히 적합하다. 백신에서 상기 재조합 바이러스를 사용하는 것에는, 백신접종받는 동물이 PRV 및 PPV 또는 CSFV 및 PPV, 둘 모두에 대하여 동시에 백신접종받을 수 있다는 추가의 장점이 있다.

첸(Chen) 등⁽²⁷⁾은 돼지 파르보바이러스 유형 PPV 캡시드 단백질을 발현하는 생 약독화된 PRV 재조합 벡터의 구축 및 용도를 기술하였다. 상기 PRV 재조합체는 5x10⁵ TCID₅₀의 양으로 8일된 새끼 돼지에게 투여되었고, 상기 양의 백신은 안전한 것으로 입증되었고, PRV 및 PPV, 둘 모두에 대해 탁월한 면역을 제공하였다.

생 약독화된 CSFV 벡터는 또한 생 재조합 벡터로서도 또한 적합하다. 단지 한 예로서; N^pro 유전자가 결실된 생 약독화된 CSFV가 마이어(Mayer) 등⁽²⁸⁾에 의해 기술되었다. 상기 생 약독화된 바이러스를 통해서 그 중에서도 N^pro 유전자 결실 부위에 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입할 수 있다. 상기 생 재조합 CSFV 벡터도 마찬가지로 신규한 돼지 파르보바이러스 캡시드 단백질 유전자에 적합한 캐리어를 형성한다.

캡시드 단백질 유전자의 발현은 포유동물 세포에서 기능성인 임의의 적합한 프로모터의 제어하에서 이루어질 수 있다. 이종성 프로모터는 야생형 형태의 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스에의 CP 유전자의 전사를 담당하는 프로모터가 아닌 프로모터이다. 이는 본 발명에 따른 파르보바이러스에 속하지 않는 또 다른 파르보바이러스의 CP 또는 NS1의 전사를 담당하는 파르보바이러스 프로모터일 수 있거나, 또는 비-파르보바이러스 프로모터일 수 있다.

그러므로, 본 발명의 또 다른 실시양태는 유전자가 기능성 이종성 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 것인, 본 발명에 따른 CP를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편에 관한 것이다.

첸 등 ⁽²⁷⁾은 캡시드 단백질 유전자의 발현을 구동시키기 위해 CMV 프로모터를 사용하였지만, 포유동물 세포에서 기능성인 다른 적합한 프로모터도 관련 기술분야에 공지되어 있다. 포유동물 세포에서 기능성인 프로모터는 포유동물 세포에서 프로모터 하류에 위치하는 유전자의 전사를 구동시킬 수 있는 프로모터이다. 포유동물 세포에서 기능성인 적합한 프로모터의 예로는 고전적 프로모터, 예컨대, (인간) 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터 (Seed, B. et al., Nature 329, 840-842, 1987; Fynan, E.F. et al., PNAS 90, 11478-11482,1993; Ulmer, J.B. et al., Science 259, 1745-1748, 1993), 라우스 육종 바이러스 LTR (RSV, Gorman, C.M. et al., PNAS 79, 6777-6781, 1982; Fynan et al., 상기 문헌 동일; Ulmer et al., 상기 문헌 동일), MPSV LTR (Stacey et al., J. Virology 50, 725-732, 1984), SV40 극초기 프로모터 (Sprague J. et al., J. Virology 45, 773 ,1983), SV-40 프로모터 (Berman, P.W. et al., Science, 222, 524-527, 1983), 메탈로티오네인 프로모터 (Brinster, R.L. et al., Nature 296, 39-42, 1982), 열 쇼크 프로모터 (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985), Ad2의 주요 후기 프로모터 및 β-액틴 프로모터 (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992)를 포함한다. 조절 서열로는 또한 종결인자 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 서열 중에는 널리 공지된 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV) 종결인자 및 폴리아데닐화 서열이 있다.

따라서, 본 실시양태의 또 다른 형태는, 백신이 기능성 프로모터의 제어하에 본 발명에 따른 CP를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 생 재조합 비-파르보바이러스 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 돼지에서 HBS 연관 돼지 파르보바이러스를 퇴치하기 위한 백신에 관한 것이다. 생 재조합 비-파르보바이러스 벡터가 면역학상 유효량의, 캡시드 단백질을 발현하여야 한다는 것은 말할 필요도 없다.

불활성화된 전체 바이러스 백신, 중공 캡시드 백신 또는 생 재조합 비-파르보바이러스 벡터를 이용한 백신접종에 대한 대안은 DNA 백신접종을 이용하는 것이다.

상기 DNA 백신접종은 적합한 프로모터의 제어하에 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 운반하는 DNA 단편을 숙주 동물 내로 도입시키는 것에 기초한다. 일단 숙주 세포에 의해 DNA가 흡수되고 나면, 숙주 세포에서 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자는 전사되고, 전사체는 캡시드 단백질로 번역된다. 이는 파르보바이러스의 천연 감염 과정에 가깝게 모방한다. 적합한 프로모터는 상기 예시된 바와 같은, 포유동물 세포에서 기능성인 프로모터이다. 적합한 프로모터의 제어하에 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 운반하는 DNA 단편은 예컨대, 플라스미드일 수 있다. 이러한 플라스미드는 고리형 또는 선형 형태의 것일 수 있다.

돼지에 대한 성공적인 DNA 백신접종의 예로는 그 중에서도 문헌 [Gerdts et al. ⁽³⁰⁾, Journal of General Virology 78: 2139-2146 (1997)]에 기술된 바와 같은 오제스키 질환(Aujeszky's disease)에 대한 성공적인 백신접종이 있다. 상기 문헌에는 인간 시토메갈로바이러스의 주요 즉시 조기 프로모터의 제어하에 당단백질 C를 운반하는 DNA 단편이 사용된 DNA 백신이 기술되어 있다. 백신접종은 50 ㎍의 DNA 양으로 2주간의 간격을 두고 4회에 걸쳐 수행되었다. 백신접종을 받은 동물에서는 면역블롯에서 각 항원을 인식하였고, 중화 활성을 보인 혈청 항체가 발생되었다.

돼지의 성공적인 DNA 백신접종의 또 다른 예는 고레스(Gorres) 등 ⁽³¹⁾에 의해 제공되었다. 고레스 등은 범유행성 및 고전적 돼지 H1N1 인플루엔자, 둘 모두에 대한 돼지의 성공적인 DNA 백신접종을 기술하였다. 고레스 등은 프라임 백신접종, 및 프라이밍 후 3주 및 6주째에 2회의 동종성 부스트로, 기능성 프로모터의 제어하에 인플루엔자 H1N1의 HA 유전자를 포함하는 DNA 백신을 백신접종하였다.

그러므로, 본 실시양태의 추가의 또 다른 형태는 백신이 기능성 프로모터의 제어하에 본 발명에 따른 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 돼지에서 HBS 연관 돼지 파르보바이러스를 퇴치하기 위한 백신에 관한 것이다. 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편이 면역학상 유효량의, 캡시드 단백질을 발현하여야 한다는 것은 말할 필요도 없다.

본 발명에 따른 전체 파르보바이러스, 본 발명에 따른 중공 캡시드, 본 발명에 따른 생 재조합 벡터 또는 DNA 백신에 대하여 "면역학상 유효량"을 구성하는 것은 원하는 효과 및 표적 유기체에 의존한다.

본원에서 사용되는 바, "면역학상 유효량"이라는 용어는, 면역화되지 않은 돼지에서 야생형 HBS 연관 돼지 파르보바이러스에 의한 감염으로 유발된 병적 효과와 비교하였을 때, 야생형 HBS 연관 돼지 파르보바이러스에 의한 감염으로 유발된 병적 효과를 감소시키는 정도로 돼지에서 면역 반응을 유도하는 데 필요한 파르보바이러스, 중공 캡시드, 생 재조합 벡터 또는 DNA 백신의 양에 관한 것이다.

예를 들어, 실험상의 접종 감염을 백신접종을 받는 동물에게 실시한 후, 이어서, 질환의 표적 동물의 임상 징후, 혈청학적 파라미터를 측정하거나, 또는 병원체의 재단리를 측정한 후, 이어서, 상기 관찰 결과를, 야생에서 감염된 돼지에서 관찰된 것과 비교함으로써, 치료가 "면역학상 유효"한지 여부를 측정하는 것은 통상의 기술자의 능력 범위 안에 잘 포함되어 있다.

