JP2023530134A - ウイルスの別々のノイラミニダーゼ抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物を含むブタインフルエンザａウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物に関する。第１のＮＡ抗原はＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、第２のＮＡ抗原はＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、第３のＮＡ抗原はＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される。他の実施形態では、本発明は、核酸構築物を含むＲＮＡレプリコン粒子、インフルエンザＡウイルス感染に対して使用され得る、レプリコン粒子を含む免疫原性組成物、例えばワクチンに関する。

Description

本発明は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物に関する。第１のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、第２のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、第３のＮＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される。他の実施形態では、本発明は、核酸構築物を含むＲＮＡレプリコン粒子、インフルエンザＡウイルス感染に対して使用され得る、レプリコン粒子を含む免疫原性組成物、例えばワクチンに関する。

第１、第２および第３のＲＮＡレプリコン粒子を含む、ワクチンのような免疫原性組成物がさらに提供される。第１のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第１および第２のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含む。第１のＨＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４系統のものであり、そして、第２のＨＡ抗原は、ｐｄｍ０９系統のものである。第２のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、第３のＨＡ抗原はＳｃｏｔ／９４系統のものであり、第４のＨＡ抗原はＥＡ系統のものである。第３のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第１、第２および第３のＮＡ抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、第１のＮＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４系統のものであり、第２のＮＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４系統のものであり、そして、第３のＮＡ抗原は、ｐｄｍ０９系統またはＥＡ系統から選択される。ワクチンの製造方法およびワクチンの使用がさらに提供される。

インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）は、世界中でヒトおよび動物の健康に大きな負担をもたらす。ＩＡＶは、そのウイルス表面糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて異なるサブタイプに分類される。ＩＡＶは、家禽、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、海洋哺乳動物（例えば、クジラ）、コウモリおよびヒトに感染する。野生水鳥および野鳥（アヒル、ガチョウ、ハクチョウ、およびカモメ）は天然保有者であり、それらは、１６の異なるＨＡおよび９の異なるＮＡサブタイプに感染している可能性がある［Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ５６：１５２－１７９（１９９２）］。

ブタのインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）は、世界中で、特に畜産業にとって経済的に費用がかかることが証明されている家畜ブタの深刻な呼吸器病原体である［Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ（２００７）］。それは、呼吸器疾患の突然の発症を特徴とし、通常、食欲不振、嗜眠および発熱を伴う。生産動物のＩＡＶ－Ｓに関連する臨床的合併症に加えて、インフルエンザウイルスのヒトへの伝染にブタが関与しているという報告が発表されており［Ｍｙｅｒｓ ＫＰ，Ｏｌｓｅｎ ＣＷ，Ｇｒａｙ ＧＣ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２００７；４４（８）：１０８４－８，Ｋｒｕｅｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒａｙ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７０：２０１－２２５（２０１３）］、これは公衆衛生上の重大な脅威であり、ブタの集団におけるＩＡＶ制御へのさらに強い誘因を与える。

この問題に応答して、多くの養豚業者は、現在ＩＡＶ－Ｓを防ぐために市販のワクチンを使用してブタにワクチン接種する。しかしながら、多くの多様なＩＡＶ－Ｓ株が現場で同時に流行し、進化し続けるため、従来のワクチンでＩＡＶ－Ｓを制御することは困難である［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ９８（８）：２００１－２０１０（２０１７）］。ＩＡＶ－Ｓの多様性および変異性は、ウイルスの遺伝子構造によって引き起こされる。他のインフルエンザＡウイルスと同様に、ＩＡＶ－Ｓは、ＲＮＡの８つのセグメントにエンコードされる遺伝子と、頻繁な変異を導入するゲノム複製機構とを有する。これらの遺伝的特徴により、ＩＡＶ－Ｓは、迅速な適応、例えば以前の株への曝露によって誘導された既存の中和抗体からの逃避が可能になる。その結果、米国市場で市販されている不活化ウイルスＩＡＶ－Ｓワクチンは、連続的な抗原連続変異および／または抗原不連続変異の結果として新たな株の出現が起こるので、最大５つの異なるＩＡＶ－Ｓ株を含むにもかかわらず不十分であることが証明されている。

インフルエンザＡウイルスの分類は、ウイルス表面上の２つの主要な糖タンパク質であるＨＡおよびＮＡのサブタイプ分類から始まる。ＨＡタンパク質は、宿主細胞へのウイルスの付着および融合を媒介する。ノイラミニダーゼは、宿主細胞から新しく形成されたウイルス粒子を切断することによってインフルエンザウイルス複製サイクルの最終段階で機能し、それによって新しい後代ウイルスが他の細胞に拡散し感染することを可能にする酵素である。最近の研究は、ＮＡ免疫が、より重要なＨＡ免疫に対して補足的および／または相補的な役割を果たすことしかできないことを示している［Ｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４（５）：２４０８－２４２０（２０１０）；Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７（５）：７７３－７８５（２００９）；Ｓｙｌｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２５（１９）：３７６３－７２（２００７）］。実際、ヘマグルチニン抗原の非存在下では、ノイラミニダーゼインフルエンザＡウイルスワクチンの効力は、インフルエンザＡ感染に対する防御またはインフルエンザＡウイルス誘導疾患に対する防御には不十分であると思われる。

ヒトインフルエンザＡが、通常所定のインフルエンザシーズン中に世界中で流行する１または２つの優勢な株を有するのに対し、ＩＡＶ－Ｓのさらに多くの株が同時に同時流行し、これらの株は地理的地域間で異なる。同様に、ＩＡＶ－Ｓ株は抗原可変性でもあるが、主にＨＡのＨ１またはＨ３サブタイプ、および、ＮＡのＮ１またはＮ２サブタイプを含む。ＩＡＶ－Ｓの各ＨＡおよびＮＡサブタイプ内には、さらなる系統学的多様性がある。

米国のブタ集団では、Ｈ１の４つの優勢な系統学的クラスター（ガンマ、デルタ１、デルタ２、パンデミック）、Ｈ３の２つの優勢なクラスター（クラスターＩＶおよびヒト様）、Ｎ１の２つの優勢なクラスター（クラシック、パンデミック）、およびＮ２の２つの優勢なクラスター（Ｎ２－１９９８およびＮ２－２００２）が存在する［Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ ７（Ｓｕｐｐｌ．４）；４２－５１（２０１３）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＳｐｈｅｒｅ １（６）ｅ００２７５－１６：１－１４（２０１６）］。

ヨーロッパには、Ｈ１の３つの主要な系統（Ｅｕｒａｓｉａｎ－ａｖｉａｎ様Ｈ１、Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１およびｐａｎｄｅｍｉｃ ２００９様Ｈ１）、Ｈ３の１つの主要な系統（Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３）、Ｎ１の２つの主要な系統（Ｅｕｒａｓｉａｎ Ａｖｉａｎ様Ｎ１、ｐａｎｄｅｍｉｃ ２００９様Ｎ１）、Ｎ２の２つの主要な系統（Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｎ２、Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｎ２）およびＮ２のマイナーな２つの系統（Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３様Ｎ２、ヒト季節性様Ｎ２）がある［Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８９：９９２０－９９３１（２０１５）；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００８４０－１５］。

ＩＡＶ－Ｓを防ぐためのワクチン接種は、ブタにおける臨床的合併症を減らし、並びに、さらなる遺伝子再集合およびブタからヒトへの人獣共通感染症の蔓延の機会を減らすための最良の選択肢である。最近まで、広範な使用に利用可能な唯一のワクチンは胚形成卵で増殖したインフルエンザウイルスから調製された不活化ワクチンであるが、それらの供給は、主に特定病原体不在卵の不足を原因として制限されており、インフルエンザワクチンへの新しいアプローチの必要性が十分に認識されている。

従来の不活化ウイルスＩＡＶ－Ｓワクチンでは、ウイルス株の選択はＨＡ抗原特性に基づく。ＨＡ阻害（ＨＩ）抗体力価を誘導するＩＡＶ－Ｓワクチンは、ブタを抗原的に類似した株による実験的感染から保護する［Ｋｙｒｉａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １４４（１－２）：６７－７４（２０１０）］。しかしながら、ＨＡ遺伝子の比較的急速な遺伝的浮動は、ワクチン誘導ＨＡ抗体によって機能的に阻害されない新しい株を出現させる。

結果として、市販のワクチンは、現場で流行している同時期の全ての株と抗原が一致しないため、多くの場合、新規かつ新興のウイルスサブタイプ／クラスターに対して防御せず、ヘテロサブタイプ攻撃に対する限定的な防御しか提供しない、［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ７１（３）：２０７－１２（２００７）；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（１５）：２７８２－２７８７（２０１０）］。したがって、そのようなワクチンは、現在流行している株と一致するように定期的に更新されなければならない。

したがって、安全で有効であり、そして、新興株と抗原的に一致するように迅速に変更することができる新規ＩＡＶ－Ｓワクチンを開発することが当技術分野で必要とされている。

インフルエンザウイルスのようなほとんどのウイルスは比較的単純な構造であるため、防御免疫応答を生成するには、それらの抗原プロファイルからの単一抗原の使用で十分な場合があり得る。そのようなサブユニットワクチンは、ウイルスまたはその培養物からの抽出によって、または、特定の抗原の組換え発現によって製造することができる。あるいは、ウイルス抗原は、ベクターとして作用する生の組換え担体微生物によって標的動物に送達され、その内部で発現され得る。ベクターは、弱毒生であってもよく、または生でなくてもよい。特定の病原体から防御するために、ベクターに基づく多くの戦略が長年にわたってワクチンに使用されてきた。

ウイルスベクターワクチンの使用のバリエーションは、レプリコン粒子に基づくワクチンの使用である［ＲＰ；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，２０１４，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．６，ｐ．２３９２－２４１５を参照されたい］。これらはウイルス様粒子であるが、欠陥ウイルスゲノム、典型的には異種遺伝子を含む。これらのレプリコン粒子は、典型的には新しい粒子を形成する能力を有さずに標的動物宿主細胞に入り、１回のウイルスゲノム増幅を行うことができるように粒子にパッケージングされたＲＮＡを含む（すなわち、それらはカプシド化されている）。レプリコン粒子は、必要な構造タンパク質コーディング配列（類）を欠いているので、感染細胞から増殖しない。したがって、それらは、裸のＲＮＡワクチンのような他のレプリコンワクチンまたはＤＮＡプラスミドから放たれたＲＮＡを含むワクチンよりも、野生型ウイルスに類似している（例えば、向性の観点から）。

ＲＰのゲノムは、典型的には、免疫保護抗原をエンコードする異種遺伝子を発現する。
最も広範に使用され、最も大規模に研究されているのは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子［Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎｉｍ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１３，ｐ．１－９；および：Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９１，ｐ．１７２３－１７２７］であり、それは、したがって実用的な理由から好ましく、構造タンパク質遺伝子を異種遺伝子で置き換えることによってウイルスゲノムから開発された。レプリコンと呼ばれる得られたＲＮＡは、宿主細胞の細胞質に導入されると、それ自身の複製を指示することができ、高レベルの異種遺伝子を発現する。これらのレプリコンはアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を欠いているため、ビリオンを形成し、そして、隣接細胞に拡散することができない。しかしながら、レプリコンは、構造タンパク質がトランスで提供される細胞にそれらを導入することによって、ウイルスレプリコン粒子（ＲＰ）に効率的にパッケージングすることができる［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２３９，ｐ．３８９－４０１］。

また、アルファウイルスＲＰは、当技術分野で公知の、ブニヤウイルスなどの他のウイルスに基づく他のＲＰよりも幾分強い免疫賦活化剤であると考えられる。いくつかのアルファウイルス種、例えばベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２３９，ｐ．３８９－４０１］、シンドビスウイルス［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６７，ｐ．６４３９－６４４６］、およびセムリキ森林ウイルス［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ＆Ｇａｒｏｆｆ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），ｖｏｌ．９，ｐ．１３５６－１３６１］が、ＲＰワクチンを開発するために使用されている。

ＲＰワクチンは、標的動物の免疫後に粘膜および全身免疫応答を誘発することができる［Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ，ｖｏｌ．５３，ｐ．２０９－２１１］。ＶＥＥベースのＲＰワクチンは、いくつかのＵＳＤＡ認可ワクチンの基礎でもあり、それらには、ブタ流行性下痢ワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、鳥インフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）、および、処方製品、ＲＮＡ粒子（製品コード９ＰＰ０．００）が含まれる。

ＲＰベクター系は分子レベルで容易に操作することができるので、新興ウイルスサブタイプに応答するためにワクチンを迅速に製造することができる。

したがって、流行しているＩＡＶ－Ｓ株に対する広範な防御を提供する、特に欧州で流行している４つの主要なＩＡＶ－Ｓ株、すなわち、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ Ｈ１Ｎ１、Ｇｅｎｔ８４ Ｈ３Ｎ２、Ｓｃｏｔ／９４ Ｈ１Ｎ２およびｐａｎｄｅｍｉｃ２００９ Ｈ１Ｎ１に対する広範な防御を提供する新規ワクチンであって、新興ウイルスサブタイプおよび抗原連続変異に迅速に応答するように適合させることができる新規ワクチンに対する継続的な需要がある。

しかしながら、アルファウイルスレプリコンプラットフォームのようなＲＰベクター系は、最も広範な保護を達成するための任意の所望の数の抗原の挿入、例えば４つの主要な流行ＩＡＶ－Ｓ株の全てのＮＡおよびＨＡ遺伝子のレプリコンベクターへの挿入をさせない。アルファウイルスベクタープラットフォームは、典型的には、関連するパッケージングシグナルおよび構造タンパク質が除去され、異種遺伝子配列で置き換えられた非構造遺伝子を含有するＲＮＡで構成される３成分系である。２つのヘルパーＲＮＡは、パッケージングシグナルを有さないウイルス構造タンパク質を含有する。これらの３成分レプリコンに基づく系は、ウイルスキャプシドの体積によってパッケージできるＲＮＡの量が制限されている［Ｎａｎｄａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｌ．３９０（２），２００９，３６８－３７３］。ＲＰベクター系のこの固有の制約により、ほとんどまたは全ての流行ＩＡＶ－Ｓ株に対する広範な防御を有するワクチンを提供するという、継続的な需要を満たすことは困難である。

Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ５６：１５２－１７９（１９９２） Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ（２００７） Ｍｙｅｒｓ ＫＰ，Ｏｌｓｅｎ ＣＷ，Ｇｒａｙ ＧＣ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２００７；４４（８）：１０８４－８ Ｋｒｕｅｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒａｙ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７０：２０１－２２５（２０１３） Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ９８（８）：２００１－２０１０（２０１７） Ｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４（５）：２４０８－２４２０（２０１０） Ｐａｖｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７（５）：７７３－７８５（２００９） Ｓｙｌｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２５（１９）：３７６３－７２（２００７） Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ ７（Ｓｕｐｐｌ．４）；４２－５１（２０１３） Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＳｐｈｅｒｅ １（６）ｅ００２７５－１６：１－１４（２０１６） Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８９：９９２０－９９３１（２０１５）；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００８４０－１５ Ｋｙｒｉａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １４４（１－２）：６７－７４（２０１０） Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ７１（３）：２０７－１２（２００７） Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（１５）：２７８２－２７８７（２０１０） Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，２０１４，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．６，ｐ．２３９２－２４１５ Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎｉｍ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１３，ｐ．１－９ Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９１，ｐ．１７２３－１７２７ Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２３９，ｐ．３８９－４０１ Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６７，ｐ．６４３９－６４４６ Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ＆Ｇａｒｏｆｆ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），ｖｏｌ．９，ｐ．１３５６－１３６１ Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ，ｖｏｌ．５３，ｐ．２０９－２１１ Ｎａｎｄａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｌ．３９０（２），２００９，３６８－３７３

本発明の第１の態様では、驚くべきことに、２つ以上のブタインフルエンザＡウイルスヘマグルチニン（ＩＡＶ－Ｓ ＨＡ）抗原を挿入するケースでは、ＲＮＡレプリコン粒子のウイルスゲノム内のＨＡ抗原をエンコードする遺伝子の位置が誘導免疫のレベルに大きく影響することが見出された。

したがって、本発明は、異なる系統からの２つのＩＡＶ－Ｓ ＨＡ抗原の組み合わせを特定の順序でエンコードする核酸構築物を提供する。これらの核酸構築物は、ＲＮＡレプリコン粒子に使用することができる。本発明のこれらのＲＮＡレプリコン粒子は、ワクチン接種対象（例えば、ヒト、コンパニオンアニマルまたは家畜、特にブタ）におけるブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）によって引き起こされる疾患の予防に使用するためのワクチンを提供するための免疫原性組成物に使用することができる。

本発明の第１の実施形態では、核酸構築物は、Ｓｃｏｔ／９４系統およびＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様（ＥＡ）系統のＩＡＶ－Ｓ ＨＡ抗原の組み合わせを含み、Ｓｃｏｔ／９４系統のＩＡＶ－Ｓ ＨＡが最初に配置され（核酸配列の５’から３’の順序で）、ＥＡ系統のＩＡＶ－Ｓ ＨＡが２番目に配置される。「５’から３’方向に」という用語は、「下流方向に」としても知られ、当分野で公知である。「この順序で」という用語と共に、それは、宿主細胞の遺伝子発現機構と共に機能するために（すなわち、それにより核酸構築物を含む本発明によるＲＰが複製および発現され得る）、その後に合わされる要素が互いに有する必要がある相対的な配向を示すのに役立つ。当業者が理解するように、この場合、この方向は「コーディング鎖」であるゲノムの核酸鎖に関する。遺伝子は、５’から３’方向に連続した順序で存在し得、すなわち、構築物中に存在するタンパク質への発現についての中間遺伝子は存在しない。その場合、核酸構築物は、典型的には、５’から３’の順序で、主鎖ウイルス非構造タンパク質オープンリーディングフレーム、サブゲノムプロモーターとその後の第１のＨＡ抗原遺伝子配列、中間部の配列、第２のサブゲノムプロモーター配列とその後の第２のＨＡ抗原遺伝子、および最後に主鎖ウイルス３’非翻訳領域を含む。

したがって、本発明は、核酸配列の５’から３’の順序で：
Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のＩＡＶ－Ｓの第１のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１の核酸配列、および
Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする第２の核酸配列、を含む核酸構築物を提供する。

本発明の第２の実施形態では、核酸構築物は、Ｇｅｎｔ／８４系統およびｐｄｍ０９様系統のＩＡＶ－Ｓ ＨＡ抗原の組み合わせを含み、Ｇｅｎｔ／８４系統のＩＡＶ－Ｓ ＨＡが最初に配置され（核酸配列の５’から３’の順序で）、ｐｄｍ０９系統のＩＡＶ－Ｓ ＨＡが２番目に配置される。したがって、本発明は、核酸配列の５’から３’の順序で：
Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原をエンコードする第１の核酸配列、および
Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする第２の核酸配列、を含む核酸構築物を提供する。

本発明の第２の態様では、驚くべきことに、４つの主要な流行ＩＡＶ－Ｓ系統の特定の株のブタインフルエンザＡウイルスヘマグルチニン（ＩＡＶ－Ｓ ＨＡ）が、他の株と比較してＩＡＶ－Ｓに対する改善された免疫を提供し得ることが見出された。特に、ＩＡＶ－Ｓ ＨＡの特定の組み合わせが改善された免疫を提供し得ることが見出された。したがって、ＩＡＶ－Ｓ ＨＡのそのような組み合わせは、ＲＮＡレプリコン粒子に含めることができる核酸構築物に有益に使用することができる。これらのＲＮＡレプリコン粒子は、ワクチン接種対象（例えば、ヒト、コンパニオンアニマルまたは家畜、特にブタ）のＩＡＶ－Ｓに対する防御を援助し、例えばＩＡＶ－Ｓウイルス感染の防御を援助するワクチンを提供するための免疫原性組成物として使用することができる。

したがって、本発明は、本明細書で定義される特定の株の２つのＩＡＶ－Ｓ ＨＡ抗原の組み合わせをエンコードする核酸構築物をさらに提供する。

第１の実施形態では、本発明は、第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を提供し、
第１の核酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）由来のＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原をエンコードし、そして、
第２の核酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来のＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする。

第２の実施形態では、本発明は、対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防または治療に使用するための核酸構築物を提供し、核酸構築物は、第１および第２の核酸配列を含み、
第１の核酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来のＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードし、そして、
第２の核酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来のＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする。

別の重要な実施形態では、本発明の核酸構築物を含むＲＮＡレプリコン粒子が提供される。したがって、ＲＮＡレプリコン粒子は、第１または第２の実施形態による核酸構築物を含み得る。

本明細書に記載の第１および第２の態様の実施形態の任意の組み合わせが本発明に含まれる。したがって、本発明は、ＩＡＶ－Ｓ ＨＡ抗原が第１の態様で定義される特定の順序で配置され、そして、ＩＡＶ－Ｓ抗原が第２の態様で定義される特定の株に由来する核酸構築物をさらに提供する。

別の重要な態様では、本発明は、本明細書に記載される核酸構築物を含むＲＮＡレプリコン粒子を提供する。

別の重要な態様では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物を提供する。

別の重要な態様では、本発明は、ＲＮＡレプリコン粒子の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供し、この組み合わせは、第１の実施形態による核酸構築物を含む第１のＲＮＡレプリコン粒子と、第２の実施形態による核酸構築物を含む第２のＲＮＡレプリコン粒子とを含む。

本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載の免疫原性組成物を含むワクチンに関する。

別の重要な実施形態では、本発明のワクチンは、対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防または治療に使用され得る。

別の重要な実施形態では、本発明は、ブタインフルエンザＡウイルスに対してブタを免疫する方法を提供し、該方法は、本発明のワクチンの免疫学的有効量をブタに投与することを含む。

第３の態様では、驚くべきことに、異なる系統のＩＡＶ－Ｓの第１および第２のＨＡ抗原をエンコードする核酸構築物をそれぞれ含む２つのＲＮＡレプリコン粒子の組み合わせがＩＡＶ－Ｓに対する免疫の改善を提供し得ることが見出された。

したがって、本発明は、第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物をさらに提供し、第１のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第１および第２のＨＡ抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＨＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第２のＨＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のものであり、
第２のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第３のＨＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）のものであり、そして、
第４のＨＡ抗原は、Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のものである。

本発明は、本明細書に記載の第３の態様の実施形態と、第１および第２の態様の実施形態との任意の組み合わせを含有する。したがって、本発明は、第３の態様に記載のレプリコン粒子をさらに提供し、ここで核酸構築物はＩＡＶ－Ｓ ＨＡ抗原をエンコードし、これは第１の態様で定義される特定の順序で配置され、および／または、ＩＡＶ－Ｓ抗原は、第２の態様で定義される特定の株に由来する。

第４の態様では、驚くべきことに、本明細書に記載の３つの異なる系統のＩＡＶ－Ｓノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原の特定の組み合わせを含む核酸構築物が、４つの主要な流行ＩＡＶ－Ｓ系統全てに対する免疫を提供するために使用され得ることが見出された。

したがって、本発明は、ＩＡＶ－Ｓの第１、第２および第３のＮＡ抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物をさらに提供し、ここで、
第１のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、
第２のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第３のＮＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される。

別の重要な実施形態では、本発明は、第４の態様に記載される核酸構築物を含むＲＮＡレプリコン粒子を提供する。

別の重要な実施形態では、本発明は、第４の態様に記載のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物を提供する。

本発明のさらなる実施形態は、第４の態様に記載の免疫原性組成物を含むワクチンに関する。

別の重要な実施形態では、第４の態様に記載のワクチンは、対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防または治療に使用され得る。

別の重要な実施形態では、本発明は、ブタインフルエンザＡウイルスに対してブタを免疫する方法を提供し、該方法は、第４の態様に記載のワクチンの免疫学的有効量をブタに投与することを含む。

別の重要な態様では、本発明は、ＲＮＡレプリコン粒子の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供し、この組み合わせは、第３の態様による第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子と、第４の実施形態による核酸構築物を含む第３のＲＮＡレプリコン粒子とを含む。

本発明は、本明細書に記載の第４の態様の実施形態と、第１、第２および／または第３の態様の実施形態との任意の組み合わせを含有する。したがって、本発明は、第３の態様に記載のレプリコン粒子をさらに提供し、ここで、核酸構築物はＩＡＶ－Ｓ ＨＡ抗原をエンコードし、これは第１の態様で定義される特定の順序で配置され、および／または、ＩＡＶ－Ｓ抗原は、第４の態様に記載のレプリコン粒子と組み合わせて第２の態様で定義される特定の株に由来する。

ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ系統ＩＡＶ－Ｓの１つのＨＡ抗原をエンコードする単一遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導される赤血球凝集阻害（ＨＩ）抗体力価。 Ｓｃｏｔ １９９４系統ＩＡＶ－Ｓの１つのＨＡ抗原をエンコードする単一遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導されるＨＩ抗体力価。 Ｐｄｍ ２００９系統ＩＡＶ－Ｓの１つのＨＡ抗原をエンコードする単一遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導されるＨＩ抗体力価。 Ｇｅｎｔ １９８４系統ＩＡＶ－Ｓの１つのＨＡ抗原をエンコードする単一遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導されるＨＩ抗体力価。 ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ（ＥＵＨＡ１－２、ＥＵＨＡ１－３およびＥＵＨＡ１－５）の１つのＨＡ抗原と、Ｓｃｏｔ１９９４（ＥＵＨＡ１－１５またはＥＵＨＡ１－１７）系統ＩＡＶ－Ｓ株のもう１つとを、異なる組み合わせでエンコードする二重遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導されるＨＩ抗体力価。 ｐａｎｄｅｍｉｃ（ＥＵＨＡ１－１１）の１つのＨＡ抗原とＧｅｎｔ１９８４（ＥＵＨＡ３－４）のもう１つ、または、Ｓｃｏｔ１９９４（ＥＵＨ１－１５、ＥＵＨＡ１－１７）の１つのＨＡ抗原とＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ（ＥＵＨＡ１－３およびＥＵＨＡ１－５）系統ＩＡＳ株のもう１つとを、２つの異なる位置でエンコードする二重遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導されるＨＩ抗体力価。 ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ（ＥＡ）系統ＩＡＶ－Ｓの１つのＮＡ抗原をエンコードする単一遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導されるノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）抗体力価。 Ｐｄｍ０９系統ＩＡＶ－Ｓの１つのＮＡ抗原をエンコードする単一遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導される（ＮＩ）抗体力価。 Ｓｃｏｔ／９４系統ＩＡＶ－Ｓの１つのＮＡ抗原をエンコードする単一遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導される（ＮＩ）抗体力価。 Ｇｅｎｔ／８４系統ＩＡＶ－Ｓの１つのＮＡ抗原をエンコードする単一遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導される（ＮＩ）抗体力価。 異なる位置で、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ（ＥＵＮＡ１－２）の１つのＮＡ抗原およびＧｅｎｔ１９８４（ＥＵＮＡ２－７）のもう１つのＮＡをエンコードする二重遺伝子ＲＮＡ粒子、または、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ（ＥＵＮＡ１－２）、Ｇｅｎｔ１９８４（ＥＵＮＡ２－７）およびＳｃｏｔ１９９４（ＥＵＨＮＡ２－６）系統のＩＡＳ株のそれぞれの１つのＮＡ抗原をエンコードする三重遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導されるＮＩ抗体力価。 異なる位置で、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ（ＥＵＮＡ１－２）の１つのＮＡ抗原およびＧｅｎｔ１９８４（ＥＵＮＡ２－７）のもう１つのＮＡをエンコードする二重遺伝子ＲＮＡ粒子、または、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ（ＥＵＮＡ１－２）、Ｇｅｎｔ１９８４（ＥＵＮＡ２－７）およびＳｃｏｔ１９９４（ＥＵＨＮＡ２－６）もしくはＰｄｍ０９（ＥＵＮＡ１－４）系統のＩＡＶ－Ｓ株のそれぞれの１つのＮＡ抗原をエンコードする三重遺伝子ＲＮＡ粒子によって誘導されるＮＩ抗体力価。 多価ＩＡＶ－Ｓワクチンのワクチン有効性の評価結果を示す。 多価ＩＡＶ－Ｓワクチンのワクチン有効性の評価結果を示す。 多価ＩＡＶ－Ｓワクチンのワクチン有効性の評価結果を示す。 多価ＩＡＶ－Ｓワクチンのワクチン有効性の評価結果を示す。 ＩＤ投与後のワクチン有効性の評価結果を示す。 ＩＤ投与後のワクチン有効性の評価結果を示す。

