CN106265628B - 槐属二氢黄酮g在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用,属于杀灭鱼类寄生虫药物技术领域。本发明首次将槐属二氢黄酮G应用于制备杀灭鱼类体外寄生虫药物,特别是用于杀灭多子小瓜虫,在有效剂量范围内全部杀灭寄生虫,达到防治多子小瓜虫病的效果,防治多子小瓜虫病效果显著。槐属二氢黄酮G的植物丰富,价格低廉,易获得,无残留、无污染、无公害、对人无毒,其提取制备工艺简单,具有广阔应用前景。槐属二氢黄酮G对草鱼的半致死浓度(46.6mg/L)是防治多子小瓜虫病最低有效浓度(2mg/L)的23.3倍,对鱼安全,有广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明属于杀灭鱼类寄生虫药物技术领域,涉及槐属二氢黄酮G的新用途,尤其涉及一种槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。
背景技术
寄生纤毛虫病是目前危害水产养殖业最为严重的寄生虫疾病之一。多子小瓜虫是一种世界性分布的鱼类体表寄生纤毛虫,主要寄生于鱼的皮肤,鳃和鳍,引起小瓜虫病,又称“白点病”,给水产养殖业造成巨大经济损失。一些化学药物,如孔雀石绿和汞制剂,杀虫效果虽然好,但是,它们毒性大,残留高,具有“三致”作用,已经被禁止使用。因此,急需寻找安全、高效和环境友好的新型药物来防治小瓜虫病。我国中草药植物资源丰富,具有易分解,无残留及对环境和人安全的优点。研究表明部分中草药植物具有杀灭多子小瓜虫的活性物质。因此,从中草药中分离鉴定出用于防治鱼类寄生虫疾病的活性物质,是开发安全环保渔药的有效途径。
槐属二氢黄酮G(Sophoraflavanone G)是从中药苦参(Sophora flavescens)中分离纯化出的一种黄酮类化合物。分子式为C25H28O6,分子量为424,白色粉末,易溶于甲醇和乙醇。据文献报道,槐属二氢黄酮G具有抗炎、抗菌和抗肿瘤的作用。其结构式如下:
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供一种槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用,特别是在制备杀灭多子小瓜虫药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。
所述的鱼类体外寄生纤毛虫指多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)。
所述的槐属二氢黄酮G的有效浓度为2~11mg/L鱼类养殖用水。
所述的药物的剂型优选为药液或粉剂。
所述的药物含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明相对于现有技术,具有如下优点及效果:
(1)本发明首次将槐属二氢黄酮G应用于制备杀灭鱼类体外寄生虫药物,特别是用于杀灭多子小瓜虫,在有效剂量范围内实现杀灭寄生虫,达到防治多子小瓜虫病的效果;防治多子小瓜虫病效果显著,有广泛应用前景。
(2)槐属二氢黄酮G对草鱼的半致死浓度(46.6mg/L)是防治多子小瓜虫病最低有效浓度(2mg/L)的23.3倍,对鱼绝对安全;
(3)槐属二氢黄酮G的植物来源丰富,价格低廉,易获得,无残留、无污染、无公害、对人无毒,其提取制备工艺简单,具有广阔应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例中用到的寄主模型鱼为草鱼(Ctenopharyngodon idellus),来源于广州市花都区五星村鱼苗场。寄生虫模型为多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis),来源于广州市花地湾花鸟鱼虫市场。
实施例1:槐属二氢黄酮G药物对多子小瓜虫感染性幼虫的杀灭作用