바이러스 투여량은 투여 경로, 애주번트의 존재 및 투여 시점에 의존할 것이다.

본 발명에 따른 바이러스를 포함하는 생 백신의 바람직한 양은 예를 들어, 조직 배양 감염 용량(Tissue Culture Infectious Dose: TCID50)으로 표현된다. 예를 들어, 생 바이러스인 경우, 바이러스의 남은 병독성에 따라, 이롭게는 동물 1마리당 10 내지 10⁹ TCID50 용량인 용량 범위가 사용될 수 있다. 바람직하게, 10² 내지 10⁶ TCID50 범위가 사용된다.

모두 관련 기술분야에 공지된 것인, 다수의 투여 방법이 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 바람직하게는 주사를 통해 (근육내 조사 또는 복강내 경로를 통해) 또는 경구로 동물에게 투여된다.

투여를 위한 프로토콜은 표준 백신접종 관행에 따라 최적화될 수 있다. 모든 경우에서, 진피내 주사기 (IDAL)를 통한 투여가 바람직한 투여 방법이다.

백신인 본 발명에 따른 불활성화된 바이러스 또는 중공 캡시드를 포함하는 경우, 용량은 또한 투여되는 바이러스 입자의 개수로도 표현될 것이다. 생 바이러스 입자는 그가 면역계에 의해 제거되기 이전에 표적 동물에서 어느 정도까지 복제되기 때문에, 상기 용량은 일반적으로는 생 바이러스 입자 투여와 비교하였을 때 다소 더 높을 것이다. 불활성화된 바이러스에 기초한 백신인 경우, 사용되는 애주번트에 따라, 약 10⁴ 내지 10⁹개 입자 범위인 바이러스 입자의 양이 일반적으로 적합할 것이다.

백신이 서브유니트, 예컨대, 본 발명에 따른 CP를 포함하는 경우, 용량은 또한 단백질의 ㎍수로 표현될 수도 있다. 서브유니트에 기초한 백신인 경우, 적합한 용량은 역시 사용되는 애주번트에 따라, 일반적으로 5 내지 500 ㎍의 단백질 범위일 수 있다.

백신이 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 경우, 용량은 DNA의 ㎍수로 표혐될 수도 있다. 서브유니트에 기초한 백신인 경우, 적합한 용량은 그 중에서도 사용되는 플라스미드의 발현율에 따라, 일반적으로 5 내지 500 ㎍의 DNA의 범위일 수 있다. 많은 경우에서, 동물 1마리당 20 내지 50 ㎍의 플라스미드인 양이 효과적인 백신접종을 위해 충분할 것이다.

본 발명에 따른 백신은 양돈과 관련하여 투여에 적합하고, 원하는 적용 경로 및 원하는 효과에 부합하는 임의 형태를 취할 수 있다. 본 발명에 따른 백신의 제조는 통상의 기술자에게는 극히 평범한 수단에 의해 수행된다.

백신의 용이한 투여에 관한 한, 경구 경로가 바람직하다. 경구 투여를 위해, 백신을 경구 투여에 적합한 담체, 즉, 셀룰로스, 식품 또는 대사가능한 물질, 예컨대, 알파-셀룰로스 또는 식물 또는 동물 기원의 다른 오일과 함께 혼합하는 것이 바람직하다.

실제로, 돼지는 다수의 병원성 바이러스 또는 미생물에 대한 백신접종을 받게 된다. 그러므로, 돼지를 위한 본 발명에 따른 백신을 예컨대, 돼지에 병원성인 바이러스 또는 미생물의 추가 면역원과, 또는 상기 바이러스 또는 미생물의 면역원을 코딩하는 유전 정보와 조합하는 것이 실용적 및 경제적 이유, 둘 모두에 있어 매우 관심의 대상이 된다.

따라서, 본 실시양태의 바람직한 형태는 1종 이상의 다른 돼지-병원성 미생물 또는 돼지-병원성 바이러스 및/또는 상기 돼지-병원성 미생물 또는 돼지-병원성 바이러스의 1종 이상의 다른 면역원성 성분 및/또는 상기 다른 면역원성 성분을 코딩하는 유전 물질을 포함하는 것인, 본 발명에 따른 백신에 관한 것이다. 면역원 또는 면역원성 성분은 동물에서 면역 반응을 유도하는 화합물이다. 이는 예컨대, 전체 바이러스 또는 박테리아, 또는 상기 바이러스 또는 박테리아의 단백질 또는 당 모이어티일 수 있다.

돼지에 대하여 병원성인, 가장 일반적인 병원성 바이러스 및 미생물은 브라키스피라 히오디센테리아에(Brachyspira hyodysenteriae), 아프리카 돼지 열 바이러스, 니파 바이러스(Nipah virus), 돼지 써코바이러스, 돼지 토크 테노 바이러스(Porcine Torque Teno virus), 가성 광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파르보바이러스, 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스 (PRRS), 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV), 구제역 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 로타바이러스, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로 루시오파티아에(Erysipelo rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), 헤모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코쿠스 수이스(Streptococcus suis), 미코플라스마 히오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 악티노바실루스 플뢰로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae)이다.

그러므로, 본 발명의 더욱 바람직한 형태는 돼지-병원성 바이러스 또는 미생물이 브라키스피라 히오디센테리아에, 아프리카 돼지 열 바이러스, 니파 바이러스, 돼지 써코바이러스, 돼지 토크 테노 바이러스, 가성 광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파르보바이러스, 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스 (PRRS), 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV), 구제역 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 로타바이러스, 에스케리치아 콜라이, 에리시펠로 루시오파티아에, 보르데텔라 브론키셉티카, 살모넬라 콜레라수이스, 헤모필루스 파라수이스, 파스투렐라 물토시다, 스트렙토코쿠스 수이스, 미코플라스마 히오뉴모니아에 및 악티노바실루스 플뢰로뉴모니아에로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 본 발명에 따른 백신에 관한 것이다.

추가의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따른 바이러스 및/또는 본 발명에 따른 중공 캡시드 및/또는 CP 및/또는 본 발명에 따른 CP를 코딩하는 DNA 단편 및/또는 본 발명에 따른 CP를 코딩하는 생 재조합 비-파르보바이러스 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 백신 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 또 다른 실시양태는 백신에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 바이러스 및/또는 본 발명에 따른 중공 캡시드 및/또는 CP 및/또는 본 발명에 따른 CP를 코딩하는 DNA 단편 및/또는 본 발명에 따른 CP를 코딩하는 생 재조합 비-파르보바이러스 벡터에 관한 것이다.

상기 언급한 바와 같이, 출혈성 장 증후군은 다인성 증후군이다. 결국에는 HBS를 유발하는 인자들의 컴필레이션이다. 이는 최초 임상 징후가 나타나기 이전에 HBS 연관 돼지 파르보바이러스가 특정 돼지 집단에 존재하는지 여부를 아는 것이 중요하다는 것을 의미한다. 따라서, 질환으로부터 효율적으로 보호하기 위해서는 HBS 연관 돼지 파르보바이러스의 존재를 신속하게, 및 정확하게 검출하는 것이 중요하다.

그러므로, 본 발명의 또 다른 목적은 HBS 연관 돼지 파르보바이러스를 검출하는 데 적합한 진단 도구를 제공하고자 하는 것이다.

이들 도구는 부분적으로는 바이러스에 대한 항체의 이용가능성에 의존한다. 상기 항체는 예컨대, HBS 연관 돼지 파르보바이러스에 대한 진단 시험에서 사용될수 있다.

본 발명에 따른 HBS 연관 돼지 파르보바이러스에 대한 항체, 또는 항체를 포함하는 항혈청은 예컨대, 본 발명에 따른 바이러스로 돼지, 가금, 또는 토끼를 백신접종한 후, 약 4주 경과 후에 출혈시키고, 응고된 혈액을 원심분리하고, 혈청을 경사분리시킴으로써 빠르고 쉽게 수득할 수 있다. 상기 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

폴리클로날, 단일특이적 또는 모노클로날일 수 있는, HBS 연관 돼지 파르보바이러스에 대한 항체 (또는 그의 유도체)를 제조하는 다른 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 폴리클로날 항체가 바람직할 경우, 폴리클로날 혈청을 제조하고, 프로세싱하는 기법은 수십 년간 관련 기술분야에 널리 공지되어 왔으며, 예컨대, 문헌 [Mayer and Walter] ⁽³⁵⁾을 참조할 수 있다.

