CN110124026B

CN110124026B - 猪圆环病毒2型/猪鼻支原体组合疫苗

Info

Publication number: CN110124026B
Application number: CN201910353467.7A
Authority: CN
Inventors: 危艳武; 刘长明; 黄立平; 吴洪丽; 冯力
Original assignee: Harbin Weike Biotechnology Development Co; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Weike Biotechnology Development Co; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110124026A

Abstract

本发明涉及一种多价免疫原性组合物，其包含猪圆环病毒2型(PCV2)抗原和猪鼻支原体抗原，该组合物能够抵抗猪圆环病毒2型和猪鼻支原体的攻击，不管是临床病理还是解剖病理免疫组与健康对照组无显著差异，而攻毒对照组却出现了显著的临床病理和解剖病理。并且猪鼻支原体能够促进猪圆环病毒2型抗体的滴度，为猪圆环病毒相关疾病的综合防控起到了促进作用。

Description

猪圆环病毒2型/猪鼻支原体组合疫苗

技术领域

本发明涉及猪用疫苗，进一步涉及猪圆环病毒2型(PCV2)和猪鼻支原体组合疫苗。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）成员，按血清学和基因组差异分为猪圆环病毒1型（Porcinecircovirus type 1, PCV1）和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）。其中PCV1对猪无致病性，而PCV2有致病性，是引起猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus-associated diseases, PCVAD）的主要病原，如母猪繁殖障碍（PCV2-associatedreproductive disorders）、猪呼吸疾病综合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC）、肠炎（Enteritis），猪皮炎和肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathysyndrome, PDNS），增殖和坏死性肺炎（Proliferative and necrotizing pneumonia,PNP）等。这些疾病中PCV2是最主要的病原。该病毒在世界范围内广泛流行，给养猪业带来巨大的经济损失。

猪鼻支原体是一种无细胞壁结构，且能在无细胞的培养基中，独立生存、自我复制的最小微生物，猪群一旦感染，其能迅速感染上呼吸道、肺脏和鼻咽管，然后通过飞沫小滴的形式迅速传播。该病的临床病理和解剖病理主要表现为多发性浆膜炎、胸膜炎、心包炎、关节炎、中耳炎、跛行和地方性肺炎，学者Lin等报道猪鼻支原体是引起猪地方性肺炎的主要病原之一。已有研究表明，猪鼻支原体与多种病原混合感染会加重肺炎的程度[Kobayashi H, Morozumi T, Miyamoto C, et al. Mycoplasma hyorhinis infectionlevels in lungs of piglets with porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS) [J]. Vet Med Sci, 1996, 58 (2): 109-13； Kawashima K, Katsuda K,Tsunemitsu H. Epidemiological investigation of the prevalence features ofpostweaning multi-systemic wasting syndrome in Japan [J]. J Vet Diagn Invest,2007, 19(1): 60-68. TanawongnuwechR, Thacker B, Halbur P, et al. Increasedproduction of prionflammatory cytokines following infection with porcinereproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae [J].Clin Diagn Lab Immunol, 2004, 11(5): 901~908. Muhiradt PF, Kiess M, Meyer H,et al. Structure and specific activity of macrophage-stimulating lipopeptidesfrom Mycoplasma hyorhinis[J]. Infect Immun, 1998, 66(10): 4804-4810.]严重影响猪的生产性能，对养猪业的健康发展造成巨大威胁。抗生素如四环素、林可霉素、甲氧苄氨嘧啶等对该支原体有治疗作用，但由于成本考虑以及对肉制品的安全要求，寻求针对猪鼻支原体疫苗是期望的。猪鼻支原体的感染通常伴随着其他支原体（猪肺炎支原体Mycoplasma hyopneumoniae 或M.hyo）和絮状支原体（Mycoplasma flocculare）混合感染。由于M.hyo是引起猪的地方性动物病肺炎的主要原因，该疾病是一种慢性的、非致命性的疾病，影响各种年龄的猪，导致猪的饲料转化率降低且体重增长减少，对经济产生重要影响，针对M.hyo和猪PCV2的疫苗在CN104334186中已经报道。而针对鼻支原体与猪圆环病毒的组合疫苗也是猪感染性疾病预防所需要的。