用語の定義：
本発明を十分に理解するために、以下の定義を提供する。

核酸構築物は、典型的には標的細胞への移植のために、人工的に構築された核酸のセグメント（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）である。

説明の便宜のための単数形の用語の使用は、決して限定を意図するものではない。したがって、例えば、「ポリペプチド」を含む組成物への言及は、そのようなポリペプチドの１以上への言及を含む。さらに、「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」への言及は、特に明記しない限り、複数のそのようなアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への言及を含む。

本明細書で使用される場合、「およそ」という用語は、「約」という用語と互換的に使用され、値が示された値の５０％以内であること、すなわち、１ミリリットル当たり「およそ」１×１０^８個のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する組成物は、１ミリリットル当たり５×１０^７個～１．５×１０^８個のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有することを意味する。

本明細書で使用される場合、「ブタ（ｐｉｇ）」または「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」または「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」という用語は互換的に使用され、特に明記しない限り、全ての家畜化されたブタ種を含む。

本明細書で使用される場合、「系統学的クラスター」は、類似の（同族の）祖先に根ざした系統樹または進化樹において（同じ分岐上で）一緒にグループ化された、ヘマグルチニン（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）のようなインフルエンザウイルス抗原のセットである。米国で発見されたＩＡＶ－Ｓノイラミニダーゼおよびヘマグルチニンについて、優勢な系統学的クラスターが［Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ ７（Ｓｕｐｐｌ．４）：４２－５１（２０１３）］に記載されている。

本明細書で使用される場合、「系統」は、類似の（同族の）祖先に根ざした系統樹または進化樹において（同じ分岐上で）一緒にグループ化されたインフルエンザウイルスヘマグルチニンのセットである。これらのグループ分けは、欧州のヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼについて行われており、米国ウイルスの系統学的クラスターに類似しているが、同じではない。系列決定は、容易に入手可能なソフトウェア、すなわちＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ［Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．７：５３９］またはウェブでアクセス可能なＨ１ ＨＡ配列用のアノテーションツール［Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＴＫ，ｅｔ ａｌ．，ｍＳｐｈｅｒｅ，２０１６；１（６）：ｅ００２７５－１６］を使用して、予め確立された参照配列を用いて問題のＨＡまたはＮＡ配列の系統学的分析によって得ることができる。

欧州で発見されたＩＡＶ－Ｓヘマグルチニン（ＨＡ）については、［Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：９９２０－９９３１（２０１５）］に記載されるように４つの優勢な系統があり、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＳｐｈｅｒｅ １（６）：ｅ００２７５－１６（２０１６）に記載される３つのＨ１ ＨＡ分岐、および１つのＨ３ ＨＡ分岐［Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、未発表］に対応する。「Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様ｓｗｉｎｅ Ｈ１Ｎ１」（ＥＡ）と呼ばれ、ＣＳ系統とは遺伝的に異なるトリＨ１Ｎ１ウイルスがベルギーおよびドイツのブタから単離された１９７９年まで、欧州のブタはＣＳ系統のウイルスのみに感染していた。ＥＡ系統は欧州のブタの間で流行し続け、その出現以来ヒトの季節性起源ウイルスと再集合し、その結果欧州における３つの異なるウイルスサブタイプ：（ｉ）Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１ａｖＮ１（ＥＡまたは分岐１Ｃ．２．）、（ｉｉ）Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４または分岐３．１９７０．１）、および（ｉｉｉ）Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４または分岐１Ｂ．１）が生じた。２００９年４月以降、ブタ起源の（ｉｖ）Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９または分岐１Ａ．３．３．２と命名された新規Ｈ１Ｎ１ ＩＡＶウイルスが、ヒト集団全体に蔓延している。本発明の文脈において、これらの４つの系統は、したがって、「ＥＡ」、「Ｇｅｎｔ／８４」、「Ｓｃｏｔ／９４」および「ｐｄｍ０９」と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「レプリコン」という用語は、もし存在していれば細胞培養物または動物宿主において親ウイルスの増殖を成功させることができる１以上の要素（例えば、構造タンパク質のコーディング配列）を欠く、修飾ＲＮＡウイルスゲノムを指す。適切な細胞環境において、レプリコンはそれ自体を増幅し、１以上のサブゲノムＲＮＡ種を産生し得る。

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡレプリコン粒子」、略して「ＲＰ」という用語は、構造タンパク質、例えばキャプシドおよび糖タンパク質にパッケージングされたＲＮＡレプリコンであり、アルファウイルスに由来してもよく、例えばＰｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９（２）：３８９－４０１（１９９７）］によって記載されるアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子であるが、シンドビスウイルス［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６７，ｐ．６４３９－６４４６］、およびセムリキ森林ウイルス［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ＆Ｇａｒｏｆｆ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），ｖｏｌ．９，ｐ．１３５６－１３６１］であってもよい。ＲＰは、レプリコンがアルファウイルス構造成分（例えば、キャプシドおよび糖タンパク質）をエンコードしないので、（ヘルパープラスミドまたは類似の成分が無ければ）細胞培養物または動物宿主中で増殖することができない。好ましくは、本発明のＲＮＡ ＲＰはアルファウイルスＲＮＡ ＲＰである。

「非ＩＡＶ－Ｓ」という用語は、病原体および／または抗原（または免疫原）などの用語を修飾して、それぞれの病原体および／または抗原（または免疫原）がＩＡＶ－Ｓ病原体でもＩＡＶ－Ｓ抗原（または免疫原）でもないこと、および非ＩＡＶ－Ｓタンパク質抗原（または免疫原）がＩＡＶ－Ｓに由来しないことを示すために使用される。

「～に由来する」という用語は、その所与のタンパク質抗原の未修飾および／または切断されたアミノ酸配列が、その病原体またはその病原体の株によってエンコードされることを示すために本明細書で使用される。コーディング配列は、病原体に由来するタンパク質抗原のための本発明の核酸構築物内で遺伝子操作されて、それにより、由来する病原体または病原体の株（天然に弱毒化された株を含む）における、そのタンパク質抗原の対応する配列に対して発現したタンパク質抗原のアミノ酸配列の修飾および／または切断が生じてもよい。

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」、「予防」または「予防する」、「防御する」または「防御を提供する」または「保護免疫を誘発する」、「疾患の予防を助ける」および「防御の補助」という用語は、感染の徴候からの完全な防御である必要はない。例えば、「予防に使用するために」は、提供される防御が、抗原チャレンジ後に根本的な感染の症状を少なくとも軽減し、および／または、症状を引き起こす根本的な細胞性、生理学的、もしくは生化学的原因もしくは機構の１以上を軽減および／または排除するのに十分であることを意味し得る。この文脈で使用される「軽減した」とは、感染の生理学的状態だけでなく、感染の分子状態を含む感染の状態に関することを意味することが理解される。したがって、「疾患の予防」または「治療」という用語は、ウイルスの感染または感染から生じる障害に対する予防的治療を包含する。

本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、動物、例えばブタ（特定の実施形態ではヒトを含むが、他の実施形態では特にヒト用ではない）への適用に適した組成物であり、典型的には、水を含有する液体のような薬学的に許容される担体と組み合わせされた１以上の抗原を含み、動物へ投与すると、野生型微生物による感染から生じる疾患からの防御を最小限に援助するのに十分強い、すなわち疾患の予防を援助するのに十分強い免疫応答を誘導し、および／または、疾患を予防、改善または治療する。

本明細書で使用される場合、多価ワクチンは、２つ以上の異なる抗原を含むワクチンである。この種の特定の実施形態では、多価ワクチンは、２つ以上の異なる病原体に対してレシピエントの免疫系を刺激する。

用語「アジュバント」および「免疫刺激剤」は、本明細書では互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１以上の物質として定義される。これに関連して、アジュバントは、１以上のワクチン抗原／単離物に対する免疫応答を増強するために使用される。したがって、「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を非特異的に増加させ、したがって、目的の抗原に対する適切な免疫応答を生成するために、任意の所与のワクチンに必要な抗原の量、および／または、必要な注射の頻度を減少させる薬剤である。これに関連して、アジュバントは、１以上のワクチン抗原／単離物に対する免疫応答を増強するために使用される。

本明細書で使用される場合、「アジュバント非含有ワクチン」は、アジュバントを含有しないワクチンまたは多価ワクチンである。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、修飾された名詞が医薬での使用に適切であることを意味するために形容詞的に使用される。例えば、それは、医薬ワクチン中の賦形剤を説明するために使用される場合、賦形剤が組成物の他の成分と適合性であり、意図されたレシピエント動物、例えばブタに不利に有害でないことを特徴づける。

「非経口投与」には、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および注入が含まれる。

ＩＡＶ－Ｓのヘマグルチニン抗原およびノイラミニダーゼ抗原は、本明細書で定義される配列で指定される完全な、すなわち全長のタンパク質に関連し得るか、またはその抗原性断片に関連し得、この断片は、インフルエンザワクチンの分野で一般に知られているような適切な免疫学的応答を誘導するのに同等に好適であり得る（例えば、ＰＬＯＳ ＯＮＥ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｒｔｉｃｌｅ「Ａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｊｏｓｅ Ｍ．Ａｇｕｉｌａｒ－Ｙａｎｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２２，２０１０；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１１６９４；Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）「Ｏｐｔｉｍａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｓｗｉｎｅ」、Ｍａｔｔｈｅｗ Ｒ．Ｓａｎｄｂｕｌｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｍａｒｃ ３（１）２２－７３を参照されたい）。

一般に、特定のタンパク質の抗原性断片（例えば、タンパク質抗原）は、抗原性であり、すなわち免疫系の抗原認識分子、例えば免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体と特異的に相互作用することができるそのタンパク質の断片である。例えば、ＩＡＶ－Ｓヘマグルチニン（ＨＡ）の抗原性断片は、抗原性であるＨＡタンパク質の断片であり、すなわち免疫原性エピトープの機能を果たす。好ましくは、本発明の抗原性断片は、抗体および／またはＴ細胞受容体認識に免疫優性である。特定の実施形態では、所与のタンパク質の抗原に関する抗原性断片は、全長タンパク質の抗原性の少なくとも２５％を保持する（すなわち、下記に記載されるＨＩまたはＮＩ阻害アッセイによって確立されるものに相当する抗体を誘導する能力）そのタンパク質の断片である。好ましい実施形態では、抗原性断片は、全長タンパク質の抗原性の少なくとも５０％を保持する。より好ましい実施形態では、抗原性断片は、全長タンパク質の抗原性の少なくとも７５％を保持する。抗原性断片は、２０アミノ酸ほどの小さいものであり得るか、またはそれと正反対に、全長タンパク質から単一アミノ酸ほど小さい欠損がある大きな断片であり得る。特定の実施形態では、抗原性断片は、２５～１５０のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、抗原性断片は、５０～２５０のアミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合、１つのアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列に対して１００％「同一」であるか、または１００％の「配列同一性」を有する。したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合、アミノ酸配列は第２のアミノ酸配列に対して５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えばタンパク質、または比較されるポリペプチドの一部に含まれるアミノ酸残基の連続ブロックにわたって行われる。特定の実施形態では、別途２つのアミノ酸配列間の対応関係を変化させ得る、選択された欠失または挿入が考慮される。

本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の同一性パーセントは、デフォルトパラメータを有する多重配列アラインメントプログラムである、ウェブベースのＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して決定することができる［Ｓｉｅｖｅｒｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１８ Ｊａｎ；２７（１）：１３５－１４５２０１８］。同一性パーセント値は、アラインメントされる配列の各対について決定された単一の数値スコアである。それは、アラインメントの長さに関して同一の残基の数（「一致」）を測定する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａの次に、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために使用され得る他のプログラムは、Ｃ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ ＰＬＣ（１９９６）ならびにアラインメントデフォルトパラメータ、および同一性のデフォルトパラメータを有するＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムである。あるいは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ検索を、例えば、デフォルトパラメータを使用するＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージ用のプログラムマニュアル、バージョン７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを使用して、デフォルトフィルタ条件下で使用することができる。

発明の詳細な説明

本発明の第１の態様の第１の実施形態は、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする少なくとも第１および第２の核酸配列を特定の順序で組み合わせる、第１の核酸構築物に関する。核酸構築物の５’から３’の方向に第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＨＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４系統のものである。核酸構築物の５’から３’の方向に第２の核酸配列によってエンコードされる第２のＨＡ抗原は、ＥＡ系統のものである。

Ｓｃｏｔ／９４系統の第１のＨＡ抗原は、任意の株のもの、例えば株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）またはＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｆｒａｎｃｅ／３５－１４００４１（Ｈ１Ｎ２）由来であり得る。好ましい実施形態では、Ｓｃｏｔ／９４系統の第１のＨＡ抗原は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）由来である。

さらに好ましくは、第１のＨＡ抗原は、配列番号３によるアミノ酸配列、または、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらにより好ましくはそれからなる。さらに好ましくは、第１のＨＡ抗原は、配列番号３のアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

ＥＡ系統の第２のＨＡ抗原は、任意の株のもの、例えば株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｄｅｎｍａｒｋ／１０１０４８－２／２０１１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｆｒａｎｃｅ／４４－１２００７０／２０１２（Ｈ１Ｎ１）由来であり得る。好ましい実施形態では、ＥＡ系統の第２のＨＡ抗原は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来である。

さらに好ましくは、第２のＨＡ抗原は、配列番号６によるアミノ酸配列、または、少なくとも少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらにより好ましくはそれからなる。さらに好ましくは、第２のＨＡ抗原は、配列番号６のアミノ酸配列、または、少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

本発明の第２の実施形態は、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする少なくとも第１および第２の核酸配列を特定の順序で組み合わせる、第２の核酸構築物に関する。核酸構築物の５’から３’の方向で第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＨＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４系統のものである。核酸構築物の５’から３’の方向で第２の核酸配列によってエンコードされる第２のＨＡ抗原は、ｐｄｍ０９系統のものである。