본 발명에 따른 바이러스에 대해 반응성인 모노클로날 항체는, 이 또한 관련 기술분야에서 오랫 동안 공지되어 온 기법에 의해 근친 교배된 마우스를 면역화시킴으로써 제조될 수 있으며, 예컨대, 문헌 [Kohler and Milstein] ⁽³⁶⁾을 참조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따른 바이러스와 반응성인 항체 또는 항혈청에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바이러스 또는 상기 바이러스의 항원성 물질의 검출에 기반하고, 따라서, HBS 연관 돼지 파르보바이러스 감염을 검출하는 데 적합한, 진단 시험용 키트는 예컨대, 표준 ELISA 시험을 포함할 수 있다. 상기 시험의 한 예에서, ELISA 플레이트의 웰의 벽을 바이러스에 대한 항체로 코팅한다. 시험하고자 하는 물질과 함께 인큐베이션시킨 후, 바이러스와 반응성인 표지된 항체를 웰에 첨가한다. 시험하고자 하는 물질이 실제로 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스를 포함할 경우, 상기 바이러스는 ELISA의 웰에 코팅된 항체에 결합하게 될 것이다. 이어서, 웰에 첨가되는 바이러스와 반응성인 표지된 항체는 결국 바이러스에 결합하게 되고, 이어서, 발색 반응을 통해 바이러스의 항원성 물질의 존재가 밝혀지게 될 것이다.

그러므로, 본 발명의 추가의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따른 바이러스와, 또는 그의 항원성 물질과 반응성인 항체를 포함하는, 본 발명에 따른 바이러스 또는 바이러스의 항원성 물질의 검출을 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다. 바이러스의 항원성 물질은 넓은 의미로 해석되어야 한다. 이는 예컨대, 붕해된 형태의 바이러스, 또는 바이러스 외막 단백질을 포함하는 바이러스 외피 물질일 수 있다. 바이러스의 물질이 바이러스에 대한 항혈청과 반응하는 한, 상기 물질은 항원성 물질인 것으로 간주된다.

혈청 중, 본 발명에 따른 바이러스 또는 바이러스의 항원성 물질과 반응성인 항체의 검출에 기반하고, 따라서, HBS 연관 돼지 파르보바이러스 감염을 검출하는 데 적합한, 진단 시험용 키트 또한 예컨대, 표준 ELISA 시험을 포함할 수 있다. 상기 시험에서, ELISA 플레이트의 웰의 벽을 예컨대, 본 발명에 따른 바이러스 또는 그의 항원성 물질로 코팅할 수 있다. 시험하고자 하는 물질, 예컨대, 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스로 감염된 것으로 의심되는 동물의 혈청과 함께 인큐베이션시킨 후, 본 발명에 따른 바이러스와 반응성인 표지된 항체를 웰에 첨가한다. 항-HBS 연관 돼지 파르보바이러스 항체가 시험되는 혈청 중에 존재할 경우, 상기 항체는 ELISA의 웰에 코팅된 바이러스에 결합하게 될 것이다. 그 결과, 추후 첨가되는, 바이러스와 반응성인 표지된 항체는 결합하지 못할 것이며, 어떤 발색 반응도 관찰되지 않을 것이다. 따라서, 발색 반응이 일어나지 않았다는 것을 통해 본 발명에 따른 바이러스와 반응성인 항체의 존재가 밝혀지게 될 것이다.

그러므로, 본 발명의 추가의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따른 바이러스 또는 그의 항원성 물질을 포함하는, 본 발명에 따른 바이러스와, 또는 바이러스의 항원성 물질과 반응성인 항체를 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다.

면역검정법의 디자인은 달라질 수 있다. 예를 들어, 면역검정법은 경쟁 또는 직접 반응에 기반할 수 있다. 추가로, 프로토콜은 고체 지지체를 이용할 수 있거나, 또는 세포 물질을 이용할 수 있다. 항체-항원 복합체의 검출은 표지된 항체를 사용하는 것을 포함할 수 있고; 표지는 예를 들어, 효소, 형광성, 화학발광성, 방사성 또는 염료 분자일 수 있다.

샘플 중 본 발명에 따른 바이러스와 반응성인 항체를 검출하는 데 적합한 방법은 상기 언급된 ELISA 이외에도, 면역형광 시험 (IFT) 및 웨스턴 블롯 분석을 포함한다.

대안적이되, 쉽고 빠른, 본 발명에 따른 바이러스의 존재 또는 부재를 진단하기 위한 진단 시험은 HBS 연관 돼지 파르보바이러스의 CP 또는 NS1 유전자의 특이 영역과 반응성인 PCR 프라이머 세트를 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 PCR 시험이다. 상기 문맥에서 특이적이라는 것은 예컨대, HBS 연관 돼지 파르보바이러스의 CP 또는 NS1 유전자에 대해 독특하다는 것, 즉, 파르보비리다에 과의 다른 구성원에는 존재하지 않는다는 것을 의미한다.

바람직하게, 상기 시험은 바이러스의 캡시드 단백질과 특이적으로 반응하는 프라이머 세트 (서열식별번호: 5-6), 또는 바이러스의 NS1과 특이적으로 반응하는 프라이머 세트 (서열식별번호: 7-8)을 이용할 것이다.

상기에서 확인된 프라이머 이외의 더 많은 프라이머가 사용될 수 있다는 것은 말할 필요도 없다. 본 발명은 HBS 연관 돼지 파르보바이러스의 CP 및 NS1 유전자의 독특한 서열을 최초로 제공한다. 이를 통해서 통상의 기술자들은 어떤 추가의 노력 없이도 다른 선별 프라이머를 선택할 수 있다. 파르보비리다에 과의 다른 비-HBS 연관, 돼지 파르보바이러스 구성원의 공지된 CP 또는 NS1 유전자와 함께, 본 발명에 의해 제공되는 HBS 연관 돼지 파르보바이러스 유전자 서열의 CP 또는 NS1 유전자를 간단히 컴퓨터 분석함으로써, 통상의 기술자는 HBS 연관 돼지 파르보바이러스의 검출을 위한 및/또는 HBS 연관 돼지 파르보바이러스와 다른 바이러스성 (돼지) 병원체 사이의 구별을 위한 진단 시험용의 다른 특이 PCR 프라이머를 개발할 수 있다.

HBS 연관 돼지 파르보바이러스의 CP 또는 NS1 유전자와 특이적으로 반응하는 PCR-프라이머는 또 다른 (돼지) 병원성 바이러스, 또는 (돼지) 병원성 바이러스 군의 CP 또는 NS1 유전자와는 반응하지 않고, 오직 HBS 연관 돼지 파르보바이러스의 CP 또는 NS1 유전자와만 반응하는 상기와 같은 프라이머인 것으로 이해하여야 한다.

따라서, 또 다른 실시양태는 HBS 연관 돼지 파르보바이러스의 CP 또는 NS1 유전자의 영역과 특이적인 반응성을 띠는 PCR 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 본 발명에 따른 바이러스를 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다.

본 실시양태의 바람직한 형태는 서열식별번호: 5-6에 제시된 프라이머 세트, 또는 서열식별번호: 7-8에 제시된 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 본 발명에 따른 바이러스를 검출하기 위한 진단 시험용 키트에 관한 것이다.

도 1: 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스의 NS1과 다른 파르보바이러스의 NS1의 관계를 나타낸 계통수이다. 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스는 "BOWL"로 언급된다.
도 2: 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스의 캡시드 단백질과 다른 파르보바이러스의 캡시드 단백질의 관계를 나타낸 계통수이다. 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스는 "BOWL"로 언급된다.
도 3: 샘플 세트 1 및 2에서 관찰된 바와 같은 출혈성 장 증후군의 예이다.

실시예

실시예 1: 샘플 세트 1의 이환된 동물 분석.