近年来，国内外已经成功研制多种猪圆环病毒2型疫苗，比如全病毒灭活疫苗、PCV1-2嵌合重组苗、亚单位疫苗和重组疫苗等。临床应用表明，上述疫苗均能显著改善PMWS猪场的生产指标，主要表现为仔猪的发病率、死亡率、母猪返情率和淘汰率降低，节约出栏时间等。猪鼻支原体感染猪群主要引起猪精神沉郁、食欲减退、多发性浆膜炎、关节炎、胸膜炎、腹膜炎、咽鼓管炎和心包炎等临床病理和解剖病理。目前还没有商品化的预防猪鼻支原体的疫苗产品。

由于养猪业均为集约化饲养，猪群密度大，多病原混合感染比较普遍，猪圆环病毒2型和猪鼻支原体在猪群中广泛流行，本发明人对猪圆环病毒2型和猪鼻支原体协同感染试验猪表明，猪鼻支原体感染后能够促进猪圆环病毒2型在猪体内的复制进而导致仔猪PMWS的发生。有鉴于此，综合防控这两种疾病对猪群的危害也是势在必行的。

发明内容

本发明提供多价免疫原性组合物，其包含猪圆环病毒2型（PCV2）抗原和猪鼻支原体抗原。

进一步，本发明的猪圆环病毒2型是通过接种于PK-15细胞、无血清全悬浮培养PK-15细胞、病毒纯化、灭活后获得。

进一步，本发明的猪圆环病毒2型是从临床表现为PMWS的病猪分离获得的LG毒株。

进一步，本发明的猪鼻支原体是从临床表现为PMWS的病猪分离获得的DL株。

进一步，本发明的多价免疫原性组合物进一步包含至少一种其他抗原，在一个实施方案中，至少一种其他抗原针对在猪中可能引起疾病的微生物提供保护。在一个实施方案中，微生物包括细菌、病毒或原生动物。在另一个实施方案中，微生物选自：猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcum suis)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪鼻支原体 (Mycoplama hyorhinis)、猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)、钩端螺旋体细菌、胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)、猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻(PED)病毒、轮状病毒、细环病毒(TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠病毒、脑心肌炎病毒、奥杰士基氏病(Aujesky’s Disease)、典型性猪瘟(CSF)的致病原和猪传染性肠胃炎的致病原，或其组合。

进一步，本发明的免疫原性组合物包含佐剂，所述佐剂选自，但不限于下列种类，水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。

进一步，本发明的免疫原性组合物中包含药学可接受的载体。

本发明进一步提供一种多价疫苗，该疫苗包含猪圆环病毒2型（PCV2）抗原和猪鼻支原体抗原以及佐剂。

进一步，本发明的多价疫苗所含佐剂选自，但不限于下列种类，水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。

进一步，本发明的多价疫苗进一步包含至少一种其他抗原，在一个实施方案中，至少一种其他抗原针对在猪中可能引起疾病的微生物提供保护。在一个实施方案中，微生物包括细菌、病毒或原生动物。在另一个实施方案中，微生物选自：猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcum suis)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪鼻支原体 (Mycoplama hyorhinis)、猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)、钩端螺旋体细菌、胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)、猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻(PED)病毒、轮状病毒、细环病毒(TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠病毒、脑心肌炎病毒、奥杰士基氏病(Aujesky’s Disease)、典型性猪瘟(CSF)的致病原和猪传染性肠胃炎的致病原，或其组合。

本发明还提供免疫猪以抵抗猪鼻支原体和猪圆环病毒2型（PCV2）的方法。该方法包括给猪施用包含猪鼻支原体和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的免疫原性组合物/多价疫苗。该组合物或疫苗被肌内、皮内、经皮或皮下给药。组合物或疫苗以单次剂量或两次剂量的形式给药。

进一步，本发明的猪鼻支原体和猪圆环病毒2型（PCV2）免疫原性组合物/多价疫苗与至少一种其它抗原共同给猪施用，所述至少一种其它抗原提供针对能在猪中引起疾病的微生物，例如上述的一种或多种微生物的保护。这种其它抗原可以与猪鼻支原体和猪圆环病毒2型（PCV2）组合物同时给予(即作为单独的单次疫苗)或者组合制成即用型疫苗的形式给予。

本发明进一步提供一种试剂盒，该试剂盒含有包含免疫原性组合物/多价疫苗的瓶。进一步包括含有免疫原性组合物/多价疫苗给药信息的使用说明书。进一步，瓶中的免疫原性组合物/多价疫苗以即用型液体组合物的形式提供。