Ｇｅｎｔ／８４系統の第１のＨＡ抗原は、任意の株のもの、例えば株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来であり得る。好ましい実施形態では、Ｇｅｎｔ／８４系統の第１のＨＡ抗原は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来である。

さらに好ましくは、第１のＨＡ抗原は、配列番号９によるアミノ酸配列、または、少なくとも少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらにより好ましくはそれからなる。さらに好ましくは、第１のＨＡ抗原は、配列番号９のアミノ酸配列、または、少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

ｐｄｍ０９系統の第２のＨＡ抗原は、任意の株のもの、例えば株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来であり得る。好ましい実施形態では、ＥＡ系統の第２のＨＡは、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来である。

さらに好ましくは、第２のＨＡ抗原は、配列番号１２によるアミノ酸配列、または、少なくとも少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらにより好ましくはそれからなる。さらに好ましくは、第１のＨＡ抗原は、配列番号１２のアミノ酸配列、または、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

第２の態様の第１の実施形態では、第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物が提供され、
第１の核酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）由来のＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原をエンコードし、そして、
第２の核酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来のＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする。

好ましくは、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）由来のＳｃｏｔ／９４系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原のアミノ酸配列は、配列番号３の配列、または、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはそれからなる。アミノ酸同一性は、さらに好ましくは、少なくとも９１％、９２％、より好ましくは少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはさらには９９％以上である。

好ましくは、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来のＥＡ系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原のアミノ酸配列は、配列番号６の配列、または、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはそれからなる。アミノ酸同一性は、さらに好ましくは、少なくとも９４％、９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％またはさらには９９％以上である。

第２の態様の第２の実施形態では、対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防または治療に使用するための核酸構築物が提供され、核酸構築物は、第１および第２の核酸配列を含み、
第１の核酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来のＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードし、そして、
第２の核酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来のＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする。

好ましくは、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来のＧｅｎｔ／８４系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原のアミノ酸配列は、配列番号９の配列、または、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはそれからなる。アミノ酸同一性は、好ましくは、少なくとも９６％、９７％、より好ましくは少なくとも９８％またはさらには９９％以上である。

好ましくは、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来のｐｄｍ０９系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原のアミノ酸配列は、配列番号１２の配列、または、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはそれからなる。アミノ酸同一性は、好ましくは、少なくとも９６％、９７％、より好ましくは少なくとも９８％またはさらには９９％以上である。

第１および／または第２の態様の第１および／または第２の実施形態による核酸構築物は、異種遺伝子として上記のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする核酸配列を、転写および／または発現制御核酸配列、例えばアルファウイルスサブゲノムプロモーター配列などと共に組み込んだ発現カセットに含まれてもよく、それはＨＡ抗原の発現に適している。そのような発現カセットは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターのようなベクターにＨＡ抗原をエンコードする異種核酸配列を組み込むことによる、周知の技術を使用して作製することができる。ベクターは、ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）のようなウイルスレプリコン主鎖であり得、好ましくはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。

したがって、本発明の第１および第２の態様では、第１の実施形態によるヌクレオチド構築物を含むＲＮＡ ＲＰ、好ましくはアルファウイルスＲＮＡ ＲＰがさらに提供される。さらに、本発明は、第２の実施形態によるヌクレオチド構築物を含むＲＮＡ、好ましくはアルファウイルスＲＮＡ ＲＰをさらに提供する。

「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）」は、「非伝染性」、「単一サイクル」、または「増殖不全」ウイルス様粒子ベクターとしてよく知られている。ゲノムは、その２６Ｓサブゲノムプロモーターからの１以上の異種遺伝子をエンコードすることができる。ＲＰは、子孫を生むことなく標的細胞内で複製することができ、このようにして、異種抗原（類）を標的動物の免疫系に送達し、発現させる。アルファウイルスＲＮＡ ＲＰは、ヒトベネズエラウマ脳炎ワクチン（ＶＥＥＶ）ＴＣ－８３株に基づくものであり得る。

抗原の異種発現のためのＲＰ発現系は当技術分野で利用可能であり、例えば、ワクチン製造用の市販のＲＰベクターベースのプラットフォーム、例えば、ＶＥＥウイルスに基づくＡｌｐｈａｖａｃｃｉｎｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｓｙｓｔｅｍ、およびＭＳＤ／Ｍｅｒｃｋ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡから入手できるＳＥＱＵＩＶＩＴＹ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを含む。したがって、さらに好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコン粒子である。

例えば、ウイルスＨＡ抗原遺伝子（類）を、次いで（２６Ｓ－アルファウイルス）サブゲノムプロモーターから発現させることができ、そして、転写されたレプリコンＲＮＡを、パッケージング細胞株による構造タンパク質の発現によって、またはレプリコンＲＮＡ、および構造タンパク質をエンコードする１以上の「ヘルパー」ＲＮＡの適切な宿主細胞への同時トランスフェクションによって、ＲＰにパッケージングすることができる。ＶＥＥ ＴＣ－８３ ＲＮＡレプリコン粒子の生成は、例えば、米国特許第９，４４１，２４７号および米国特許第８，４６０，９１３号に記載されている。手短に言えば、ＨＡまたはＮＡ遺伝子は、ＳＩＶ株からの配列を使用してデノボ合成された（ＤＮＡ２．０）。２つのＨＡまたは３つのＮＡ遺伝子を、タンデムの単方向性発現カセットを使用してレプリコンベクタープラスミドにクローニングし、配列を確認してクローニングプロセスにおいて変異が導入されないことを確保した。ＲＮＡを、以前に記載されたように、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して線状化レプリコンプラスミドＤＮＡのインビトロ転写によって生成した［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７；３６０（２）：３７６－３８７］。ＨＡまたはＮＡレプリコンＲＮＡおよび構造遺伝子ヘルパーＲＮＡをＶｅｒｏ細胞に同時エレクトロポレーションし、その後粒子を回収することによって、ＲＰを生成した［Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９；２８（２）：４９４－５１１］。

クローニング、トランスフェクション、組換え、選択および増幅を含む一般的な分子生物学的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」［２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００３，ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ；Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：「ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０８７９６９６５４０；および「ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，ｂｙ：Ｊ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ ａｎｄ Ｄ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１］のような標準的な教科書で非常に詳細に説明されている。

本発明の核酸構築物は、核酸構築物を含む免疫原性組成物に使用することができる。好ましくは、免疫原性組成物は、本発明の核酸構築物を含む１以上のレプリコン粒子を含む。したがって、本発明のレプリコン粒子は、レプリコン粒子を含む、ワクチンのような免疫原性組成物に使用することができる。免疫原性組成物またはワクチンは、レプリコン粒子からなってもよく、または担体またはアジュバントのような追加の成分と組み合わせたレプリコン粒子を含んでもよい。本発明の免疫原性組成物は、対象におけるブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）によって引き起こされる疾患の予防に使用するためのワクチンに使用され得る。

したがって、第１および／または第２の態様では、本発明は、第１の実施形態による核酸構築物を含むＲＮＡ ＲＰを含むか、またはそれからなる免疫原性組成物をさらに提供する。あるいは、本発明は、第２の実施形態による核酸構築物を含むＲＮＡ ＲＰを含むか、またはそれからなる免疫原性組成物をさらに提供する。

第１および／または第２の態様の好ましい実施形態では、本発明は、第１の実施形態によるヌクレオチド構築物を含む第１のＲＮＡ ＲＰと、第２の実施形態によるヌクレオチド構築物を含む第２のＲＮＡ ＲＰとを含む免疫原性組成物を提供する。本発明では、第１および第２の実施形態によるレプリコン粒子の組み合わせを含む免疫原性組成物が、既存のＩＡＶ－Ｓ系統に対する広範な防御を提供することを示すことができ、したがって、そのような免疫原性組成物は、ワクチン接種対象、例えばブタ（例えば、雌ブタまたは仔ブタ）のＩＡＶ－Ｓ感染に対する防御を援助する、すなわち予防または治療を援助するワクチンとして有益に使用され得る。

したがって、好ましい実施形態では、本発明は、第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子を含む、ワクチンのような免疫原性組成物を提供し、
（ｉ）第１のＲＮＡレプリコン粒子、好ましくは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１および第２のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＨＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４系統のものであり、そして、
第２のＨＡ抗原は、ｐｄｍ０９系統のものであり、
（ｉｉ）第２のＲＮＡレプリコン粒子、好ましくは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第３のＨＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４のものであり、そして、
第４のＨＡ抗原は、ＥＡ系統のものである。

特に好ましい実施形態では、本発明は、第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンのような免疫原性組成物を提供し、
（ｉ）第１のＲＮＡレプリコン粒子、好ましくは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、
核酸配列の５’から３’の順序で、
Ｓｃｏｔ／９４系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原をエンコードする第１の核酸配列と ＥＡ系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする第２の核酸配列と、
を含む第１の核酸構築物を含み、
（ｉｉ）第２のＲＮＡレプリコン粒子、好ましくは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、核酸配列の５’から３’の順序で、
Ｇｅｎｔ／８４系統のＩＡＶ－Ｓの第３のＨＡ抗原をエンコードする第３の核酸配列と、
ｐｄｍ０９系統のＩＡＶ－Ｓの第４のＨＡ抗原をエンコードする第４の核酸配列と、
を含む第２の核酸構築物を含む。

特に好ましい実施形態では、本発明は、第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンのような免疫原性組成物を提供し、
（ｉ）第１のＲＮＡレプリコン粒子、好ましくは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、
核酸配列の５’から３’の順序で、
Ｓｃｏｔ／９４系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原をエンコードする第１の核酸配列と ＥＡ系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする第２の核酸配列と、を含む第１の核酸構築物を含み、
（ｉｉ）第２のＲＮＡレプリコン粒子、好ましくは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、核酸配列の５’から３’の順序で、
Ｇｅｎｔ／８４系統のＩＡＶ－Ｓの第３のＨＡ抗原をエンコードする第３の核酸配列と、
ｐｄｍ０９系統のＩＡＶ－Ｓの第４のＨＡ抗原をエンコードする第４の核酸配列と、
を含む第２の核酸構築物を含む。

したがって、第３の態様では、本発明は、第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンのような免疫原性組成物を提供し、
（ｉ）第１のＲＮＡレプリコン粒子、好ましくは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、核酸配列の５’から３’の順序で、ブタインフルエンザウイルスＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１および第２のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＨＡ抗原は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来のＧｅｎｔ／８４系統のものであり、好ましくは、配列番号９のもの、またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、そして、
第１の核酸配列によってエンコードされる第２のＨＡ抗原は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来のｐｄｍ０９系統のものであり、好ましくは、配列番号１２のもの、またはその少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
（ｉｉ）第２のＲＮＡレプリコン粒子、好ましくは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、核酸配列の５’から３’の順序で、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第３の核酸配列によってエンコードされる第３のＨＡ抗原は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５株（Ｈ１Ｎ２）由来のＳｃｏｔ／９４系統のもの、好ましくは、配列番号３のもの、またはその少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、そして、
第４の核酸配列によってエンコードされる第４のＨＡ抗原は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来のＥＡ系統のもの、好ましくは、配列番号６のもの、またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。

第３の態様の核酸構築物、免疫原性組成物およびレプリコン粒子は、本発明の第１および第２の態様について上述した通りである。したがって、本発明は、本明細書に記載の第３の態様の実施形態と、第１および第２の態様の実施形態との任意の組み合わせをさらに含有する。したがって、本発明は、第３の態様に記載のレプリコン粒子をさらに提供し、ここで、核酸構築物は、ＩＡＶ－Ｓ ＨＡ抗原をエンコードし、これは第１の態様で定義される特定の順序で配置され、および／または、ＩＡＶ－Ｓ抗原は、第２の態様で定義される特定の株に由来する。

免疫原性組成物は、上記のような第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子の同時または連続投与、すなわち第１および第２の実施形態による核酸構築物を含むＲＮＡ ＲＰの同時または連続投与に適合させることができる。好ましくは、免疫原性組成物は、第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子の同時投与に適合している。したがって、好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、単位剤形の第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子を含む。

さらに好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、１以上の追加のＲＮＡレプリコン粒子を含み得る。そのような追加のＲＮＡ ＲＰは、１以上の追加の抗原をエンコードする核酸構築物を含み得る。例えば、追加のＲＮＡ ＲＰは、ＩＡＶ－Ｓの１以上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする核酸構築物を含み得る。特定の実施形態では、核酸構築物は、ＩＡＶ－Ｓの２つまたは３つ、好ましくは３つのＮＡ抗原、またはその免疫原性断片をエンコードする。

特に好ましい実施形態では、追加のＲＮＡ ＲＰは、ＩＡＶ－Ｓの第１、第２および第３のＮＡ抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物をさらに含み、ここで、
第１のＮＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４系統のものであり、
第２のＮＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４系統のものであり、そして、
第３のＮＡ抗原は、ｐｄｍ０９系統またはＥＡ系統から選択される。

したがって、本発明の第４の態様では、ＩＡＶ－Ｓの第１、第２および第３のＮＡ抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物がさらに提供され、ここで、
第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＮＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４系統のものであり、
第２の核酸配列によってエンコードされる第２のＮＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４系統のものであり、そして、
第３の核酸配列によってエンコードされる第３のＮＡ抗原は、ｐｄｍ０９系統またはＥＡ系統から選択される。

好ましくは、Ｓｃｏｔ／９４系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＮＡ抗原のアミノ酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／６１４７０／２０１３（Ｈ１Ｎ２）に由来する。第１のＮＡ抗原のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号１５の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはそれからなる。アミノ酸同一性は、好ましくは少なくとも９６％、９７％、より好ましくは、少なくとも９８％またはさらには９９％以上である。

好ましくは、Ｇｅｎｔ／８４系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＮＡ抗原のアミノ酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４８１４７－８／２０１５（Ｈ３Ｎ２）に由来する。第２のＮＡ抗原のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号１８の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはそれからなる。アミノ酸同一性は、好ましくは少なくとも９６％、９７％、より好ましくは、少なくとも９８％またはさらには９９％以上である。