샘플 세트 1 설명

샘플 세트 1: 17마리의 동물, 수컷 돼지 16마리/암컷 돼지 1마리, 18-27주령된 동물. 7개의 농장. 2013년 7월 31일 받음.

임상 증상: 동물에서 갑자기 복부 팽만이 발생하였고, 그 중 일부는 사망 전에 날카로운 소리로 울었다. 사망 전 수준 동안 어떤 증상도 관찰되지 않았다. 최초 증상이 관찰된 시점부터 사망까지의 시간은 2-6시간이었다. 증상 발생 후, 동물을 감전사에 의해 안락사시키고, 부검하였다.

기관 증상: 소장 이상. 장내 출혈성 증상, 얇은 장벽, 혈성 체액. 붉은 색을 띄는 종창성 비대 림프절이 관찰된 것을 제외하면, 다른 기관에서는 어떤 이상도 발견되지 않았다. 도 3을 참조할 수 있다.

기관을 -70℃에서 냉동시켰다. 3000 x g로 원심분리하여 응고된 혈액으로부터 혈청을 제조하고, 이어서, -70℃에서 보관하였다.

PCR 프로토콜:

바이러스 서열로부터 유래된 프라이머 (하기 표 1)를 사용하여 PCR에 의해 단리된 DNA를 스크리닝하였다. Bowl_ORF1_774_F/1626R 프라이머 세트인 경우, 58℃, 및 Bowl_Q_ORF2_FW/REV 프라이머 세트인 경우, 52℃인 어닐링 온도를 이용하여 표준 방법을 사용함으로써 PCR을 수행하였다. Q-PCR에 대한 프로브를 디자인하였다 (표 1). 50℃의 어닐링 온도를 이용하여 표준 방법을 사용함으로써 Q-PCR을 수행하였다. 바이오-래드 CFX 매니저 2.0(Bio-Rad CFX Manager 2.0)을 이용하여 Q-PCR 데이터를 분석하였다.

<표 1>

프라이머 서열 Bowl

PCR 분석 결과:

PCR 분석 결과는 하기 표 2에 제시되어 있다. 샘플 중 총 76%가 양성인 것으로 나타났다.

<표 2>

샘플 세트 1의 결과 분석. (+): 신규 파르보바이러스에 대해 양성. (-) 신규 파르보바이러스에 대해 음성

실시예 2: 샘플 세트 2의 이환된 동물 분석.

샘플 세트 2 설명

16마리의 동물, 수컷 돼지 13마리/암컷 돼지 3마리, 12-26주령된 동물. 7개의 농장, 샘플 세트 1과 비교하여 4개 농장 추가 (샘플 세트 1 + 2에서 총 11개의 농장). 2013년 8월 22일 받음.

임상 증상: 동물에서 갑자기 복부 팽만이 발생하였고, 그 중 일부는 사망 전에 날카로운 소리로 울었다. 사망 전 수준 동안 어떤 증상도 관찰되지 않았다. 최초 증상이 관찰된 시점부터 사망까지의 시간은 2-6시간이었다. 증상 발생 후, 동물을 감전사에 의해 안락사시킨 후, 부검하였다.

기관 증상: 소장 이상. 장내 출혈성 증상, 얇은 장벽, 혈성 체액. 붉은 색을 띄는 종창성 비대 림프절이 관찰된 것을 제외하면, 다른 기관에서는 어떤 이상도 발견되지 않았다. 도 3을 참조할 수 있다. 림프절 및 혈액 샘플 모두를 시험하지는 않았다.

기관을 -70℃에서 냉동시켰다. 3000 x g로 원심분리하여 응고된 혈액으로부터 혈청을 제조하고, 이어서, -70℃에서 보관하였다.

PCR 프로토콜:

바이러스 서열로부터 유래된 프라이머 (표 1)를 사용하여 PCR에 의해 단리된 DNA를 스크리닝하였다. Bowl_ORF1_774_F/1626R 프라이머 세트인 경우, 58℃, 및 Bowl_Q_ORF2_FW/REV 프라이머 세트인 경우, 52℃인 어닐링 온도를 이용하여 표준 방법을 사용함으로써 PCR을 수행하였다. Q-PCR에 대한 프로브를 디자인하였다 (표 1). 50℃의 어닐링 온도를 이용하여 표준 방법을 사용함으로써 Q-PCR을 수행하였다. 바이오-래드 CFX 매니저 2.0을 이용하여 Q-PCR 데이터를 분석하였다.

PCR 분석 결과:

PCR 분석 결과는 하기 표 3에 제시되어 있다. 샘플 중 총 25%가 양성인 것으로 나타났다. 혈액은 분석하지 않았다. 오직 2개의 림프절만을 분석하였다.

<표 3>

샘플 세트 2의 결과 분석. (+): 신규 파르보바이러스에 대해 양성. (-) 신규 파르보바이러스에 대해 음성

실시예 3: 돼지에서의 신규 파르보바이러스 복제

동물 물질 제조:

샘플 세트 1 및 2의 냉동된 기관 물질 및 대변을 분석하기 전 -70℃에서 보관하였다. 모든 방법 절차는 얼음 상에서 수행하였다. 기관을 해동시킨 후, 조직 배양 배지 중에서 균질환시켰다 (10% w/v). 균질액을 1회에 걸쳐 냉동 해동시켰다 (-70℃). 이어서, 균질액을 원심분리하고, 5 ㎛, 0.45 ㎛ 및 0.22 ㎛ 필터 상에서 여과하여 남은 조직 물질을 제거하였다. 여과시킨 균질액을 접종시까지 -70℃에서 보관하였다.

접종물 (A 또는 B)을 4 x 2 mL IM 용량으로서 (4개의 상이한 기관, 좌측 목, 우측 목, 좌측 다리, 우측 다리) 및 20 ml의 경구 용량으로서 (10개의 대변 균질액 + 4 x 2.5 ml의 상이한 기관의 균질액) 제공하였다. 접종물을 실온에서 투여하였다.

접종물 A: 샘플 세트 2의 동물 10 (실시예 2 참조)

대변, 림프절, 폐, 비장, 장

접종물 B: 샘플 세트 1의 동물 2 (실시예 1 참조)

대변, 림프절, 폐, 신장, 간

동물

13마리의 돼지 (수퇘지 5마리/암퇘지 8마리/ 랜드레이스/좋은 건강 상태/SPF/접종 시점에 12-14주령된 동물)를 네덜란드 스티븐스빅에 소재하는 MSD에서 번식시키고, 사육하고, 기관의 가이드라이에 따라 하우징하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 접종하기 전에 혈청, 대변, 비강 면봉 채취물 및 눈 면봉 채취물 중의 신규 파르보바이러스의 존재에 대하여 동물을 스크리닝하였다. 수컷 동물 1마리를 (감염되지 않은) 대조군 동물로서 희생시켰다. 다른 12마리의 돼지는 3개의 별개 군에서 하우징하였다.

처리

1군: 5마리의 동물

3마리는 접종물 A를 받았고, 2마리는 접촉 감시 동물로서의 역할을 하였다.

2군: 4마리의 동물

동물 3마리는 접종물 B를 받았고, 2마리는 접촉 감시 동물로서의 역할을 하였다.

3군: 3마리의 동물

동물 3마리는 접종물 B를 받았다.

샘플링 및 부검

1군, 2군:

접종 후 -3, 0, 7, 14, 21, 28일째 혈액 샘플, 직장/비강/눈 면봉 채취물 (희생되지 않은 경우)

접종 후 3, 10, 17, 24일째 직장/비강/눈 면봉 채취물 (희생되지 않은 경우)

3군:

접종 후 -4, 0, 3, 6일째 혈액 샘플, 직장/비강/눈 면봉 채취물 (희생되지 않은 경우).

PCR 결과에 기초하여 동물 부검 스케줄을 잡았다:

1군:

접종받은 것: 10일째 p.i.; 25일째 p.i.; 31일째 p.i.

감시 동물: 18일째 p.i.; 31일째 p.i

2군:

접종받은 것: 14일째 p.i.; 29일째 p.i (동물 2마리)

감시 동물: 22일째 p.i.

3군:

접종받은 것: 4일째 p.i. (동물 1마리); 7일째 p.i. (동물 2마리).