本发明进一步提供制备本发明的免疫原性组合物的方法。该方法包括通过无血清全悬浮培养PK15细胞，接种猪圆环病毒2型，经纯化和灭活后获得猪圆环病毒2型的灭活抗原；将猪鼻支原体DL株培养、纯化、灭活后获得猪鼻支原体灭活抗原。随后按照多价疫苗的制备方法加入佐剂获得猪圆环病毒2型与猪鼻支原体免疫原性组合物即二价或多价疫苗。

附图说明

图1： PCV2攻毒后各组试验猪腹股沟淋巴结解剖病理变化

图2： Mhr-DL菌株感染后各组试验猪解剖病理变化

图3： PCV2效检试验猪核酸检测结果

图4： Mhr-DL株效检试验猪肺脏抗原检测结果

具体实施方式

本发明提供多价免疫原性组合物/多价疫苗，其包含猪圆环病毒2型(PCV2)抗原和猪鼻支原体抗原。申请人令人惊讶地发现通过无血清全悬浮培养的PK15细胞收获的猪圆环病毒2型 (PCV2)比传统转瓶生产工艺能够显著提高猪圆环病毒2型毒价5-10倍，进一步优选5-8倍，并且猪鼻支原体能够促进猪圆环病毒2型（PCV2）抗体的滴度。当悬浮培养的细胞浓度达到40~70×10⁵/ml，优选50~60×10⁵/ml时，开始接种猪圆环病毒2型（PCV2），接种量为3%-10%，优选5%-7%。收毒细胞浓度达到20-90×10⁴/ml，优选50~80×10⁴/ml。溶氧在20%-70%之间，优选30%-50%之间，进一步优选40%-50%之间。

本发明进一步从临床病例中分离的猪圆环病毒2型LG株和猪鼻支原体DL株经过鉴定和体外驯化获得猪圆环病毒2型和猪鼻支原体的强毒株和疫苗毒株，通过对猪圆环病毒2型（PCV2）与猪鼻支原体二联疫苗的生产工艺的优化，制备了猪圆环病毒2型（PCV2）与猪鼻支原体二联疫苗，该疫苗对试验猪是安全有效的，能够高效防控猪圆环病毒2型（PCV2）和猪鼻支原体感染引起的相关疾病。

本发明所使用的术语“包含”是指组合物和方法包括所述及的要素，但不排除其它要素。“抗原”指能在动物中刺激产生抗体或T-细胞应答，或二者的化合物、组合物或免疫原性物质，包括给动物注射或被动物吸收的组合物。免疫反应可以针对整个分子或者针对分子的一部分(例如表位或半抗原) 产生。“免疫原性或免疫组合物”，指包含至少一种抗原的组合物，所述抗原在宿主中引发对感兴趣的组合物或疫苗发生细胞和/或抗体-介导的免疫应答而导致的免疫反应。 “免疫反应”指在动物中引发的反应。免疫反应可以指细胞免疫(CMI)；体液免疫或者可以包括二者。“免疫原性”指能够在宿主动物中产生针对一个或多个抗原的免疫反应。这种免疫反应构成由疫苗引发的针对特定的感染性生物体的保护性免疫的基础。 “佐剂”指包含一种或多种增强对抗原免疫反应的物质的组合物。佐剂的作用机理还不完全清楚，认为一些佐剂通过缓慢释放抗原增强免疫反应，而其它佐剂自身具有强的免疫原性，并被认为是通过协同作用发挥功能。术语“多价”指包含来自于同一个物种或是来自不同的物种的超过一种抗原的疫苗，或者包含来自不同属的抗原的组合的疫苗。“灭活疫苗”指包含不再能复制或生长的感染性生物体或病原体的疫苗组合物。病原体的来源可以是细菌、病毒、原生动物或真菌。灭活可以通过多种方法实现，包括冻融、化学处理(例如用硫柳汞或福尔马林处理)、超声、辐射、热或任何其它足以防止该生物体复制或生长但保留其免疫原性的惯用方法。

实施例1 猪圆环病毒2型（PCV2）抗原的制备

病毒、细胞、抗体及试剂：

猪圆环病毒2型LG株从临床表现为PMWS的病猪分离获得，PK15细胞经鉴定无猪圆环病毒2型1型污染，猪圆环病毒2型LG株标准阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。