(1)药液的配制:称取槐属二氢黄酮G 3.84mg于1.5mL的EP管中,用20μL无水乙醇溶解,然后用蒸馏水配成2560mg/L的药物原液,用梯度稀释方法配成所需的测试浓度,储存于4℃冰箱备用。以最高浓度的药液中的无水乙醇含量(0.13%)作为标准,配制含0.13%无水乙醇的对照组处理液。
(2)取100μL大约含有600个感染性幼虫的虫液于96孔板中,另外加入100μL不同浓度的药液,使最终浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03和0mg/L,各药物浓度设置3个平行。在4×物镜下统计4h内各浓度的幼虫全部死亡时间(min)和第4h幼虫存活数,计算死亡率和半数有效浓度(EC50)。实验温度保持在23±0.5℃。计算公式如下:
死亡率(%)=(1-实验组感染性幼虫个数/对照组感染性幼虫个数)×100%
结果显示:槐属二氢黄酮G在0.5mg/L浓度下,49.3min能够使感染性幼虫100%致死,并随着药物浓度的增加,致死时间变短。
实施例2:槐属二氢黄酮G药物对多子小瓜虫成虫的杀灭作用
(1)药液配制同实施例1。
(2)取大约含有60个成虫的200μL的虫液于24孔板中,另外加入200μL不同浓度的药液,使最终浓度为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/L,每个浓度设置3个平行。在4×物镜下统计5h内各浓度的成虫全部死亡时间(min)和第5h成虫存活数,计算死亡率和半数有效浓度(EC50)。实验温度保持在23±0.5℃。6h后在4×物镜下统计各浓度存活成虫形成包囊个数,再经过16h或者17h后,统计各浓度释放的感染性幼虫个数,计算各浓度平均每个包囊释放出的感染性幼虫数。计算公式如下:
死亡率(%)=(1-实验前成虫个数/实验后成虫个数)×100%;
平均每个包囊释放出感染性幼虫数=各孔感染性幼虫数/各孔的包囊数。
结果显示:4mg/L浓度下的槐属二氢黄酮G可以全部杀灭成虫,致死时间为74.0min,并随着药物浓度的增加,致死时间变短。2mg/L浓度下的槐属二氢黄酮G对成虫的死亡率为82.8%,并且17h后可以完全抑制包囊释放感染性幼虫。
实施例3:槐属二氢黄酮G对多子小瓜虫包囊的杀灭作用
(1)药液配制同实施例1。
(2)将大约含有60个成虫的200μL的虫液加入24孔板中,静置于23±0.5℃的恒温培养箱中6h,在4×物镜下统计各孔形成包囊个数。随后加入200μL不同浓度的药液,使最终浓度为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/L,每个浓度设置3个平行。然后24孔板静置于23±0.5℃的恒温培养箱中22h,在4×物镜下统计各浓度释放的感染性幼虫个数,计算各浓度平均每个包囊释放出的感染性幼虫数。计算公式如下:
平均每个包囊释放出感染性幼虫数=各孔感染性幼虫数/各孔的包囊数。
结果显示:槐属二氢黄酮G的浓度在2mg/L及以上,能够完全抑制包囊释放出感染性幼虫。随着药物浓度的降低,平均每个包囊释放的感染性幼虫个数增加。
实施例4:低浓度槐属二氢黄酮G对多子小瓜虫幼虫感染力的影响
(1)药液的配制根据实施例1的方法,配制成0.5、0.25、0.125、0.06和0mg/L的药液各50mL。
(2)取大约含有80000个感染性幼虫的10mL虫液加入50mL烧杯中,再加入10mL药液,混匀,使最终浓度为0.25、0.125、0.06、0.03和0mg/L的槐属二氢黄酮G药液,每一处理浓度设置3个平行,然后在23±0.5℃静置1h。
事先准备15个装有4L曝气自来水的水族箱,每个水族箱装有10尾健康草鱼,将被药液处理过的感染性幼虫倒入各水族箱中,让平均每尾鱼8000只感染性幼虫感染草鱼,每一处理浓度设置3个平行。感染2h后,每个水族箱曝气自来水体积加至10L,由充氧泵供氧,实验温度保持在23±0.5℃。每天观察草鱼的存活情况,如有死鱼及时捞出,以免影响水质。实验第七天,用150mg/L的麻醉剂(MS-222)(Sigma)麻醉草鱼,记录每尾草鱼体表的白点数,并统计感染率和感染强度。计算公式如下:
感染率=(体表有白点的鱼数/总鱼数)×100%;
感染强度=体表白点总数/体表有白点的鱼数。
结果显示:槐属二氢黄酮G在0.25和0.125mg/L浓度下,预处理感染性幼虫1h,能够显著降低幼虫的感染能力,感染强度和感染率显著低于对照组。
实施例5:槐属二氢黄酮G药物在体杀虫、防病、治病效果
(1)称取1g的槐属二氢黄酮G,根据实施例1的方法,配制成50000、25000、12500和0mg/L的药液各20mL。
(2)选择轻度感染的草鱼(体表白点数为22.1±15.0)随机分配到12个含有20L曝气自来水的40L水族箱中,每个水族箱5尾已感染多子小瓜虫的草鱼。随后向每个水族箱中加入10尾健康草鱼混养。温度保持在23±0.5℃。随后向水族箱中加入上述配制的原药液,混匀,使最终浓度为2、1、0.5和0mg/L,每个浓度设置3个平行重复。实验期间,每天加入与第一天体积相同的原药液,并观察鱼的存活情况(如有死鱼,及时捞出,以免影响水质)以及随机3尾患病草鱼体表白点数。若无白点,所对应浓度的实验组停止用药,记录治疗时间,并用150mg/L的麻醉剂(MS-222)(Sigma)麻醉草鱼,记录每尾草鱼体表的白点数,并统计感染率、感染强度和存活率。实验第10天,全部实验组停止加药,并统计感染率、感染强度和存活率,同时更换50%无药液的新鲜曝气自来水。在第25天,记录存活草鱼体表的白点数,统计各实验组的感染率、感染强度和存活率。计算公式如下:
感染率(%)=(体表有白点的鱼数/总鱼数)×100%;
感染强度=体表白点总数/体表有白点的鱼数;
存活率(%)=(实验后存活鱼数/总鱼数)×100%。
结果显示:槐属二氢黄酮G在2mg/L浓度下,能够完全预防与治疗多子小瓜虫病,实验组已感染草鱼与未感染草鱼的感染率和感染强度均为0,存活率均为100%。实验第25天,槐属二氢黄酮G在2mg/L浓度下,感染率和感染强度均为0,存活率为100%。
实施例6:槐属二氢黄酮G对鱼的急性毒性实验
(1)称取500mg的槐属二氢黄酮G,根据实施例1的方法,配制成实验所需要的浓度。
(2)预实验:槐属二氢黄酮G使草鱼24h全部致死的浓度为70mg/L,96h不发生死亡的浓度30mg/L。
选取180尾健康草鱼随机分配到事先装有10L曝气自来水的18个水族箱中,温度控制在23±0.5℃,并由充氧泵供氧。在预实验的基础上,再设置60、50、40和0mg/L,每个浓度设置3个平行,进行急性毒性实验。实验期间,随时观察各浓度组实验鱼的中毒情况,如发现草鱼中毒死亡,立即捞出,以免破坏水质,影响实验结果。记录在24、48、72、和96h各个浓度组草鱼的死亡数量。根据草鱼死亡数及死亡时间,计算24h、48h、96h半致死浓度(LC50)和对草鱼的安全浓度。
结果显示:槐属二氢黄酮G对草鱼96h的半致死浓度为46.6mg/L;对草鱼的安全浓度为11.3mg/L。其安全浓度是预防与治疗有效浓度的5.6倍左右,对鱼安全。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用,其特征在于:所述的鱼类体外寄生纤毛虫指多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的槐属二氢黄酮G的有效浓度为2~11mg/L鱼类养殖用水。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的药物的剂型为药液或粉剂。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的药物含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
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