好ましくは、ｐｄｍ０９系統のＩＡＶ－Ｓの第３のＮＡ抗原のアミノ酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１７９０５７／２０１５（Ｈ１Ｎ１）に由来し、好ましくは株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１７９０５７／２０１５（Ｈ１Ｎ１）に由来する。第３のＮＡ抗原のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号２１の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはそれからなる。アミノ酸同一性は、好ましくは少なくとも９６％、９７％、より好ましくは、少なくとも９８％またはさらには９９％以上である。

あるいは、ＥＡ系統のＩＡＶ－Ｓの第３のＮＡ抗原のアミノ酸配列は、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）に由来する。第３のＮＡ抗原のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号２４の配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはそれからなる。アミノ酸同一性は、好ましくは少なくとも９６％、９７％、より好ましくは、少なくとも９８％またはさらには９９％以上である。

ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物含むＲＮＡレプリコン粒子、好ましくはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子がさらに提供され、ここで、
第１のＮＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４系統のものであり、
第２のＮＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４系統のものであり、そして、
第３のＮＡ抗原は、ｐｄｍ０９系統またはＥＡ系統から選択される。

第４の態様による核酸構築物を含むレプリコン粒子は、単独で、または本明細書に記載の本発明の第１、第２および／または第３の態様によるレプリコン粒子と組み合わせて使用することができ、そして、本発明の第１、第２および／または第３の態様に記載のヘマグルチニン抗原を含むレプリコン粒子と組み合わせて有益に使用される。

この第４の態様によるレプリコン粒子は特に限定されず、好ましくはアルファウイルスレプリコン粒子のようなレプリコン粒子、最も好ましくは、第１、第２および／または第３の態様に記載されるベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。

さらに好ましい実施形態では、本発明は、第１、第２および第３のＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンのような免疫原性組成物を提供し、
第１のＲＮＡレプリコン粒子は、核酸配列の５’から３’の順序で、ＩＡＶ－Ｓの第１および第２のＨＡ抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＨＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４系統のものであり、そして、
第２のＨＡ抗原は、ＥＡ系統のものであり、
第２のＲＮＡレプリコン粒子は、核酸配列の５’から３’の順序で、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第３のＨＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４系統のものであり、そして、
第４のＨＡ抗原は、ｐｄｍ０９系統のものであり、そして、
第３のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第１、第２および第３のＮＡ抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＮＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４系統のものであり、
第２のＮＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４系統のものであり、そして、
第３のＮＡ抗原は、ｐｄｍ０９系統またはＥＡ系統から選択される。

ワクチンのような上記の免疫原性組成物は、ブタ（例えば、雌ブタまたは仔ブタ）のようなワクチン接種対象のＩＡＶ－Ｓ感染に対する防御を補助するワクチンとして有益に使用することができる。

免疫原性組成物は、上記のような第１、第２および第３のＲＮＡレプリコン粒子の同時または連続投与、すなわち第１、第２および／または第３の態様による核酸構築物を、第４の態様による核酸構築物と組み合わせて含むＲＮＡ ＲＰの同時または連続投与に適合させることができる。好ましくは、免疫原性組成物は、第１、第２および第３のＲＮＡレプリコン粒子の同時投与に適合している。したがって、好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、単位剤形の第１、第２および第３のＲＮＡレプリコン粒子を含む。

本発明はまた、複数のブタ病原体に対するワクチンを提供する。例えば、タンパク質抗原もしくはその抗原性断片のコーディング配列、またはブタワクチンに有用なそのようなタンパク質抗原のコーディング配列の組み合わせを、本明細書に記載されるように、ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）に加えることができ、および／または、ワクチン中のＩＡＶ－Ｓに由来するＨＡまたはＮＡをエンコードするものと同じＲＰで組み合わせることができる。１以上のタンパク質抗原またはその抗原性断片の起源となり得る病原体の例として、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）、ブタ仮性狂犬病（ＰＰＲＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ブタロタウイルス（ＰＲＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）、複数の血清型のパスツレラ・ムルトシダ、サルモネラ属菌、大腸菌、例えば（血清型Ｋ９９、Ｋ８８、９８７ＰまたはＦ４１）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、マイコプラズマ属菌（例えば、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）、気管支敗血症菌、丹毒（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ ｓｓｐ．）、カンピロバクター属菌、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含む。

さらに、本発明は、これらのブタ抗原の１以上をエンコードする１以上の他のベクター（例えば、ブタサーコウイルス－２（ＰＣＶ－２）および／またはブタサーコウイルス－３（ＰＣＶ－３）、および／またはこれらのブタ病原体の１以上に由来する不活化トキソイド由来のＯＲＦ－２タンパク質をエンコードするバキュロウイルスベクター）と組み合わせて、本発明の１以上のＲＰを含むワクチンを提供する。さらに、そのようなワクチンは、本発明のワクチン中のＩＡＶ－Ｓに由来するＨＡおよび／またはＮＡをエンコードする任意のＲＮＡレプリコン粒子を、１以上の死滅および／または修飾（弱毒化）した生のブタウイルス単離物および／またはブタ細菌と共に含むことができる。

したがって、ＩＡＶ－Ｓに由来する１以上のＨＡおよび／またはＮＡをエンコードする１以上のＲＮＡ ＲＰを、１以上のブタ抗原および／または１以上の死滅および／または修飾（弱毒化）生ウイルス単離物、例えば１以上の死滅または修飾生ＩＡＳ－Ｖ株、１以上の死滅および／または修飾生ＰＲＲＳウイルス、１以上の死滅および／または修飾生ＰＣＶ、１以上の死滅および／または修飾生ＴＧＥ、１以上の死滅および／または修飾生ＰＰＲＶ、１以上の死滅および／または修飾生ＰＰＶ、１以上の死滅および／または修飾生ＰＲＶ、ならびに１以上の死滅および／または修飾生ＰＥＤをエンコードする１以上の他のベクターと一緒に加えることができる。さらに、ＩＡＶ－Ｓに由来する１以上のＨＡまたはＮＡをエンコードする１以上のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）を、１以上のブタ抗原をエンコードする１以上の他のベクターと一緒に加えることができ、および／または、ブタにも感染することができる１以上の死滅および／または修飾（弱毒化された）生細菌、例えば、１以上の死滅および／または修飾（１以上の血清型の）生パスツレラ・ムルトシダ、サルモネラ属菌、（１以上の血清型の）大腸菌、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、マイコプラズマ属菌（例えば、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）、気管支敗血症菌、丹毒（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ ｓｓｐ．）、カンピロバクター属菌、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）と一緒に加えることができる。

したがって、本発明はまた、本発明の全てのＲＮＡレプリコン粒子、本発明の核酸構築物を含む裸のＤＮＡベクター、本発明の核酸構築物を含む裸のＲＮＡベクター、合成メッセンジャーＲＮＡを含む本発明の核酸構築物、およびＲＮＡレプリコン、ならびに、本発明の核酸構築物（例えば、合成メッセンジャーＲＮＡ、ＲＮＡレプリコン）、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、裸のＲＮＡベクター、および／または裸のＤＮＡベクターを含む免疫原性組成物および／またはワクチンの全てを含む。

本発明の免疫原性組成物は、ワクチンとして使用することができ、それはアジュバント非含有ワクチンであっても、またはアジュバント含有ワクチンであってもよい。したがって、本発明は、本発明の免疫原性組成物を含むワクチン（多価）ワクチンをさらに含む。
特定の実施形態では、ワクチンはアジュバント非含有ワクチンである。他の実施形態では、ワクチンはアジュバントを含む。本発明のワクチンでの使用に適したアジュバントは、特に限定されず、生分解性油、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョン、および、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンと混合された生分解性油、からなる群から選択される１以上のアジュバントを含み得る。

特定の実施形態では、アジュバントは生分解性油である。この種の特定の実施形態では、生分解性油は、ｄｌ－α－トコフェリルアセテート（ビタミンＥアセテート）である。
他の実施形態では、アジュバントは、２．５％～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。特定の実施形態では、アジュバントは、２．５％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。関連する実施形態では、アジュバントは、５％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。他の実施形態では、アジュバントは、１２．５％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。さらに他の実施形態では、アジュバントは、２５％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。さらに他の実施形態では、アジュバントは、５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンを含む。より具体的な実施形態では、アジュバントは、生分解性油と鉱油アジュバントとの混合物を含む。特定の実施形態では、生分解性油はｄｌ－α－トコフェリルアセテートであり、鉱油は流動パラフィンである。より具体的な実施形態では、生分解性油はｄｌ－α－トコフェリルアセテートであり、鉱油は軽質流動パラフィンである。

関連する製剤において、アジュバントは２つの成分の混合物である。第１の成分は、およそ１μｍの平均（秤量体積）サイズの鉱油液滴からなり、それは水中のポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）で安定化される。第１の成分は、２５重量％の鉱油および１重量％のポリソルベート８０を含み、残りは水であり得る。第２の成分は、４００ｎｍのおよその平均（秤量体積）サイズを有する生分解性ｄｌ－α－トコフェリルアセテートの液滴からなり得、これもポリソルベート８０で安定化される。特定の製剤は、１５重量パーセントのｄｌ－α－トコフェリルアセテートおよび６重量パーセントのポリソルベート８０を含み、残りは水である。特定の実施形態では、アジュバントはＸ－ＳＯＬＶＥ（商標）であり、これは２つの構成成分アジュバント：ｄｌ－α－トコフェリルアセテートに基づくＤＩＬＵＶＡＣ ＦＯＲＴＥ（商標）および軽質流動パラフィンに基づくＭＩＣＲＯＳＯＬ（商標）の組み合わせである［例えば、米国特許第８，５９７，６６２号を参照されたい］。関連する製剤において、アジュバントは、マイクロメートル未満サイズの油滴および生分解性油の液滴を含有し、生分解性油の液滴は、鉱油の液滴の平均サイズとは異なる平均サイズを有する［例えば、米国特許第９，０８４，７６８号を参照されたい］。

特定の実施形態では、ワクチンは、ＩＡＶ－Ｓに起因する疾患の予防に役立つ。関連する実施形態では、抗体は、ブタがワクチンで免疫された場合にブタ対象において誘導される。特定の実施形態では、ブタ対象は雌ブタである。関連する実施形態では、ワクチンは、ワクチン接種された雌ブタの子へ母体由来の防御抗体を提供する。他の実施形態では、ブタ対象は仔ブタである。この種の特定の実施形態では、ワクチンは、３日齢という早い時期に仔ブタに投与される。特定の実施形態では、ワクチンは、ブースターワクチンとして投与される。特定の実施形態では、ワクチンは、単回投与ワクチンとして投与される。
この種の特定の実施形態では、ワクチンは、ブースターワクチンとして投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは、複数回投与ワクチンとして投与される。この種の特定の実施形態では、ワクチンは、２回投与ワクチンとして投与される。

本発明はまた、ブタ病原体、例えばＩＡＶ－Ｓに対してブタ（例えば、雌ブタまたは仔ブタ）を免疫する方法であって、本発明のワクチンまたは多価の免疫学的有効量をブタに投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンは筋肉内注射によって投与される。代替の実施形態では、ワクチンは皮下注射によって投与される。他の実施形態では、ワクチンは静脈内注射によって投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは皮内注射によって投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは経口投与によって投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンは鼻腔内投与によって投与される。好ましい方法は皮内投与である。別の好ましい方法は筋肉内投与である。

したがって、本発明のワクチンおよび多価ワクチンは、プライマーワクチンとして、および／またはブースターワクチンとして投与することができる。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、ワンショットワクチンとして投与され（１回投与）、その後の投与は必要ない。特定の実施形態では、プライマーワクチンとブースターワクチンの両方を投与する場合、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは同一の経路で投与することができる。

この種の特定の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは、両方とも皮内注射によって投与される。この種の別の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンは、両方とも筋肉内注射によって投与される。代替え的な実施形態では、プライマーワクチンとブースターワクチンの両方を投与する場合、プライマーワクチンの投与をある経路で、ブースターワクチンの投与を別の経路で行うことができる。この種の特定の実施形態では、プライマーワクチンは皮内注射によって投与され得、ブースターワクチンは経口投与され得る。この種の関連する実施形態では、プライマーワクチンは筋肉内注射によって投与され得、ブースターワクチンは経口投与され得る。この種の他の実施形態では、プライマーワクチンは筋肉内注射によって投与され得、ブースターワクチンは皮内注射によって投与され得る。この種のさらに他の実施形態では、プライマーワクチンは皮内注射によって投与され得、ブースターワクチンは筋肉内注射によって投与され得る。当業者は、ワクチン組成物が、好ましくはレシピエント動物の種類および投与経路ごとに適切に製剤化されることを理解するであろう。

本発明は、ＩＡＶ－Ｓに対してブタを免疫する方法をさらに提供し、該方法は、本発明のワクチンの免疫学的有効量をブタに投与することを含む。該方法は、好ましくは、ワクチンの皮内投与を含む。本発明はさらに、ＩＡＶ－Ｓに対してブタ（例えば、雌ブタまたは仔ブタ）を免疫する方法を提供し、該方法は、ブタが適切なＩＡＶ－Ｓ抗体を産生するように、免疫学的有効量の上記の本発明のワクチンをブタに注射することを含む。特定の実施形態では、ワクチンは、例えば、約１×１０^４～約１×１０^１０個以上のＲＰを含むことができる。より具体的な実施形態では、ワクチンは、約１×１０^５～約１×１０^９個のＲＰを含むことができる。さらにより具体的な実施形態では、ワクチンは、約１×１０^６～約１×１０^８個のＲＰを含むことができる。

特定の実施形態では、本発明のワクチンは、０．０５ｍＬ～３ｍＬの用量で投与される。より具体的な実施形態では、投与される用量は、０．１ｍＬ～２ｍＬである。さらにより具体的な実施形態では、投与される用量は、０．２ｍＬ～１．５ｍＬである。さらにより具体的な実施形態では、投与される用量は、０．３～１．０ｍＬである。さらにより具体的な実施形態では、投与される用量は、０．４ｍＬ～０．８ｍＬである。