猪圆环病毒2型LG株培养：

1、PK15细胞的全悬浮培养

1.1 细胞初始接种密度的优化将PK15细胞接种密度调整为10×10³/ml、10×10⁴/ml、30×10⁴/ml、50×10⁴/ml、80×10⁴/ml和10×10⁵/ml，分别在生物反应器内进行全悬浮培养(培养基来自上海源培生物科技股份有限公司的无血清全悬浮培养基)。结果表明，即使提高细胞接种浓度，随着PK15细胞培养时间延长，细胞浓度生长到7.0×10⁶/ml以上时，生长速度显著变慢，处于一个平台期，此时的细胞浓度不再生长（结果见表1）。

表1 不同接种浓度对PK15细胞生长的影响

1.2 DO参数的确定：通过设定不同的DO参数进行PK-15细胞培养，可见DO参数设定20%~30%，细胞生长和代谢明显受到抑制，细胞生长缓慢，相反DO参数设定70%~80%，细胞生长早期代谢过于旺盛，而后期生长缓慢，DO参数设定40%~50%，细胞生长和代谢正常，具体见表2。

表2 不同DO对PK15细胞生长的影响

1.3 pH参数的确定：通过设定不同的pH参数进行PK15细胞培养，可见pH设定为6.8，由于为酸性环境，细胞生长明显受到抑制，细胞增长缓慢，同样，pH设定为7.6，由于碱性过强，细胞生长缓慢，而最适pH为7.2，结果见表3。

表3 不同pH对PK15细胞生长的影响

1.4 搅拌转速确定将PK15细胞接种密度调整为40×10⁴/ml开始在生物反应器中进行培养，转速分别定为60、80、100、120、120转/分钟，结果表明，转速低于100转细胞容易结团，转速高于120转细胞易破碎，100转/分钟和120转/分钟的转速对细胞形态影响较小，培养3天细胞生长密度可达到600~700×10⁴/ml，因此，100~120转/分钟为最适搅拌转速，结果见表4。

表4 不同转速对PK15细胞生长的影响

2 猪圆环病毒2型LG株悬浮培养参数

2.1 接毒时细胞浓度的确定：接毒时细胞浓度在30×10⁴/ml和50×10⁴/ml时，猪圆环病毒2型LG株滴度可达到10^6.8TCID₅₀/ml和10^7.2TCID₅₀/ml，即接毒细胞培养浓度为30~50×10⁴/ml时，猪圆环病毒2型LG株毒价最高（表5）。

表5 接毒时细胞浓度对猪圆环病毒2型LG株增殖的影响

2.2 接毒剂量的确定按照1%、2%、5%、7.5%和10%的接毒剂量，细胞浓度为40×10⁴/ml的条件下进行培养，结果表明，5%、7.5%和10%的接毒剂量可使病毒增殖最高，可达到10^7.1~10^7.2TCID₅₀/ml（表6）。

表6 不同接毒剂量对猪圆环病毒2型LG株增殖的影响

2.3 收毒时间的确定将PK15细胞浓度调整为40×10⁴/ml，按5%（v/v）接种剂量同步接种猪圆环病毒2型LG株，在生物反应器中进行培养，在接毒后24小时、48小时、72小时、96小时和120小时分别收获病毒，测毒价。结果表明，96小时和120小时收获的病毒毒价可达到10^6.7TCID₅₀/ml和10^7.1TCID₅₀/ml。确定最佳收毒时间为96小时~120小时（表7）。

表7 不同收毒时间对猪圆环病毒2型LG株增殖的影响

3 全悬浮与转瓶培养工艺的比较按照猪圆环病毒2型LG株转瓶生产工艺接毒剂量为5%；D-氨基葡萄糖为0.1mmol/L；120小时收毒猪圆环病毒2型LG株培养滴度可达到10^6.0TCID₅₀/ml，同时应用全悬浮培养工艺，接毒剂量控制在5%~10%、PK15细胞浓度为50~80×10⁴/ml、96~120小时收毒和溶氧在40~50%之间，猪圆环病毒2型LG株培养滴度可达到10^7.2TCID₅₀/ml（表8）。

表8 不同培养方式对猪圆环病毒2型增值的影响

上述实验说明，当PK15细胞传代浓度达到40~80×10⁴/ml时培养60~72小时，细胞浓度可达到50~60×10⁵/ml；接毒剂量当控制在5%、PK15细胞浓度为50~80×10⁴/ml、96~120小时收毒和溶氧在40%~50%之间，猪圆环病毒2型LG株培养滴度可达到10^6.8~10^7.2TCID₅₀/ml之间。该方式比传统转瓶生产工艺提高猪圆环病毒2型毒价5~10倍。