결과

PCR

접종에 사용된 샘플 세트 2의 동물 10:

모든 기관이 신규 파르보바이러스에 대하여 양성 반응을 보였다: 대변, 림프절, 폐, 비장, 장, 신장, 간

접종에 사용된 샘플 세트 1의 동물 2:

모든 기관이 신규 파르보바이러스에 대하여 양성 반응을 보였다: 대변, 림프절, 폐, 신장, 간

동물 실험

면봉 채취물/혈청에 대한 PCR 결과: 하기 표 4A-B-C

조직학적 분석, PCR 분석 및 바이러스 단리를 위해 기관 샘플을 채취하였다. 바이러스 단리를 위한 기관은 -70℃에서 보관하였다. PCR을 사용하여 간 림프절 (10% 균질액)을 분석하였다

1군: 7일째 접종받은 동물의 혈청 모두 + (양성)

7일째 감시 동물 혈청 - (음성)

면봉 채취물: 표 4A를 참조할 수 있다.

2군: 7일째 접종받은 동물의 혈청 모두 +

7일째 감시 동물 혈청 -

면봉 채취물: 표 4B를 참조할 수 있다.

3군: 4일째 접종받은 동물의 혈청 모두 +

면봉 채취물: 표 4C를 참조할 수 있다.

PCR 결과

림프절 결과

부검시 수집된 13마리의 동물 모두의 간 림프절을 배양 배지 중에서 10% (w/v)로 균질화시켰다. 균질액으로부터 DNA를 단리시키고, PCR에 의해 바이러스 존재에 대해 분석하였다. 대조군 림프절은 신규 파르보바이러스에 대하여 음성이었고, 접종받은 돼지 또는 감시 돼지 12마리 모두 바이러스에 대하여 양성이었다.

결론:

상기 제시된 데이터에 기초하면, 신규 파르보바이러스는 돼지에서 복제된다고 결론지을 수 있다. 직접 접촉을 통한 경구/비강 전파 경로가 가장 가능성이 크지만, 경구/대변 전파 및 대기를 통한 전파도 배제시킬 수는 없다. 그러한, 대변 배설은 제한되어 있다.

바이러스는 다수의 기관에서 발견된다.

실시예 1-3의 조합된 결과에 기초하면, 동물 서브세트 중 전체 감염된 동물 중 약 1-2%에서 신규 파르보바이러스에 의한 감염이 대략 혈액 중 바이러스 출현 시점에 질환 (바이러스 혈증)을 유발할 것으로 예상된다. 대변 중의 배출은 최소이지만, 바이러스는 감염 후 >30일까지 혈액 중에 그대로 존재한다. 또한, 비강 및 눈 면봉 채취물은 감염 후 >30일까지 PCR 양성인 상태 그대로 유지된다. 실시예 3에 기술된 바와 같이, 감염된 돼지에서는 어떤 출혈성 장 증후군도 관찰되지 않았지만, 일반 집단에서의 1-2%로 낮은 상기 질환의 발병률, 및 실시예 3에서 사용된 동물이 비교적 어리고, 상태가 우수하였다는 사실, 이 둘 모두에 기초하면, 이는 예상될 수 있는 것이었다. 상업적 농장 환경에 있는 돼지와 달리, 이들은 어떤 소인성 위험 인자도 가지지 않았다.

<표 4A>

1군의 결과: 감염된 동물 3마리 및 감시 동물 2마리, 접종물 A

본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스는 "BOWL"로 언급된다.

R: 직장 면봉 채취물

N: 비강 면봉 채취물

E: 눈 면봉 채취물

S: 혈청

n/a: 분석되지 않음 (샘플링되지 않음)

<표 4B>

2군의 결과: 감염된 동물 3마리 및 감시 동물 1마리, 접종물 B

본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스는 "BOWL"로 언급된다.

R: 직장 면봉 채취물

N: 비강 면봉 채취물

E: 눈 면봉 채취물

S: 혈청

n/a: 분석되지 않음 (샘플링되지 않음)

<표 4C>

3군의 결과: 감염된 동물 3마리, 접종물 B

본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스는 "BOWL"로 언급된다.

R: 직장 면봉 채취물

N: 비강 면봉 채취물

E: 눈 면봉 채취물

S: 혈청

n/a: 분석되지 않음 (샘플링되지 않음)

도면 설명

도 1: 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스의 NS1과 다른 파르보바이러스의 NS1의 관계를 나타낸 계통수이다. 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스는 "BOWL"로 언급된다.

도 2: 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스의 캡시드 단백질과 다른 파르보바이러스의 캡시드 단백질의 관계를 나타낸 계통수이다. 본 발명에 따른 신규한 돼지 파르보바이러스는 "BOWL"로 언급된다.

도 3: 샘플 세트 1 및 2에서 관찰된 바와 같은 출혈성 장 증후군의 예이다.