したがって、第１の態様では、本発明は以下の実施形態を提供する；
［１］対象におけるブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）によって引き起こされる疾患の予防に使用するための核酸構築物であって、核酸配列の５’から３’の順序で、
Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のＩＡＶ－Ｓの第１のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１の核酸配列、および
Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする第２の核酸配列、を含む核酸構築物。

［２］第１のＨＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）由来である、［１］に記載の使用のための核酸構築物。

［３］第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＨＡ抗原が、配列番号３のアミノ酸配列またはその少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］または［２］に記載の使用のための核酸構築物。

［４］第２のＨＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の使用のための核酸構築物。

［５］第２の核酸配列によってエンコードされる第２のＨＡ抗原が、配列番号６のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］～［４］のいずれか一つに記載の使用のための核酸構築物。

［６］対象におけるブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）によって引き起こされる疾患の予防に使用するための核酸構築物であって、核酸配列の５’から３’の順序で、
Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原をエンコードする第１の核酸配列、および
Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする第２の核酸配列、を含む核酸構築物。

［７］第１のＨＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来である、［６］に記載の使用のための核酸構築物。

［８］第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＨＡ抗原が、配列番号９のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［６］または［７］に記載の使用のための核酸構築物。

［９］第２のＨＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来である、［６］～［８］のいずれか一つに記載の使用のための核酸構築物。

［１０］第２の核酸配列によってエンコードされる第２のＨＡ抗原が、配列番号１２のアミノ酸配列またはその少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［６］～［９］のいずれか一つに記載の使用のための核酸構築物。

［１１］［１］～［５］のいずれか一つに記載の核酸構築物を含む、ＲＮＡレプリコン粒子。

［１２］［６］～［１０］のいずれか一つに記載の核酸構築物を含む、ＲＮＡレプリコン粒子。

［１３］アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、［１５］または［１６］に記載のＲＮＡレプリコン粒子。

［１４］ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、［１３］に記載のＲＮＡレプリコン粒子。

［１５］［１１］～［１４］のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物。

［１６］［１１］および［１２］に記載のＲＮＡレプリコン粒子を含む、［１５］に記載の免疫原性組成物。

［１７］［１１］および［１２］に記載のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の同時投与に適合している、［１６］に記載の免疫原性組成物。

［１８］［１５］～［１７］のいずれか一つに記載の免疫原性組成物を含むワクチン。

［１９］アジュバント非含有ワクチンである、［１８］に記載のワクチン。

［２０］生分解性油、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョン、および、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンと混合された生分解性油、からなる群から選択されるアジュバントを含む、［１８］に記載のワクチン。

［２１］対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための、［１８］～［２０］のいずれか一つに記載のワクチン。

［２２］ブタインフルエンザＡウイルスに対してブタを免疫する方法であって、［１８］～［２０］のいずれか一つに記載のワクチンの免疫学的有効量をブタに投与することを含む、方法。

［２３］核酸配列の５’から３’の順序で、
Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１のＨＡ抗原をエンコードする第１の核酸配列、および
Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする第２の核酸配列、を含む核酸構築物。

［２４］核酸配列の５’から３’の順序で、
Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原をエンコードする第１の核酸配列、および
Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする第２の核酸配列、を含む核酸構築物。

第２の態様では、本発明は以下の実施形態を提供する；
［１］対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための核酸構築物であって、第１および第２の核酸配列を含み、
第１の核酸配列が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）由来のＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原をエンコードし、そして、
第２の核酸配列が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来のＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする、核酸構築物。

［２］第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＨＡ抗原が、配列番号３のアミノ酸配列またはその少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］に記載の使用のための核酸構築物。

［３］第２の核酸配列によってエンコードされる第２のＨＡ抗原が、配列番号６のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］または［２］に記載の使用のための核酸構築物。

［４］対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための核酸構築物であって、第１および第２の核酸配列を含み、
第１の核酸配列が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来のＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードし、そして、
第２の核酸配列が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来のＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする、核酸構築物。

［５］第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＨＡ抗原が、配列番号９のアミノ酸配列またはその少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［４］に記載の使用のための核酸構築物。

［６］第２の核酸配列によってエンコードされる第２のＨＡ抗原が、配列番号１２のアミノ酸配列またはその少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［４］または［５］に記載の使用のための核酸構築物。

［７］［１］～［３］のいずれか一つに記載のヌクレオチド構築物を含む、ＲＮＡレプリコン粒子。

［８］［４］～［６］のいずれか一つに記載のヌクレオチド構築物を含む、ＲＮＡレプリコン粒子。

［９］アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、［７］または［８］に記載のＲＮＡレプリコン粒子。

［１０］ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、［９］に記載のＲＮＡレプリコン粒子。

［１１］［７］～［１０］のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物。

［１２］［７］および［８］に記載のＲＮＡレプリコン粒子を含む、［１１］に記載の免疫原性組成物。

［１３］［１２］に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。

［１４］アジュバント非含有ワクチンである、［１３］に記載のワクチン。

［１５］生分解性油、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョン、および、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンと混合された生分解性油、からなる群から選択されるアジュバントを含む、［１３］に記載のワクチン。

［１６］対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための、［１３］～［１５］のいずれか一つに記載のワクチン。

［１７］ブタインフルエンザＡウイルスに対してブタを免疫する方法であって、［１４］～［１６］のいずれか一つに記載のワクチンの免疫学的有効量をブタに投与することを含む、方法。

［１８］第１および第２の核酸配列を含み、
第１の核酸配列が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来のＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードし、そして、
第２の核酸配列が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来のＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする、核酸構築物。

［１９］第１および第２の核酸配列を含み、
第１の核酸配列が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）由来のＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のＩＡＶ－Ｓの第１のＨＡ抗原をエンコードし、そして、
第２の核酸配列が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来のＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のＩＡＶ－Ｓの第２のＨＡ抗原をエンコードする、核酸構築物。

第３の態様では、本発明は以下の実施形態を提供する；
［１］対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための免疫原性組成物であって、第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子を含み、
第１のＲＮＡレプリコン粒子が、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１および第２のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＨＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第２のＨＡ抗原が、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のものであり、
第２のＲＮＡレプリコン粒子が、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第３のＨＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）のものであり、そして、
第４のＨＡ抗原が、Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のものである、免疫原性組成物。

［２］第１のＨＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来である、［１］に記載の使用のための免疫原性組成物。

［３］第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＨＡ抗原が、配列番号９のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］または［２］に記載の使用のための免疫原性組成物。

［４］第２のＨＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）由来である、先行する［１］～［３］のいずれか一つに記載の使用のための免疫原性組成物。

［５］第２の核酸配列によってエンコードされる第２のＨＡ抗原が、配列番号１２のアミノ酸配列またはその少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸を含む、先行する［１］～［４］のいずれか一つに記載の使用のための免疫原性組成物。

［６］第３のＨＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）由来である、先行する［１］～［５］のいずれか一つに記載の使用のための免疫原性組成物。

［７］第３の核酸配列によってエンコードされる第３のＨＡ抗原が、配列番号３のアミノ酸配列またはその少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する［１］～［６］のいずれか一つに記載の使用のための免疫原性組成物。

［８］第４のＨＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来である、先行する［１］～［７］のいずれか一つに記載の使用のための免疫原性組成物。

［９］第４の核酸配列によってエンコードされる第４のＨＡ抗原が、配列番号６のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する［１］～［８］のいずれか一つに記載の使用のための免疫原性組成物。

［１０］第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子の同時投与に適合している、先行する［１］～［９］のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

［１１］第３のＲＮＡレプリコン粒子をさらに含み、
第３のＲＮＡレプリコン粒子が、ＩＡＶ－Ｓの第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、
第２のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第３のＮＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される、先行する［１］～［１０］のいずれか１つに記載の使用のための免疫原性組成物。

［１２］ＲＮＡレプリコン粒子がアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、先行する［１］～［１１］のいずれか一つに記載の使用のための免疫原性組成物。

［１３］ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、［１２］に記載の使用のための免疫原性組成物。

［１４］先行する［１］～［１３］のいずれか一つに記載の免疫原性組成物を含むワクチン。

［１５］アジュバント非含有ワクチンである、［１４］に記載のワクチン。

［１６］生分解性油、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョン、および、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンと混合された生分解性油、からなる群から選択されるアジュバントを含む、［１４］に記載のワクチン。

［１７］対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための、［１４］～［１６］のいずれか一つに記載のワクチン。

［１８］ブタインフルエンザＡウイルスに対してブタを免疫する方法であって、［１４］～［１６］のいずれか一つに記載のワクチンの免疫学的有効量をブタに投与することを含む、方法。

［１９］第１および第２のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、
第１のＲＮＡレプリコン粒子は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１および第２のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＨＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第２のＨＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のものであり、
第２のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第３のＨＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）のものであり、そして、
第４のＨＡ抗原は、Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のものである、免疫原性組成物。

［２０］第１、第２および第３のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、
第１のＲＮＡレプリコン粒子は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１および第２のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＨＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第２のＨＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のものであり、
第２のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第３のＨＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、そして、
第４のＨＡ抗原は、Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のものであり、
第３のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）Ｓ系統のものであり、
第２のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第３のＮＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される、免疫原性組成物。

第４の態様では、本発明は以下の実施形態を提供する；
［１］対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための核酸構築物であって、核酸構築物は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含み、ここで、
第１のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、
第２のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第３のＮＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される、核酸構築物。

［２］第１のＮＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／６１４７０／２０１３（Ｈ１Ｎ２）由来である、［１］に記載の使用のための核酸構築物。

［３］第１の核酸配列によってエンコードされる第１のＮＡ抗原が、配列番号１５のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］または［２］に記載の使用のための核酸構築物。

［４］第２のＮＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４８１４７－８／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の使用のための核酸構築物。

［５］第２の核酸配列によってエンコードされる第２のＮＡ抗原が、配列番号１８のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］～［４］のいずれか一つに記載の使用のための核酸構築物。

［６］第３のＮＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１７９０５７／２０１５（Ｈ１Ｎ１）由来である、［１］～［５］のいずれか一つに記載の使用のための核酸構築物。

［７］第３のＮＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来である、［１］～［６］のいずれか一つに記載の使用のための核酸構築物。

［８］第３の核酸配列によってエンコードされる第３のＮＡ抗原が、配列番号２４のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］～［７］のいずれか一つに記載の使用のための核酸構築物。

［９］［１］～［８］のいずれか一つに記載の核酸構築物を含む、ＲＮＡレプリコン粒子。

［１０］アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、［９］記載のＲＮＡレプリコン粒子。

［１１］ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、［９］または［１０］に記載のＲＮＡレプリコン粒子。

［１２］［９］～［１１］のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物。

［１３］第１、第２および第３のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、
第１のＲＮＡレプリコン粒子は、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１および第２のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第１のＨＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第２のＨＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のものであり、
第２のＲＮＡレプリコン粒子は、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
第３のＨＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）のものであり、そして、
第４のＨＡ抗原は、Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のものであり、そして、
第３のＲＮＡレプリコン粒子は、［９］～［１１］のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコン粒子である、免疫原性組成物。

［１４］［１２］または［１３］に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。

［１５］アジュバント非含有ワクチンである、［１４］に記載のワクチン。

［１６］生分解性油、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョン、および、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンと混合された生分解性油、からなる群から選択されるアジュバントを含む、［１４］に記載のワクチン。

［１７］対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための、［１４］～［１６］のいずれか一つに記載のワクチン。

［１８］ブタインフルエンザＡウイルスに対してブタを免疫する方法であって、［１４］～［１６］のいずれか一つに記載のワクチンの免疫学的有効量をブタに投与することを含む、方法。

［１９］ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物であって、ここで、
第１のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、
第２のＮＡ抗原は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
第３のＮＡ抗原は、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される、核酸構築物。

以下の実施例は、本発明のさらなる理解を提供するのに役立つが、決して本発明の有効な範囲を制限することを意味するものではない。

［実施例］
材料および方法
アルファウイルスＲＮＡ ＲＰワクチンの調製
単一ＨＡまたはＮＡ遺伝子レプリコン粒子（ＲＰ）の作製。
ヘマグルチニン（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を発現するように設計されたＶＥＥレプリコンベクターを、以下の修飾を加えて、以前に記載されたように構築した［その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４１，２４７ Ｂ２号を参照されたい］。ＴＣ－８３由来のレプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９，４４１，２４７ Ｂ２号において開示され、説明されている］を、制限酵素ＡｓｃｌおよびＰａｄで消化した。５’－フランキング配列（５’－ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ－３’）および３’－フランキング配列（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡ－３’）を有するＨＡまたはＮＡ遺伝子（表１ａおよび表１ｂ）のコドン最適化オープンリーディングフレーム配列を含むＤＮＡプラスミドを、制限酵素ＡｓｃｌおよびＰａｄで同様に消化した。次いで、合成遺伝子カセットを、消化したｐＶＥＫベクターにライゲーションし、得られたクローンを、ＲＰコードそれぞれの「ｐＶＨＶ」と命名し直した。「ｐＶＨＶ」ベクター名称は、ｐＶＥＫのマルチクローニングサイトのＡｓｃｌおよびＰａｄ部位を介してクローニングされた導入遺伝子カセットを含むｐＶＥＫ由来レプリコンベクターを称するように選択された。

ＴＣ－８３ ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の製造は、以前に記載された方法に従って行った［米国特許第９，４４１，２４７ Ｂ２号および米国特許第８，４６０，９１３ Ｂ２号、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる］。手短に言えば、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップ類似体（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）を使用したインビトロ転写の前に、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドをＮｏｔ１制限酵素で線状化した。重要なことに、製造に使用されるヘルパーＲＮＡは、以前に記載されたように［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパーの成分用の精製ＲＮＡを合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ｍｍキュベットにエレクトロポレーションし、そして、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を精製し、５％スクロース（ｗ／ｖ）および１％ブタ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で製剤化し、０．２２ミクロン膜フィルタに通し、そして、保存のためにアリコートに分注した。機能的ＲＰの力価を、感染Ｖｅｒｏ細胞単層上での免疫蛍光アッセイによって決定した。パッケージングされたレプリコンにエンコードされた遺伝子に従って、ＲＰのバッチを識別した（表１ａおよび表１ｂ）。

