CN105943524A

CN105943524A - 姜黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用

Info

Publication number: CN105943524A
Application number: CN201610327472.7A
Authority: CN
Inventors: 张其中; 刘彦甍
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2016-09-21

Abstract

本发明公开一种姜黄素制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，特别是在制备杀灭多子小瓜虫药物中的应用，属于杀灭寄生虫药物技术领域。本发明首次将姜黄素应用于制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物，特别是用于杀灭多子小瓜虫，在有效剂量范围内可完全杀灭寄生虫，达到防治小瓜虫病的效果。本发明的姜黄素来源广泛，价格低廉，原料丰富，制备工艺已经工业化，对环境无残留无污染，对人体无毒无害，其对鱼的半致死浓度(56.8mg/L)为杀灭多子小瓜虫半数有效浓度(0.303mg/L)的187.4倍，对鱼安全；具有开发成新型防治鱼类体外寄生纤毛虫渔药的巨大潜力，应用前景广阔。

Description

姜黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用

技术领域

本发明属于杀灭寄生虫药物技术领域，涉及姜黄素的新用途，具体涉及一种姜黄素制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

背景技术

寄生纤毛虫病是水产养殖中一类危害鱼类的常见病、多发病。多子小瓜虫病属于寄生纤毛虫病中的一种，俗称“白点病”，在世界范围内分布广泛，从欧亚大陆向北直至北极圈的附近均有分布。多子小瓜虫寄生在各种鱼类的上皮组织和鳃丝组织中，剥取寄主的上皮细胞和红细胞，往往可使成千上万的鱼种在几天之内死亡，造成严重的经济损失。几十年以来，化学药物成为防治多子小瓜虫病的最有效的方式，但这些化学药物具有高残留、污染环境、对人类健康危害大等副作用，如孔雀石绿和汞制剂等药物被报道出对人体有较强的致癌和致畸作用，已经被多数国家在食用鱼上禁用。因此，寻找安全而高效的新型药物防治多子小瓜虫病刻不容缓。

我国中草药资源十分丰富，研究发现，部分中草药具有杀灭多子小瓜虫的活性物质，这些天然物质毒副作用小，易降解，不会对环境造成污染，是开发无公害渔药的理想材料。

姜黄素是从姜科(Zingiberaceae)植物姜黄(Curcuma longa)根茎中分离纯化出的一种多酚化合物。姜黄素为黄色粉末，分子式C₂₁H₂₀O₆，分子量368。姜黄素作为联合国粮食与农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)所规定的天然植物色素之一。它不仅具有重要的经济价值，而且拥有广泛的药理作用(如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、降血脂等)。其结构式为：

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种姜黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，特别是在制备杀灭多子小瓜虫药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

姜黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

所述的鱼类寄生纤毛虫指多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)。

所述的姜黄素的有效治疗浓度为4～14mg每升鱼类养殖用水。

所述的药物的剂型优选为药液或粉剂。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次将姜黄素应用于制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物，特别是用于杀灭多子小瓜虫，在有效剂量范围内可完全杀灭寄生虫，达到防治小瓜虫病的效果。

(2)本发明的姜黄素来源广泛，价格低廉，原料丰富，制备工艺已经工业化，具有开发成新型防治鱼类体外寄生纤毛虫渔药的巨大潜力，应用前景广阔。

(3)姜黄素对环境无残留无污染，对人体无毒无害，其对鱼的半致死浓度(56.8mg/L)为杀灭多子小瓜虫半数有效浓度(0.303mg/L)的187.4倍，对鱼安全。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中用到的寄主模型鱼为草鱼(Ctenopharyngodon idellus)，来源于广州市花都区五星村鱼苗场。寄生虫模型为多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)，来源于广州市花地湾花鸟鱼虫市场。

实施例1：姜黄素对多子小瓜虫感染性幼虫的杀灭作用

(1)药物的配制：称取姜黄素粉末2mg，用20μL二甲基亚砜(DMSO)促溶，加入761.25μL纯水，配成2560mg/L的一级储备液。取150μL一级储备液和1350μL纯水配成1.5mL 256mg/L的二级储备液。用二倍梯度稀释法依次配制成128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0mg/L(对照组)的药液各1.5mL。以实验用最高浓度药液中DMSO的含量(0.13％)为标准，配制含0.13％DMSO的对照组处理液。