문헌 참조

SEQUENCE LISTING <110> Intervet International B.V. <120> New Porcine Parvovirus <130> 23755 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3570 <212> DNA <213> Porcine parvovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(3570) <400> 1 atg agc cgt tct act caa aga gat ctt tgg tct ttg tta agg gag aga 48 ctt gaa agg tat aag gat cga gtt aaa tat tat ggt att ttg gtg cca 96 gaa cgt cct tct acc tta gca tct tat ttt agt aaa gac cca cct cca 144 gat cct cca act gtt aaa ttt gat aaa ccc tat cag gat gta gat aga 192 ttc tgg ttt cca aca gac gat tat agt gac tgg tat gtc tgg cat gga 240 gag gac aga cct cct aga ttt acc gag cat tcc ggt gtt cag ggt ttt 288 aaa act agg tgt gag ggg ggg ctt cct tta atg ccc agt gat ccc aaa 336 ttt tgc ccc ata caa aat ttt tgg gat cag ttc gct aat ttt gat gag 384 ggg tct ccg tcc acc cag atc ggt gag agt gtt tca tgg agt gat cat 432 ttt gga agt ccc gat ccc tct cat cat cag gag gtg agg gat gct gat 480 gaa gtt act tcc gag cgg cag caa tat aaa aat agg att gtc acc tta 528 tta aga aaa gtt tat tgg gct 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120 125 Gly Ser Pro Ser Thr Gln Ile Gly Glu Ser Val Ser Trp Ser Asp His 130 135 140 Phe Gly Ser Pro Asp Pro Ser His His Gln Glu Val Arg Asp Ala Asp 145 150 155 160 Glu Val Thr Ser Glu Arg Gln Gln Tyr Lys Asn Arg Ile Val Thr Leu 165 170 175 Leu Arg Lys Val Tyr Trp Ala Lys Gln Trp Ser Gly Lys Leu Gln Ile 180 185 190 Asn Val Pro Ser Leu Glu Ser Leu Tyr Glu Gln Ile Pro Tyr Met Leu 195 200 205 Ala Tyr Met Asp Ala Asp Asn Trp Arg Gln Asn Leu Leu Ala Ala Lys 210 215 220 Thr Leu Arg Thr Thr Leu Glu Ala Phe Ser Cys Val Pro Asp Pro Ser 225 230 235 240 Thr Cys Asp Val Thr Ile Ser Thr Pro Leu Ser Gly Glu Thr Asp Pro 245 250 255 Ala Ser Phe Ala Lys Tyr Leu Cys Ser Leu Val Cys Asn Arg Ser Gln 260 265 270 Glu Lys Glu Gln Ala Gln Thr Pro Ser Leu Ser Pro Ser Lys Gln Glu 275 280 285 Gly Gln Met Ser Ser Pro Asp Ser Ala Ser Ile Ser Gln Pro Pro Pro 290 295 300 Glu Ser His Lys Asp Arg Leu Leu Pro Lys Thr Asp Pro Leu Gln Glu 305 310 315 320 Ala Gly Pro Ile Pro Ala Pro Pro Thr Ala Gln Lys Pro Ile Ile Ser 325 330 335 Lys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Phe Ile Ile Pro Pro Lys 340 345 350 Pro Pro Ser Pro Asp His Pro Lys Asp Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 355 360 365 Ser Pro Ile Pro Pro Ser Thr Ser Ala Pro Asp Ala Glu Lys His Glu 370 375 380 Leu Glu Arg Ala Lys Gln Glu Lys Gln Glu Glu Asp Glu Leu Met His 385 390 395 400 Arg Ile Lys Ser Gly Glu Gly Glu Gly Glu Arg Gly Gly Leu Val Leu 405 410 415 Pro Ser His His Tyr Thr Gly Pro Arg Asn Pro Val Pro Ala Gly Lys 420 425 430 Pro Ala Asp Pro Val Asp Glu Ser Ser Ala Arg His Asp Ile Arg Tyr 435 440 445 Gly Gln Arg Leu Lys His Gly Asp Trp Pro Tyr Leu Trp Gly Lys Asp 450 455 460 Leu Asp Asn Ala Gln Arg Asp Glu Ile Ile Lys Ala Leu His Ser His 465 470 475 480 Val Lys Val Gly Thr Gln Leu Ala Gly Asn Ile Val Arg Ser Ile Trp 485 490 495 Lys Ala Lys Glu Leu Leu Thr Glu Pro Val Tyr Glu Leu Leu Lys Ser 500 505 510 Ile Leu Pro Pro Ser Asp Leu Ser Lys Val Pro Leu Pro His Ser Gln 515 520 525 Gln Thr Asp Arg Thr Glu Asp Pro Glu Thr Pro Gly Glu Thr Arg Gly 530 535 540 Thr Gly Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro Arg Pro Ser Gly Ser Thr Glu 545 550 555 560 Asp Gly Gly Gly Pro Ser Ser Glu Ser Arg Leu Pro Gly Thr Lys Val 565 570 575 Pro Val Asp Pro Ser Ala Thr Thr Ser Glu Ala Lys Arg Gln Arg Thr 580 585 590 Glu Glu Gly Met Asp Ile Ser Ser Cys Cys Pro Gly Gly Ile Ser Ala 595 600 605 Ser Gly Ala Ala Ser Asn Asn Ser Gly Leu Ala Cys Gly Gly Gly Gly 610 615 620 Gly Thr Asn Leu Gly Thr Glu Ser Leu Val Ser Gly Cys Gln Phe Gly 625 630 635 640 Lys Asn Ser Val Ile Thr Ser Ser Phe Arg Arg Cys Leu Ile Ser Pro 645 650 655 Trp Pro Asp Lys Tyr Cys Cys Ser Ser Ala His Asp Leu Ile Pro Gly 660 665 670 Val Val Tyr Glu Thr Pro Trp Cys Tyr Tyr Asp Leu Asn Val Ile Ser 675 680 685 Ala His Phe Ser Pro Ser Ala Trp Gln Arg Leu Leu Glu Asp Tyr Asp 690 695 700 Ala Phe Arg Pro Lys Ser Leu Lys Val Thr Ile Gln Ser Leu Val Phe 705 710 715 720 Lys Asp Val Cys Gln Gly Ala Glu Lys Gln Thr Thr Val Gln Asp Ser 725 730 735 Gln Ser Ala Thr Ile Ala Ile Phe Glu Asp Lys Asp Tyr Asp Tyr Pro 740 745 750 Tyr Val Met Gly Gly Gly Gln Lys Thr Val Pro Gly His Leu Pro Gly 755 760 765 Gln Pro Tyr Asn Leu Pro Lys Tyr Ser Tyr Arg Thr Leu Gly Ser Val 770 775 780 Lys Glu Ser Asn Arg Ala Ser Met Gly Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Lys 785 790 795 800 Ser Asn Gln Asp Thr Glu Leu Phe Leu Leu Glu Thr His Asp Ala Thr 805 810 815 Leu Ile Arg Gly Gly Gly Thr Phe Glu Gln Tyr Tyr Glu Phe Pro Asn 820 825 830 Asp Leu Pro Phe Glu Asn Leu Thr Gln Tyr Pro Trp Asp Ile Arg Arg 835 840 845 Gln Asp Asn Pro Leu Tyr Gln Gln Arg Ile Thr Val Met Ser Gly Ser 850 855 860 Asp Arg Asp Thr Val Gly Ile Leu Asp Gly Asp Phe Tyr Ser Pro Phe 865 870 875 880 Arg Phe Lys Gly His Asp Arg Pro Ala Met Trp Leu Pro Gly Gln Arg 885 890 895 Leu Ile Gln Gly Lys Phe Ile Asp Thr His Pro Ile Pro Asn Thr Gly 900 905 910 Arg Ser Gly Val His Pro Asn Asp Phe His Thr Arg Gly Asp Gly His 915 920 925 Gly Asp Thr His Arg Thr His Glu Glu Arg Ile Tyr Ser Leu Asp Thr 930 935 940 Gly Leu Ala Ala Met Pro Arg Ala Ala His Arg Pro Thr Leu Gln Pro 945 950 955 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Ala Phe Ile Leu Asp Gln Asp Gly Tyr Tyr Arg 1160 1165 1170 Leu Pro Glu His Val Trp Ser Ala Arg Glu Arg Ile Arg Ser Lys 1175 1180 1185 Arg <210> 3 <211> 1989 <212> DNA <213> Porcine parvovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(1989) <400> 3 atg tct cag acc ttc tgg acg ggt att tgc agg ctt ttc cct gat att 48 ggg aag att cct ggg gtg act cct gag cgg tat att tat gct gta aac 96 gtg agt acc cgt aat ggg caa aag tgg ccg aaa gtt ggg acc gag ggg 144 cca ttg gct gca ggt gtc tta cag ggg gag gcc ctt ttc cgt gag acc 192 ctt aaa gag gtc cgg aag gtg tgc cgg ctg ccg caa gac ccc cat ctt 240 ttc ttt caa ttg gag aaa gtt gat tcc aaa ggg ggt ctt cac ctt cat 288 ttt tgt att agt gtt gct gct ggc act cct aga gat gtg tct tcg atg 336 ttt aaa gcc att gag cgt cga gtt tcc ttt tac tac ttt ggt gta gag 384 ggc ttg act ttt ttt act cct cat aaa aat aag cat ggt gct tgg aag 432 agt aat gat gag ggc ttt att gtg aat tat ctt ctt aaa aaa ttg cct 480 ttg tct gag tgt gtg tat gcg tgg act aat atg gat ggg gtg att ggc 528 gat gcc tgt ctg aat gaa gat aag cgc agg gaa ttg ttg tct gag cgt 576 caa gat cag gga gtc att aaa gag ctc act gct cct act ttt aaa gct 624 gct acg ggt gat aaa atg ttg agt gtg gtg gat tgg atg tgt gat aat 672 gat gtg act acg gag cgc cga tgg gag gaa ata tcg gct gcg tcc ctg 720 tac tct ttc ctt gct acc cca gct ggc act cat ttg gct aaa cag tgt 768 ctt aga gct gcg aat cag cgt att gtg agc act aaa cct ctt ggt ttg 816 agt ctc tgt aaa ttt gcc agt gaa aag gag ctt cgt gct ttt caa aat 864 ggg gat cct gag ttg tct tca gac aac aat agg atc tat tac tta ttt 912 gct atg aat aat tac tgc cct gat atg gcc agt atg att ttc ttt tgg 960 tgg tct atg cgc caa acg ggt aag aga aac agt att tgg ctg ttt gga 1008 cct gct aca acc ggt aaa acc aat tta gca agt gct att gca cat act 1056 gct gcc agt tat ggg tgt gtt aac tgg aat aac gca aat ttc ccg ttt 1104 caa gac att gtg aat gtg caa ctg ggt tgg tgg gag gaa gga aag atg 1152 aca gag gat gtg gtt gaa tgt gct aag gca ttg cta ggg gga agt aat 1200 gta aga gtt gac cgc aaa tgt atg caa tct gcg gaa gtg caa tct cct 1248 cct ttt att att aca tcc aat acg gat atg tgc ctt gtt tct caa ggc 1296 agt tac atc agt ttt gag cac cag cag cct ctc cag gat aga atg att 1344 aaa ttt gag ttt aac cat gtt ctt cct ggc aat ttc ggc ctc att tct 1392 gaa gat gaa gtc gtg gcc ttc ttc aga aat ggt gct tat aat gtg ttg 1440 aag cat gcg tac atg aga aag gcc cag ctt ttt gct ctc ggt cca gct 1488 tcc ttg cca tat aag ccc cct acg ggt gaa tta gtg tgt ata gac caa 1536 gct aag tct cct tct ccc tct gct tct cgc cgc agt gtg aga aat tgg 1584 atg acg tgt ccc cct gat cct gtc cag gac gat ccc gct gaa ctg gac 1632 gag tat ttt cct cca gat act cct cca gtg gat tgt cct tgt cct att 1680 tct cct gtg agg gag tct tgt ccc tcg cca ggg cct tgc cct acc cct 1728 cct cgc aaa aaa caa cgg aag agc aag cat tgc tcc ttg tct gtc tct 1776 gcg ggt aaa gtt cct gtg gtg gtt gtg ggt gat tct gac tca gtc ccc 1824 ccc gaa gaa aaa gaa aaa gag gaa gtt tcc gtg ggg gaa tcc cag gat 1872 cca caa ctg tac tgg gac cta act ctc agt caa tcc gac gtt cct gtg 1920 cct gaa gac gag agt acc cag ttt cct gac gac gct gtg gac gct tct 1968 gat ctc att gct gaa cag tag 1989 <210> 4 <211> 662 <212> PRT <213> Porcine parvovirus <400> 4 Met Ser Gln Thr Phe Trp Thr Gly Ile Cys Arg Leu Phe Pro Asp Ile 1 5 10 15 Gly Lys Ile Pro Gly Val Thr Pro Glu Arg Tyr Ile Tyr Ala Val Asn 20 25 30 Val Ser Thr Arg Asn Gly Gln Lys Trp Pro Lys Val Gly Thr Glu Gly 35 40 45 Pro Leu Ala Ala Gly Val Leu Gln Gly Glu Ala Leu Phe Arg Glu Thr 50 55 60 Leu Lys Glu Val Arg Lys Val Cys Arg Leu Pro Gln Asp Pro His Leu 65 70 75 80 Phe