猪圆环病毒2型纯化：用0.45µm中空纤维模柱过滤800ml的病毒液，加入PBS700ml，重复洗涤3次，最终获得体积为1800ml病毒液。然后用300KD中空纤维柱进行浓缩纯化，将1800ml的病毒液浓缩至300ml，然后加入300mlPBS进行洗滤，重复3次。

通过对未过滤的猪圆环病毒2型（LG株）病毒原液、滤过液（0.45µm模柱过滤液）、洗滤液1（300KD模柱第一次过滤液）、洗滤液2（300KD模柱第二次过滤液）、洗滤液3（300KD模柱过洗滤混合液）、浓缩液（300KD模柱过洗滤浓缩液）蛋白含量测定发现，300KD模柱浓缩不但能很好的提高病毒滴度，而且能有效的除去80%左右的小分子蛋白，这对于提高疫苗质量，减少过敏原从而降低动物副反应至关重要，结果见表9-10。

结果见表9

表9 纯化前后病毒毒价测定

表10 病毒浓缩和洗滤过程各样品蛋白含量测定

猪圆环病毒2型灭活：在将纯化的猪圆环病毒2型的浓缩液中加入终浓度为0.2%甲醛溶液，置37℃灭活24小时，加入终浓度为0.05%亚硫酸钠终止灭活，病毒培养物经0.2%甲醛溶液灭活后接种PK15细胞，连续传3代，用IPMA法检测残存活病毒结果表明，甲醛灭活24h未检测到感染性活病毒残留，表明病毒被完全灭活。获得猪圆环病毒2型（PCV2）抗原。

实施例2 猪鼻支原体抗原的制备

病毒、细胞、抗体及试剂：猪鼻支原体DL株从临床表现为PMWS的病猪分离获得，猪鼻支原体DL株标准阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。

猪鼻支原体培养：用猪鼻支原体DL株第10代培养物为毒种，按0.2 %接毒剂量同步接种到猪鼻支原体体外培养基(PPLO肉汤、水解乳蛋白和葡萄糖等常规物质)，置37℃培养条件下振荡培养40h收获，测定CCU，8000rpm离心15min弃上清留沉淀备用。

猪鼻支原体灭活：将离心纯化的猪鼻支原体沉淀利用无菌PBS恢复至原培养体积的10%，中加入终浓度为0.2%甲醛溶液，置37℃进行灭活24小时，加入终浓度为0.05%亚硫酸钠终止灭活，病毒培养物经0.2%甲醛溶液灭活后取样接种Mhr完全培养基，用颜色变化检测残存活病毒结果表明，甲醛灭活24h后体外连续传代3次，未见培养基出现颜色变化，表明猪鼻支原体被完全灭活。获得猪鼻支原体抗原。

实施例3 猪圆环病毒2型/猪鼻支原体二联疫苗制备

利用水性佐剂按厂家说明书方法（将矿物油佐剂与水相抗原比例为1:10的比例，将油相缓慢的加入到水相抗原（实施例1和2分别制得的猪圆环病毒2型和猪鼻支原体）中，低剪切力搅拌30分钟）制备猪圆环病毒2型与猪鼻支原体二联疫苗（LG株+DL株）。制备获得猪圆环病毒2型/猪鼻支原体二联疫苗样品，对疫苗物理性状检验结果表明，疫苗的稳定性、粘稠度、外观、无菌检验等指标均符合要求。

选用35日龄健康仔猪20头，经PCR、ELISA和IPMA方法检测猪圆环病毒2型和猪鼻支原体（抗原和抗体均为阴性）试验猪，用于猪圆环病毒2型与猪鼻支原体二联灭活疫苗（LG株+DL株）免疫攻毒保护试验。试验猪随机分4组，二联疫苗免疫组10头、未免疫健康对照组10头。免疫组首次免疫剂量为1mL，免疫后第3周按相同途径和剂量加强免疫。试验猪逐日进行临床观察，记录体温、体重和临床反应情况。每周定期采集血清样品，进行抗体跟踪检测。