複数ＨＡまたはＮＡ遺伝子レプリコン粒子（ＲＰ）の作製。
ＨＡまたはＮＡ遺伝子を発現するために使用されるＶＥＥレプリコンベクターを、以下の修飾を加えて以前に記載されたように構築した［その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４１，２４７ Ｂ２号を参照されたい］。ＴＣ－８３由来のレプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９，４４１，２４７ Ｂ２号において開示され、説明されている］を、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。二重遺伝子ＨＡおよびＮＡ構築物のために、選択されたオープンリーディングフレーム配列をコドン最適化し、フランキングＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を用いて合成した。さらに、２つの合成ＨＡまたはＮＡオープンリーディングフレーム間の中間配列は、非コーディング異種配列の４７ヌクレオチド、ならびに天然ＴＣ－８３サブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡプロモーターおよび５’非翻訳ｓｇＲＮＡ領域配列の第２のコピーからなった。これらの二重遺伝子構築物を「ｐＶＤＧ」と称し、単一のｓｇＲＮＡプロモーター配列を有する親ベクターと区別した。三重遺伝子ＮＡ構築物のために、２つのＮＡ遺伝子を含有するｐＶＤＧベースの構築物を、以下のようにさらに修飾した。第３の選択されたＮＡオープンリーディングフレームをコドン最適化し、２つの既存のＮＡ遺伝子の下流のｐＶＤＧベクターへの方向性クローニングのために、フランキングＰａｃＩおよびＳｐｈＩ部位を用いて合成した。新たな合成構築物はまた、異種非コーディング配列の５０ヌクレオチドと、天然ＴＣ－８３ ｓｇＲＮＡプロモーターおよび第３のＮＡ遺伝子配列の５’までの５’非翻訳ｓｇＲＮＡ領域配列の第３のコピーとを含んでいた。第３のＮＡ遺伝子配列からの３’領域は、親ｐＶＤＧベクターの対応するＳｐｈＩ部位まで、ＴＣ－８３の３’非翻訳領域からなっていた。三重遺伝子ベクターを「ｐＶＴＧ」と称し、関連するベクターｐＶＥＫ、ｐＶＨＶ、およびｐＶＤＧと区別した。

実施例１および３から選択されたＨＡ（表１ａ：ＥＵＨＡ１－３、ＥＵＨＡ１－２、ＥＵＨＡ１－５、ＥＵＨＡ１－１５、ＥＵＨＡ１－１７、ＥＵＨＡ１－８、ＥＵＨＡ１－１１およびＨＡ３－４）またはＮＡ（表１ｂ：ＥＵＮＡ１－２、ＥＵＮ１－４、ＥＵＮ２－６およびＥＵＮ２－７）遺伝子の配列を使用して、上記のようにプラスミドベクターｐＶＤＧまたはｐＶＴＧ中の複数ＨＡまたはＮＡ遺伝子を合成した。

ＴＣ－８３ ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の製造は、以前に記載された方法に従って行った［米国特許第９，４４１，２４７ Ｂ２号および米国特許第８，４６０，９１３ Ｂ２号、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる］。手短に言えば、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップ類似体を使用したインビトロ転写の前に、ｐＶＤＧまたはｐＶＴＧレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＮｏｔＩ制限酵素で線状化した。重要なことに、製造に使用されるヘルパーＲＮＡは、以前に記載されたように［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパーの成分用の精製ＲＮＡを合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ｍｍキュベットにエレクトロポレーションし、そして、無血清培養培地に戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁液をデプスフィルタに通し、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に保持されたＲＰを２００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４＋５％スクロース（ｗ／ｖ）緩衝液で溶出することによって細胞および培地から精製した。あるいは、調製したＣｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ（登録商標）樹脂の存在下で細胞および培地を遠心分離し、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、そして、２００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４＋５％スクロース（ｗ／ｖ）緩衝液で溶出した。溶出したＲＰを０．２２ミクロン膜フィルタに通し、そして、保存のためにアリコートに分注した。機能的ＲＰの力価を、感染Ｖｅｒｏ細胞単層上での免疫蛍光アッセイによって決定した。

以下のレプリコン粒子を構築し、実験に使用した。

実施例または図において別途示されない場合、下記の株および系統がＨＩアッセイのために使用されている。

一般的な試験設計
血清陰性であるか、またはＳＩＶに対する抗体が低い約５週齢の健康なブタ（ワクチン毎に３匹のブタ）に、単一または複数のＨＡまたはＮＡ遺伝子をエンコードするＲＮＡ粒子ワクチンをブタ１匹１当たり５～１０×１０^６で、Ｘｓｏｌｖｅ５０アジュバントと共に筋肉内ワクチン接種した。それぞれのワクチン接種をおよそ８週齢で繰り返し、血液試料をおよそ９週齢で採取し、赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイまたはノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）アッセイのいずれかに使用して抗原特異的抗体レベルのレベルを定量した。

赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ：
全ての血清試料を５６°Ｃで３０分間熱不活性化し、続いて０．２５％過ヨウ素酸塩、続いて０．７５％グリセロールで処理し、２．６％ニワトリ赤血球で吸着させて非特異的アグルチニンを除去した。ＨＩ抗体滴定のために、前処理した血清の一連の希釈物を、ＨＡ抗原として表１ｃまたは表１ｄに列挙したＳＩＶ株の８赤血球凝集単位と共に１時間インキュベートした。その後、混合物を０．２％ニワトリ赤血球と室温で１時間インキュベートし、そして、プレートを凝集の阻害について読み取った。赤血球凝集を完全に阻害した最高血清希釈度の逆数をＨＩ力価として割り当て、ｌｏｇベース２値で表した。

血清ノイラミニダーゼ（ＮＡ）阻害（ＮＩ）アッセイ：
それぞれのＮＡ（表１ｅおよび１ｆ）の遺伝子をエンコードするレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした、ＮＡ抗原を発現するＶｅｒｏ細胞の溶解物のＳＩＶ株を、ＮＡ抗原の起源として使用した。これらのＮＡの酵素活性を、３７°Ｃでの一晩のインキュベーション中に９６ウェルプレート上のフェチュインからのシアル酸切断によって定量した。次いで、ピーナッツアグルチニン－西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＰＮＡ－ＨＲＰ）を室温で２時間加え、シアル酸を除去したフェチュイン分子に結合させた。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いてシグナルを得て、４５０ｎｍで読み取った。試験抗原を滴定して、最大シグナルの７０％を得ることができる希釈度を決定した。３７°Ｃでの一晩のインキュベーション中に、フェチュインコーティングウェル中の血清の一連の希釈液に等量のＮＡ抗原を添加した。光学密度（ＯＤ）値を、血清を含まない陽性対照ウェルからの値に対して正規化した。ノイラミニダーゼ阻害力価は、対照と比較して５０％阻害に等しい吸光値を有する内挿された血清希釈度の逆数として定義され、ｌｏｇベース２値で表された。

ノイラミニダーゼ抗体力価およびヘマグルチニン抗体力価と、ＳＩＶ－Ａに対するワクチン誘導性防御との相関は、以下に記載されている：［Ｈｏｂｓｏｎ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｙｇ（Ｌｏｎｄ）７０，７６７－７７７（１９７２）；Ｏｈｍｉｔ ＳＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ ２０４，１８７９－１８８５（２０１１）；Ｗａｌｚ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１８；９２（１７）：ｅ０１００６－１８．（２０１８）。したがって、以下の実施例に記載されるＨｉおよびＮｉ阻害アッセイの血清学的結果は、ＳＩＶ－Ａによって引き起こされる疾患の予防を示す。

［実施例１］
単一ＨＡ抗原をエンコードするＲＰによって誘導される赤血球凝集阻害（ＨＩ）抗体力価 株ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ（ＥＡ）、Ｇｅｎｔ／８４、Ｓｃｏｔ／９４およびｐｄｍ０９のそれぞれの単一ＨＡ抗原をエンコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰの防御および交差防御を決定するために、以下の試験を行った。

５週齢のブタ（１当たりり３匹）に、およそ３週間間隔でのプライム－ブーストレジメンで、それぞれのＲＮＡ粒子をＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと共にワクチン接種した。
ブースターワクチン接種の１～２週間後に血清を採取して、インフルエンザに対する防御の相関物であるインフルエンザ抗原特異的赤血球凝集阻害抗体力価を決定した。ＨＩアッセイは、インフルエンザウイルスによって誘発される赤血球の赤血球凝集を防ぐ血清の最大希釈度を測定する。この希釈度の逆数をＬｏｇ ２ベースでのＨＩ力価として定義した。報告された値は３匹の動物の平均である。このアッセイの検出限界は４であり（図中の点線）、したがって４未満の力価は図中に３として報告されている。

ＨＩ実験の結果を図１～図４に示す。以下の結論を引き出すことができる。

・図１：ＥＡ系統の株ＥＵＨＡ１－３のＲＰは、試験されたほぼ全てのＩＡＳのＥＡ抗原に対して最も高い抗原特異的ＨＩ抗体力価を示し、ＥＵＨ１－５およびＥＵＨ１－２が続いた。さらに、いくつかのＳｃｏｔ／９４およびｐｄｍ０９ ＨＡ抗原に対する交差反応性力価を観察することができた。試験した株のいずれも、Ｇｅｎｔ／８４ ＩＡＳ抗原に対する交差反応性力価を示さなかった全てのＨＩ力価が４未満）。

・図２：株ＥＵＨＡ１－１５のＲＰは、試験されたほぼ全てのＳｃｏｔ／９４抗原に対して最も高い抗原特異的ＨＩ抗体力価を示し、ＥＵＨ１－１７がそれに続き、したがって分岐２および３のＳｃｏｔ／９４抗原について最も良好に機能した。株ＥＵＨＡ１－８のＲＰは、試験された分岐１のＳｃｏｔ／９４抗原に対して最高の抗原特異的ＨＩ抗体力価を示した。さらに、いくつかのＥＡおよびｐｄｍ０９ ＨＡ ＩＡＳ抗原に対する交差反応性力価を観察することができた。試験した株のいずれも、Ｇｅｎｔ／８４ ＩＡＳ抗原に対する交差反応性力価を示さなかった全てのＨＩ力価が４未満）。

・図３：Ｐｄｍ０９系統の株ＥＵＨＡ１－１１のＲＰは、ほぼ全てのｐｄｍ０９抗原に対して最も高い抗原特異的ＨＩ抗体力価を示した。さらに、ほとんどのＥＡおよびＳｃｏｔ／９４ＨＡ抗原に対する交差反応性力価を観察することができた。試験した株のいずれも、Ｇｅｎｔ／８４ ＩＡＳ抗原に対する交差反応性力価を示さなかった全てのＨＩ力価が４未満）。

・図４：Ｇｅｎｔ／８４系統の株ＥＵＨＡ３－４のＲＰは、試験された全てのＧｅｎｔ／８４抗原に対して最も高い抗原特異的ＨＩ抗体力価を示した。ＥＡ、Ｓｃｏｔ／９４およびｐｄｍ０９抗原のＨＡ抗原に対する有意な交差反応性力価は、観察されなかった。

［実施例２］
二重ＨＡ抗原をエンコードするＲＰによって誘導される赤血球凝集阻害（ＨＩ）抗体力価 １）ｐｄｍ０９およびＧｅｎｔ／８４系統のＨＡ抗原、または
２）ＥＡおよびＳｃｏｔ／９４抗原のＨＡ抗原
を組み合わせた二重ｅ ＨＡ抗原をエンコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰの血清学的有効性を決定するために、実施例１に記載の設計を用いて検討を行った。

ＨＩアッセイの結果を図５に示す。以下の結論を引き出すことができる。

試験した全ての組み合わせが強い血清学的応答を誘導するわけではないことが観察され得た。さらに、驚くべきことに、レプリコン粒子のウイルスゲノム中の遺伝子の順序が血清学的応答を誘導するのに重要であることが、観察され得た。

・系統Ｐｄｍ０９およびＧｅｎｔ／８４のＨＡ抗原組み合わせ：レプリコン粒子のウイルスゲノムの最初に配置されたＧｅｎｔ／８４および２番目に配置されたｐｄｍ０９と組み合わせのみが、強い血清学的応答を誘導した。代わりに、レプリコン粒子のウイルスゲノムにおいて最初に配置されたＰｄｍ０９および２番目に配置されたＧｅｎｔ／８４の順序では、Ｇｅｎｔ／８４ ＨＡ抗原に対するはるかに低い血清学的応答、およびＰｄｍ０９ ＨＡ抗原に対する非常に弱い血清学的応答しか観察できなかった。

・系統ＥＡおよびＳｃｏｔ／９４のＨＡ抗原組み合わせ：試験した全ての組み合わせが強い血清学的応答を誘導したわけではない。Ｓｃｏｔ／９４のＥＵＨＡ１－１７とＥＡのＥＵＨＡ１－３の株の組み合わせは、最良の血清学的応答（両系統のＩＡＳ抗原に対する最も高いＨＩ力価）を示した。

さらに、レプリコン粒子のレプリコンＲＮＡに最初に配置されたＳｃｏｔ／９４および２番目に配置されたＥＡとの組み合わせのみが、強い血清学的応答を誘導した。代わりに、レプリコン粒子のレプリコンＲＮＡにおいてＥＡが最初に配置され、Ｓｃｏｔ／９４が２番目に配置された順序では、ＥＡ ＨＡ抗原に対する有意な血清学的応答は観察できなかった。

・試験された様々な組み合わせの中で、ＥＵＨＡ３－４＋ＥＵＨＡ１－１１およびＥＵＨＡ１－１７＋ＥＵＨＡ１－３の株の組み合わせは、ＨＩ力価として測定される最良の免疫を誘導する。したがって、これらの組み合わせは、２つのレプリコン粒子を組み合わせる製剤において、すなわちＥＵＨＡ３－４＋ＥＵＨＡ１－１１株をこの順序でエンコードする第１のＲＮＡレプリコン粒子と、ＥＵＨＡ１－１７＋ＥＵＨＡ１－３株をこの順序でエンコードする第２のＲＮＡレプリコン粒子とを組み合わせるために有益に使用される。