Phe Gln Leu Glu Lys Val Asp Ser Lys Gly Gly Leu His Leu His 85 90 95 Phe Cys Ile Ser Val Ala Ala Gly Thr Pro Arg Asp Val Ser Ser Met 100 105 110 Phe Lys Ala Ile Glu Arg Arg Val Ser Phe Tyr Tyr Phe Gly Val Glu 115 120 125 Gly Leu Thr Phe Phe Thr Pro His Lys Asn Lys His Gly Ala Trp Lys 130 135 140 Ser Asn Asp Glu Gly Phe Ile Val Asn Tyr Leu Leu Lys Lys Leu Pro 145 150 155 160 Leu Ser Glu Cys Val Tyr Ala Trp Thr Asn Met Asp Gly Val Ile Gly 165 170 175 Asp Ala Cys Leu Asn Glu Asp Lys Arg Arg Glu Leu Leu Ser Glu Arg 180 185 190 Gln Asp Gln Gly Val Ile Lys Glu Leu Thr Ala Pro Thr Phe Lys Ala 195 200 205 Ala Thr Gly Asp Lys Met Leu Ser Val Val Asp Trp Met Cys Asp Asn 210 215 220 Asp Val Thr Thr Glu Arg Arg Trp Glu Glu Ile Ser Ala Ala Ser Leu 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Leu Ala Thr Pro Ala Gly Thr His Leu Ala Lys Gln Cys 245 250 255 Leu Arg Ala Ala Asn Gln Arg Ile Val Ser Thr Lys Pro Leu Gly Leu 260 265 270 Ser Leu Cys Lys Phe Ala Ser Glu Lys Glu Leu Arg Ala Phe Gln Asn 275 280 285 Gly Asp Pro Glu Leu Ser Ser Asp Asn Asn Arg Ile Tyr Tyr Leu Phe 290 295 300 Ala Met Asn Asn Tyr Cys Pro Asp Met Ala Ser Met Ile Phe Phe Trp 305 310 315 320 Trp Ser Met Arg Gln Thr Gly Lys Arg Asn Ser Ile Trp Leu Phe Gly 325 330 335 Pro Ala Thr Thr Gly Lys Thr Asn Leu Ala Ser Ala Ile Ala His Thr 340 345 350 Ala Ala Ser Tyr Gly Cys Val Asn Trp Asn Asn Ala Asn Phe Pro Phe 355 360 365 Gln Asp Ile Val Asn Val Gln Leu Gly Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met 370 375 380 Thr Glu Asp Val Val Glu Cys Ala Lys Ala Leu Leu Gly Gly Ser Asn 385 390 395 400 Val Arg Val Asp Arg Lys Cys Met Gln Ser Ala Glu Val Gln Ser Pro 405 410 415 Pro Phe Ile Ile Thr Ser Asn Thr Asp Met Cys Leu Val Ser Gln Gly 420 425 430 Ser Tyr Ile Ser Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Ile 435 440 445 Lys Phe Glu Phe Asn His Val Leu Pro Gly Asn Phe Gly Leu Ile Ser 450 455 460 Glu Asp Glu Val Val Ala Phe Phe Arg Asn Gly Ala Tyr Asn Val Leu 465 470 475 480 Lys His Ala Tyr Met Arg Lys Ala Gln Leu Phe Ala Leu Gly Pro Ala 485 490 495 Ser Leu Pro Tyr Lys Pro Pro Thr Gly Glu Leu Val Cys Ile Asp Gln 500 505 510 Ala Lys Ser Pro Ser Pro Ser Ala Ser Arg Arg Ser Val Arg Asn Trp 515 520 525 Met Thr Cys Pro Pro Asp Pro Val Gln Asp Asp Pro Ala Glu Leu Asp 530 535 540 Glu Tyr Phe Pro Pro Asp Thr Pro Pro Val Asp Cys Pro Cys Pro Ile 545 550 555 560 Ser Pro Val Arg Glu Ser Cys Pro Ser Pro Gly Pro Cys Pro Thr Pro 565 570 575 Pro Arg Lys Lys Gln Arg Lys Ser Lys His Cys Ser Leu Ser Val Ser 580 585 590 Ala Gly Lys Val Pro Val Val Val Val Gly Asp Ser Asp Ser Val Pro 595 600 605 Pro Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Val Ser Val Gly Glu Ser Gln Asp 610 615 620 Pro Gln Leu Tyr Trp Asp Leu Thr Leu Ser Gln Ser Asp Val Pro Val 625 630 635 640 Pro Glu Asp Glu Ser Thr Gln Phe Pro Asp Asp Ala Val Asp Ala Ser 645 650 655 Asp Leu Ile Ala Glu Gln 660 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Porcine parvovirus <400> 5 ctacatctgc gcctgac 17 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Porcine parvovirus <400> 6 gtggtgagaa ggcaagac 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Porcine parvovirus <400> 7 tgttgagtgt ggtggattgg 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Porcine parvovirus <400> 8 aaggaagctg gaccgagag 19 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Porcine parvovirus <400> 9 cacgagctag agcgtgctaa acag 24 <210> 10 <211> 5999 <212> DNA <213> Porcine parvovirus <400> 10 ttaatggacc aataggattt acttctgctt tttagggtat aaaagttcgt acttctgctt 60 tttccctcat tctgtgcttg ggagctgatc tgtttagatc tttttgcttc tctgcgccga 120 aagcctctgt attatgtctc agaccttctg gacgggtatt tgcaggcttt tccctgatat 180 tgggaagatt cctggggtga ctcctgagcg gtatatttat gctgtaaacg tgagtacccg 240 taatgggcaa aagtggccga aagttgggac cgaggggcca ttggctgcag gtgtcttaca 300 gggggaggcc cttttccgtg agacccttaa agaggtccgg aaggtgtgcc ggctgccgca 360 agacccccat cttttctttc aattggagaa agttgattcc aaagggggtc ttcaccttca 420 tttttgtatt agtgttgctg ctggcactcc tagagatgtg tcttcgatgt ttaaagccat 480 tgagcgtcga gtttcctttt actactttgg tgtagagggc ttgacttttt ttactcctca 540 taaaaataag catggtgctt ggaagagtaa tgatgagggc tttattgtga attatcttct 600 taaaaaattg cctttgtctg agtgtgtgta tgcgtggact aatatggatg gggtgattgg 660 cgatgcctgt ctgaatgaag ataagcgcag ggaattgttg tctgagcgtc aagatcaggg 720 agtcattaaa gagctcactg ctcctacttt taaagctgct acgggtgata aaatgttgag 780 tgtggtggat tggatgtgtg ataatgatgt gactacggag cgccgatggg aggaaatatc 840 ggctgcgtcc ctgtactctt tccttgctac cccagctggc actcatttgg ctaaacagtg 900 tcttagagct gcgaatcagc gtattgtgag cactaaacct cttggtttga gtctctgtaa 960 atttgccagt gaaaaggagc ttcgtgcttt tcaaaatggg gatcctgagt tgtcttcaga 1020 caacaatagg atctattact tatttgctat gaataattac tgccctgata tggccagtat 1080 gattttcttt tggtggtcta tgcgccaaac gggtaagaga aacagtattt ggctgtttgg 1140 acctgctaca accggtaaaa ccaatttagc aagtgctatt gcacatactg ctgccagtta 1200 tgggtgtgtt aactggaata acgcaaattt cccgtttcaa gacattgtga atgtgcaact 1260 gggttggtgg gaggaaggaa agatgacaga ggatgtggtt gaatgtgcta aggcattgct 1320 agggggaagt aatgtaagag ttgaccgcaa atgtatgcaa tctgcggaag tgcaatctcc 1380 tccttttatt attacatcca atacggatat gtgccttgtt tctcaaggca gttacatcag 1440 ttttgagcac cagcagcctc tccaggatag aatgattaaa tttgagttta accatgttct 1500 tcctggcaat ttcggcctca tttctgaaga tgaagtcgtg gccttcttca gaaatggtgc 1560 ttataatgtg ttgaagcatg cgtacatgag aaaggcccag ctttttgctc tcggtccagc 1620 ttccttgcca tataagcccc ctacgggtga attagtgtgt atagaccaag ctaagtctcc 1680 ttctccctct gcttctcgcc gcagtgtgag aaattggatg acgtgtcccc ctgatcctgt 1740 ccaggacgat cccgctgaac tggacgagta ttttcctcca gatactcctc cagtggattg 1800 tccttgtcct atttctcctg tgagggagtc ttgtccctcg ccagggcctt gccctacccc 1860 tcctcgcaaa aaacaacgga agagcaagca ttgctccttg tctgtctctg cgggtaaagt 1920 tcctgtggtg gttgtgggtg attctgactc agtccccccc gaagaaaaag aaaaagagga 1980 agtttccgtg ggggaatccc aggatccaca actgtactgg gacctaactc tcagtcaatc 2040 cgacgttcct gtgcctgaag acgagagtac ccagtttcct gacgacgctg tggacgcttc 2100 tgatctcatt gctgaacagt agttaaggta tgagccgttc tactcaaaga gatctttggt 2160 ctttgttaag ggagagactt gaaaggtata aggatcgagt taaatattat ggtattttgg 2220 tgccagaacg tccttctacc ttagcatctt attttagtaa agacccacct ccagatcctc 2280 caactgttaa atttgataaa ccctatcagg atgtagatag attctggttt ccaacagacg 2340 attatagtga ctggtatgtc tggcatggag aggacagacc tcctagattt accgagcatt 2400 ccggtgttca gggttttaaa actaggtgtg agggggggct tcctttaatg cccagtgatc 2460 ccaaattttg ccccatacaa aatttttggg atcagttcgc taattttgat gaggggtctc 2520 cgtccaccca gatcggtgag agtgtttcat ggagtgatca ttttggaagt cccgatccct 2580 ctcatcatca ggaggtgagg gatgctgatg aagttacttc cgagcggcag caatataaaa 2640 ataggattgt caccttatta agaaaagttt attgggctaa gcagtggtct gggaaattac 2700 aaattaatgt tccttccctc 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catagtcatg tcaaagtggg aacccaattg gcagggaata 3600 tagtgaggag tatttggaag gctaaggagc tcttaacaga acctgtgtat gagctgttaa 3660 agtctattct ccctccttca gatttatcta aagttcctct tcctcattcc caacagacag 3720 acagaacaga agatccagaa actccagggg agactagagg aactggatca gacagtcctc 3780 gatctcctcg gccttctgga tcaactgaag acgggggagg tccttcttcc gagtccagat 3840 tacctgggac taaagttcca gtagacccat ctgccaccac gtccgaagca aagaggcaga 3900 ggactgagga ggggatggac atatcttctt gctgtccagg ggggatttct gcttctgggg 3960 ctgcttcaaa taactctggt cttgcttgtg ggggtggggg gggtactaat ttagggacag 4020 aatctcttgt atccggctgt cagtttggta aaaactctgt gatcacttca tcttttagac 4080 gatgtctcat ttcaccctgg cctgataaat actgttgttc ttctgctcac gatcttattc 4140 ccggagtggt ctacgagacc ccttggtgct attatgatct gaacgtcatc tcagcacatt 4200 tttctccttc tgcttggcag aggcttttgg aggattatga tgcctttcga cctaaatccc 4260 ttaaagttac catccagtct ttagttttta aagatgtctg tcaaggtgca gaaaaacaaa 4320 ctacagttca ggattcccag tcagccacca ttgctatctt tgaggataaa gactatgact 4380 acccctatgt gatgggaggg ggtcaaaaaa cagttccggg tcacttgccc ggtcaacctt 4440 ataatcttcc caagtattct tacagaaccc ttggttcagt caaagaaagt aatagggcca 4500 gtatgggcgg ttcagggtac actttcaaat ccaatcaaga tacggaattg tttctgcttg 4560 aaacacatga tgccactctt attcgaggcg ggggtacttt tgagcagtac tatgaatttc 4620 caaacgatct tcctttcgaa aatttgactc agtatccttg ggatatccgc cgtcaggata 4680 accccctcta tcagcagagg atcactgtca tgtcaggttc tgacagagat acggtaggca 4740 ttttagatgg agatttttac tctccttttc ggttcaaagg tcatgataga cccgccatgt 4800 ggctgccagg acagaggttg attcagggca aattcataga tacgcaccca atacccaata 4860 cagggaggag tggggttcat cctaatgatt ttcacacaag gggcgatggt catggtgaca 4920 cccatagaac acatgaagag aggatctaca gtctagatac aggtcttgct gctatgccac 4980 gtgccgctca tagacccacc cttcagcccg gacctaggac tctgtctcat gccgtacgca 5040 gacccgatgg ttccaccgtg gtcacggcta atgcgtgtgc ttacgcttac acccaggaga 5100 atcctcatca ggaaccctgg agtgatctca atgtcagaca taccatgtat aggttagcct 5160 atcaacgtca aaaaggtttt cagcaacccg gggaccctct tcatattcga acccatgctt 5220 gttatgggga cggggatgtt 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Claims (4)