用二联疫苗接种，试验猪体温、体重与对照组无显著差异。疫苗免疫组试验猪发育良好, 精神和食欲正常, 未出现一过性热反应和局部炎症反应等情况，结果见表11

表11各组疫苗免疫试验猪临床反应观察

注：分子为临床反应数，分母为试验猪头数

二联疫苗免疫组在二免后14日采血分离血清，猪鼻支原体血清抗体中和指数10/10头试验猪均不低于100，未免疫对照组试验猪猪鼻支原体中和指数不高于10。结果见表12

表12 二联疫苗免疫后Mhr血清抗体中和指数测定

二联疫苗免疫试验猪在二次免疫14日后利用过氧化物酶单层细胞染色（IPMA）法检测试验猪血清抗体效价平均达到3520倍，而猪圆环病毒2型单苗免疫组试验猪血清抗体效价平均达到1120倍，未免疫对照组血清抗体不高于25，该试验表明，猪鼻支原体在制备的二联疫苗中起到了促进猪圆环病毒2型抗体的产生。结果见表13。

表13 二联疫苗免疫后PCV2血清抗体测定

将免疫组与攻毒对照组试验猪日增重进行比较，免疫组体重相对于攻毒对照组增长可达到8%以上，如表14所示。

表14 猪圆环病毒2型(LG株)效检试验猪相对增重率测定

攻毒后，相对于未免疫攻毒对照组，免疫组试验猪体重呈现正增长，相对增长率达18.35%，结果见表15。

表15 猪鼻支原体效检试验猪相对增重率测定

根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪圆环病毒2型灭活疫苗的规程制造标准，将攻毒对照组与免疫组试验猪的腹股沟淋巴结的解剖病理进行了比较。攻毒对照组的腹股沟淋巴结肿大显著，而免疫组未见显著肿大，结果见图1。

攻毒对照组3/5头试验猪主要以多发性浆膜炎或腹膜炎或胸膜炎。免疫组0/5头试验猪出现现显著的病理变化，结果见图2。

攻毒后28d剖杀试验猪，用PCR检测腹股沟淋巴结PCV2核酸发现，免疫组5/5头试验猪的腹股沟淋巴结检测不到病毒核酸，未免疫攻毒对照组在脾脏、淋巴结、扁桃体可以检测到病毒核酸，结果如见图3。

采用免疫组化法对免疫组和未免疫感染组肺脏猪鼻支原体抗原进行检测，未免疫攻毒对照试验组猪的肺脏5/5头试验猪均能检到猪鼻支原体，而未免疫组试验肺脏未检到猪鼻支原体，结果见图4。

由以上各实施例的结果可以看出，本发明的多价免疫原性组合物/多价疫苗能够抵抗猪圆环病毒2型和猪鼻支原体的攻击，不管是临床病理还是解剖病理免疫组与健康对照组无显著差异，而攻毒对照组却出现了显著的临床病理和解剖病理。并且猪鼻支原体能够促进猪圆环病毒2型抗体的滴度，为猪圆环病毒相关疾病的综合防控起到了促进作用。

Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含猪圆环病毒2型抗原和猪鼻支原体抗原，所述猪圆环病毒2型是从临床表现为PMWS的病猪分离获得的 LG毒株，通过接种于 PK-15 细胞，无血清全悬浮培养PK-15 细胞，病毒纯化，灭活获得；其中，接毒剂量控制在5％（v/v），PK15细胞浓度为50～80×10⁴ /ml，溶氧在40％～50％之间，96 ～120小时收毒，猪圆环病毒2型LG毒株培养滴度可达到10^{6 .8}～ 10^{7 .2}TCID50/ml之间；将猪鼻支原体 DL 株培养至第10代，纯化，灭活后获得猪鼻支原体灭活抗原，添加水性佐剂，获得免疫原性组合物。

2.权利要求 1所述的免疫原性组合物在制备免疫猪以抵抗猪鼻支原体和猪圆环病毒2型感染的疫苗中的用途。

3.一种试剂盒，其包含瓶，所述瓶中含有权利要求1所述免疫原性组合物。

4. 一种制备权利要求1所述免疫原性组合物的方法，所述方法包括：通过无血清全悬浮培养 PK15 细胞，其中，接毒剂量控制在5％，PK15细胞浓度为50～80×10⁴ /ml，溶氧在40％～50％之间，96 ～120小时收毒，猪圆环病毒2型LG株培养滴度可达到10^{6 .8}～ 10⁷ ^.2TCID50/ml之间；将猪鼻支原体 DL 株培养至第10代，纯化，灭活后获得猪鼻支原体灭活抗原，添加水性佐剂，获得免疫原性组合物。