結果として、驚くべきことに、ＲＮＡレプリコン粒子内のＨＡ遺伝子の位置および／またはＨＡ抗原の特定の組み合わせが、ＨＩ力価として測定される誘導免疫のレベルを決定することが実証され得た。

［実施例３］
単一ＮＡ抗原をエンコードするＲＰによって誘導されるノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）抗体力価
株ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ（ＥＡ）、Ｇｅｎｔ／８４、Ｓｃｏｔ／９４およびｐｄｍ０９のそれぞれの単一ＮＡ抗原をエンコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰの血清学的有効性を決定するために、以下の試験を行った。

５週齢のブタ（１当たりり３匹）に、およそ３週間間隔でのプライム－ブーストレジメンでそれぞれのＲＮＡレプリコン粒子をＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと共にワクチン接種した。ブースターワクチン接種の１～２週間後に血清を採取して、インフルエンザ抗原特異的ノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）抗体力価を決定した。ＮＩ力価を、レクチン（ピーナッツアグルチニン）ベースのアッセイを使用して上記のように測定し、対照ウェルと比較してＮＡ活性を少なくとも５０％阻害する血清の最大希釈度の逆数をＮＩ力価と定義した。このアッセイの検出限界は２であった（図中の点線）。

ＮＩ実験の結果を図７～図１０に示す。以下の結論を引き出すことができる。

・図７：ＥＡ系統の株ＥＵＮＡ１－２のＲＰは、試験されたほぼ全てのＩＡＳのＥＡ抗原に対して最も高い抗原特異的ＮＩ抗体力価を示した。さらに、いくつかのＳｃｏｔ／９４、ｐｄｍ０９、およびＧｅｎｔ／８４ ＮＡ抗原に対する交差反応を観察することができた。

・図８：株ＥＵＮＡ１－４のＲＰは、試験されたほとんどのｐｄｍ０９抗原に対して最高の抗原特異的ＮＩ抗体力価を示したが、観察されたＮＩ力価のレベルは、ＥＡ系統のＲＰで達成されたＮＩ力価と比較して低かった。さらに、ＥＡ、Ｓｃｏｔ／９４およびＧｅｎｔ／８４ ＮＡ ＩＡＳ抗原に対する交差反応性力価を観察することができた。試験された株間で測定された力価の差は低かった。

・図９：Ｓｃｏｔ／９４系統の株ＥＵＮＡ２－６のＲＰは、試験された全てのＳｃｏｔ／９４抗原に対して最も高い抗原特異的ＮＩ抗体力価を示した。さらに、ＥＡ、ｐｄｍ０９およびＧｅｎｔ／８４ ＮＡ抗原に対する高レベルの交差反応性を株ＥＵＮＡ２－６について観察することができた。

・図１０：Ｇｅｎｔ／８４系統の株ＥＵＮＡ２－７のＲＰは、試験した全てのＧｅｎｔ／８４抗原に対して高い抗原特異的ＮＩ抗体力価を示し、ＥＡ、Ｓｃｏｔ／９４およびｐｄｍ０９抗原のＮＡ抗原に対する有意な交差防御も示した。

［実施例４］
二重または三重ＮＡ抗原をエンコードするＲＰによって誘導されるＮＩ抗体力価
二重または三重ＮＡ抗原をエンコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰの血清学的有効性を決定するために、以下に列挙する系統由来のＮＡ抗原をエンコードするＲＰを設計および作製し、実施例３に記載の設計を用いて検討を行った。
１）ＥＡおよびＧｅｎｔ／８４系統のＮＡ抗原、または
２）ＥＡ、Ｇｅｎｔ／８４およびＳｃｏｔ／９４抗原のＮＡ抗原

ＮＩ実験の結果を図１１に示す。以下の結論を引き出すことができる。

試験した全ての組み合わせが、遺伝子の順序に関係なく血清学的応答を誘導することを示すことができた。したがって、驚くべきことに、ＨＡ抗原を用いた観察結果（上記の実施例２を参照）とは対照的に、レプリコン粒子のウイルスゲノム中のＮＡ遺伝子の順序は、血清学的応答の誘導にとって重要ではないことを観察することができた。

［実施例５］
二重および三重ＮＡ抗原をエンコードするＲＰによって誘導されるＮＩ抗体力価
図７～図１０に示される結果は、ＥＡ系統、Ｇｅｎｔ／８４系統の株とＳｃｏｔ／９４系統の株との組み合わせが、４つ全ての系統に対する最良の防御および交差防御を有する、ＩＡＳに対して最良の防御を提供すべきであることを明らかにする。したがって、このような交差防御を試験するための最良の候補は、Ｓｃｏｔ／９４系統の株ＥＵＮＡ２－６とＧｅｎｔ／８４系統の株ＥＵＮＡ２－７との組み合わせであり、次いでそれを、ＥＡ系統、例えば株ＥＵＮＡ１－２、またはｐｄｍ０９系統、例えば株ＥＵＮＡ１－４のいずれかの株とさらに組み合わせてもよい。結果として、株のこれらの組み合わせを、それらの血清学的応答について試験した。

したがって、
１）ＥＡおよびＧｅｎｔ／８４系統のＮＡ抗原
２）Ｓｃｏｔ／９４、Ｇｅｎｔ／８４およびＥＡ抗原のＮＡ抗原、または
３）Ｓｃｏｔ／９４、Ｇｅｎｔ／８４およびｐｄｍ０９抗原のＮＡ抗原
を組み合わせた二重および三重ＮＡ抗原をエンコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰの防御を決定するために、実施例３に記載の設計を用いて検討を行った。

結果を図１２に示す。

・ＨＡ抗原について観察された結果とは対照的に、３つの系統のみに由来するＮＡ抗原の組み合わせは、４つ全てのＩＡＳ系統に対する血清学的応答を誘導するのに十分である。

・ＲＮＡレプリコン粒子の遺伝子の順序に関係なく、２つの系統のみに由来するＮＡ抗原の組み合わせで、４つ全てのＩＡＳ系統に対する弱い血清学的応答を既に達成することができた。

・最高の血清学的応答は、ｐｄｍ０９またはＥＡ系統のいずれかのＮＡ抗原と、さらにＳｃｏｔ／９４およびＧｅｎｔ／８４ ＮＡ抗原の組み合わせとを組み合わせて達成することができた。

［実施例６］
多価ＩＡＶ－Ｓワクチンのワクチン有効性の評価
２つの二重ＨＡ ＲＰ（ＥＵＨＡ１－１７およびＥＵＨＡ１－３抗原をエンコードするＥＵＳＩＶ－Ｔ８ ＲＰ、ならびにＥＵＨ３－４およびＥＵＨ１－１１抗原をエンコードするＥＵＳＩＶ－Ｋ ＲＰ、表１ａおよび表２）および１つの三重ＮＡ構築物（ＥＵＮ２－６、ＥＵＮ１－２およびＥＵＮ２－５抗原をエンコードするＥＵＳＩＶ－Ｒ、表１ｂおよび表２）を含む多価ＩＡＶ－Ｓワクチンの免疫原性および有効性を決定するための研究を行った。アジュバント含有ワクチンを、５週齢および８週齢での２回の筋肉内（ＩＭ）ワクチン接種で５匹のブタに投与した（投与毎２ｍＬ；投与毎３×５×１０６ ＲＰ、ワクチン接種）。非ワクチン接種の等数にアジュバント含有リン酸緩衝生理食塩水を投与した。ワクチンの免疫原性を、１０週齢での実験的感染の前に収集した血清試料中のＨＩ力価およびＮＩ力価を定量することによって測定した。ワクチンの有効性を、１０週齢（試験３２日目）で、気管内経路によるＧｅｎｔ／８４［Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／１１３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）］チャレンジ感染に対して試験した。感染３日後のＩＡＶ－Ｓ感染誘発発熱、すなわち直腸温度の上昇および肺病変に対するワクチン有効性を測定した。

この実験の結果を、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃおよび図１３Ｄに示す。多価ＩＡＶ－Ｓワクチンは、４つ全ての系統に属する異種ＩＡＶ－Ｓ株に対して機能的ＨＩ力価を誘導し（図１３Ａ）、３つ全ての系統の同種ＮＡ抗原に対してＮＩ力価を誘導した（図１３Ｂ）。さらに、多価ＩＡＶ－Ｓワクチンは、実験的感染によって誘発されるブタにおける直腸温度の上昇、発熱（図１３Ｃ）および病変（図１３Ｄ）からブタを保護した。これらの結果は、試験した多価ＩＡＶ－Ｓが免疫原性および有効性の両方を有したことを実証している。

［実施例７］
ＩＤ投与後のワクチン有効性の評価
２つの二重ＨＡ ＲＰ（ＥＵＨＡ１－１７およびＥＵＨＡ１－３抗原をエンコードするＥＵＳＩＶ－Ｔ８ ＲＰ、ならびにＥＵＨ３－４およびＥＵＨ１－１１抗原をエンコードするＥＵＳＩＶ－Ｋ ＲＰ、表１ａおよび表２）および１つの三重ＮＡ構築物（ＥＵＮ２－６、ＥＵＮ１－２およびＥＵＮ２－５抗原をエンコードするＥＵＳＩＶ－Ｒ、表１ｂおよび表２）を含む多価ＩＡＶ－Ｓワクチンの血清学的有効性を決定するための研究を行った。アジュバント含有ワクチンを、ＩＤＡＬ（登録商標）無針注射器を使用した２回の皮内（ＩＤ）ワクチン接種で、３匹のブタに５週齢および８週齢で投与した（投与毎２００ｕＬ；投与毎３×３×１０６ ＲＰ、ワクチン接種）。非ワクチン接種の等数にアジュバント含有リン酸緩衝生理食塩水を投与した。ワクチンの免疫原性を、１０週齢で収集した血清試料中のＨＩ力価およびＮＩ力価を定量することによって測定した。

この実験の結果を、図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。価ＩＡＶ－Ｓワクチンは、試験した４つの系統のうち３つに属する異種ＩＡＶ－Ｓ株に対して機能的ＨＩ力価を誘導し（図１４Ａ）、試験した３つの同種ＮＡ抗原のうち２つに対してＮＩ力価を誘導した（図１４Ｂ）。これらの結果は、多価ＩＡＶ－Ｓワクチンの皮内適用も有効であることを実証している。

Claims (19)

1. 対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための核酸構築物であって、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含み、ここで、
   前記第１のＮＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、
   前記第２のＮＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして
   前記第３のＮＡ抗原が、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される、核酸構築物。
2. 前記第１のＮＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／６１４７０／２０１３（Ｈ１Ｎ２）由来である、請求項１記載の使用のための核酸構築物。
3. 前記第１の核酸配列によってエンコードされる前記第１のＮＡ抗原が、配列番号１５のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載の使用のための核酸構築物。
4. 前記第２のＮＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２４８１４７－８／２０１５（Ｈ３Ｎ２）由来である、請求項１～３のいずれか一項記載の使用のための核酸構築物。
5. 前記第２の核酸配列によってエンコードされる前記第２のＮＡ抗原が、配列番号１８のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項記載の使用のための核酸構築物。
6. 前記第３のＮＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１７９０５７／２０１５（Ｈ１Ｎ１）由来である、請求項１～５のいずれか一項記載の核酸構築物。
7. 前記第３のＮＡ抗原が、株Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）由来である、請求項１～５のいずれか一項記載の使用のための核酸構築物。
8. 前記第３の核酸配列によってエンコードされる前記第３のＮＡ抗原が、配列番号２４のアミノ酸配列またはその少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７記載の使用のための核酸構築物。
9. ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物を含むＲＮＡレプリコン粒子であって、ここで、
   前記第１のＮＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、
   前記第２のＮＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
   前記第３のＮＡ抗原が、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される、ＲＮＡレプリコン粒子。
10. アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、請求項９記載のＲＮＡレプリコン粒子。
11. ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である、請求項９または１０記載のＲＮＡレプリコン粒子。
12. 請求項９～１１のいずれか一項記載のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物。
13. 第１、第２および第３のＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物であって、
    前記第１のＲＮＡレプリコン粒子が、ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１および第２のヘマグルチニン（ＨＡ）抗原をエンコードする第１および第２の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
    前記第１のＨＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
    前記第２のＨＡ抗原が、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統のものであり、 前記第２のＲＮＡレプリコン粒子が、ＩＡＶ－Ｓの第３および第４のＨＡ抗原をエンコードする第３および第４の核酸配列を含む核酸構築物を含み、ここで、
    前記第３のＨＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、そして、
    前記第４のＨＡ抗原が、Ｅｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統のものであり、そして、
    前記第３のＲＮＡレプリコン粒子が、請求項９～１１のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン粒子である、免疫原性組成物。
14. 請求項１２または１３に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
15. アジュバント非含有ワクチンである、請求項１４記載のワクチン。
16. 生分解性油、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョン、および、２．５～５０％（ｖ／ｖ）の鉱油を含む水中油型エマルジョンと混合された生分解性油、からなる群から選択されるアジュバントを含む、請求項１４記載のワクチン。
17. 対象におけるブタインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防に使用するための、請求項１４～１６のいずれか一項記載のワクチン。
18. ブタインフルエンザＡウイルスに対してブタを免疫する方法であって、該方法は、
    請求項１４～１６のいずれか一項に記載のワクチンの免疫学的有効量を前記ブタに投与することを含む、方法。
19. ブタインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）の第１、第２および第３のノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗原をエンコードする第１、第２および第３の核酸配列を含む核酸構築物であって、ここで、
    前記第１のＮＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／４１０４４０／１９９４様Ｈ１_ｈｕＮ２（Ｓｃｏｔ／９４）系統のものであり、
    前記第２のＮＡ抗原が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３Ｎ２（Ｇｅｎｔ／８４）系統のものであり、そして、
    前記第３のＮＡ抗原が、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（ｐｄｍ０９）系統またはＥｕｒａｓｉａｎ ａｖｉａｎ様Ｈ１_ａｖＮ１（ＥＡ）系統から選択される、核酸構築物。

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