1. 면역학상 유효량의 캡시드 단백질(CP) 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지에서 출혈성 장 증후군(HBS) 연관 돼지 파르보바이러스를 퇴치하기 위한 백신으로서, 상기 CP는 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 1에 제시된 CP 유전자의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자에 의해 코딩되는 것인, 백신.
2. 제1항에 있어서, 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신:
   i) 1종 이상의 다른 돼지-병원성 미생물 또는 돼지-병원성 바이러스,
   ii) 상기 돼지-병원성 미생물 또는 돼지-병원성 바이러스의 1종 이상의 다른 면역원성 성분, 또는
   iii) 상기 돼지-병원성 미생물 또는 돼지-병원성 바이러스의 상기 다른 면역원성 성분을 코딩하는 1종 이상의 유전 물질.
3. 제2항에 있어서, 상기 돼지-병원성 바이러스 또는 돼지-병원성 미생물이, 브라키스피라 히오디센테리아에(Brachyspira hyodysenteriae), 아프리카 돼지 열 바이러스, 니파 바이러스(Nipah virus), 돼지 써코바이러스, 돼지 토크 테노 바이러스(Porcine Torque Teno virus), 가성 광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파르보바이러스, 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스 (PRRS), 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV), 구제역 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 로타바이러스, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로 루시오파티아에(Erysipelo rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), 헤모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코쿠스 수이스(Streptococcus suis), 미코플라스마 히오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 악티노바실루스 플뢰로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신.

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