(2)取96孔板，将含有大约500个幼虫的100μL水溶液加入各孔中，接着在各孔中加入100μL不同浓度的药液，使各孔中最终姜黄素的浓度依次为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06和0mg/L(对照组)，各药物浓度设置3个平行。在显微镜(放大倍数4×)下记录不同药物浓度下幼虫的致死时间，并计算致死率和半数有效浓度(EC₅₀)，计算公式如下：

致死率(％)＝(1-实验组幼虫个数/对照组幼虫个数)×100％。

结果显示：1mg/L浓度下，姜黄素可在21.7±1.5min完全杀灭多子小瓜虫感染性幼虫；随着姜黄素浓度的升高，杀虫时间明显缩短。

实施例2：姜黄素对多子小瓜虫成虫的杀灭作用

(1)药物配制：同实施例1。

(2)向24孔板各孔中加入200μL约含60个成熟成虫的虫液并准确统计各孔成虫数，再分别加入200μL不同浓度的姜黄素药液，使最终药物的浓度依次为64、32、16、8、4、2、1和0mg/L(对照组)，各药物浓度设置3个平行。实验温度保持为23±0.5℃，4倍物镜下记录各孔虫体5h内的致死时间和各孔存活成虫数，计算5h死亡率和半数有效浓度(EC₅₀)。上述计数完毕后，计算6h各孔形成包囊的个数，并将24孔板静置于23±0.5℃的恒温培养箱中，经16h分裂孵化，记录各孔孵化幼虫数，并计算各浓度平均每个包囊孵化的幼虫数量，计算公式如下：

死亡率(％)＝(1-实验组成虫个数/对照组成虫个数)×100％。

平均每个包囊孵出幼虫数＝各孔幼虫数/各孔的包囊数。

结果显示：浓度在8mg/L时，姜黄素在31.0±1.0min可完全杀死多子小瓜虫成虫，并且无幼虫释放。姜黄素的浓度越高，完全杀死成虫的时间越短。尽管姜黄素浓度在4、2和1mg/L时，虽不能完全杀灭小瓜虫成虫，但与对照组相比，仍具有显著的杀灭效果。

实施例3：姜黄素对多子小瓜虫包囊的杀灭作用

(1)药物配制：同实施例1。

(2)在24孔板的各孔中加入200μL约含30个成熟小瓜虫成虫的虫液，静置6h，待其形成包囊后，统计各孔包囊数，再分别加入200μL不同浓度的药液，使最终药物的浓度依次为64、32、16、8、4、2、1和0mg/L(对照组)，各药物浓度设置3个平行。加药后，将24孔板置于23℃恒温培养箱中静置16h，在4倍显微镜下观察孵化情况，统计各孔孵化幼虫数，并计算平均每个包囊孵化的幼虫数，计算公式如下：

平均每个包囊孵出幼虫数＝各孔幼虫数/各孔的包囊数。

结果显示：姜黄素的浓度越高，抑制小瓜虫包囊孵化的效果越明显。姜黄素浓度在4mg/L时可完全抑制包囊孵化。浓度在2和1mg/L时，虽不能完全抑制小瓜虫包囊孵化，但与对照组相比，仍具有显著的抑制效果。

实施例4：低浓度姜黄素对多子小瓜虫幼虫感染力的影响

(1)药液配制：根据实施例1的方法，配制成2、1、0.5、0.25、0.125和0mg/L(对照组)的药液各120mL。

(2)取40mL大约含200000个感染性幼虫的水溶液加入100mL烧杯中，再加入40mL不同浓度的姜黄素溶液，混匀，使感染性幼虫于最终浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.06和0mg/L的姜黄素药液中处理30min，每个浓度组设置3个平行。取18个水族箱，事先加入5L曝气自来水，平均每个水族箱分配10尾健康的草鱼苗，共180尾，将姜黄素不同浓度处理过的幼虫倒入各水族箱中，让其感染草鱼，感染2h后，将每个水族箱的水加至10L，水温控制在23±0.5℃，由充气泵供氧。第七天，用150mg/L的麻醉剂(MS222)麻醉草鱼，统计每尾草鱼体表的白点数，计算感染率和感染强度。

感染率(％)＝(体表存在白点的鱼数/总鱼数)×100％；

感染强度＝体表白点总数/体表存在白点的鱼数；

结果：1mg/L的姜黄素可以完全阻止多子小瓜虫感染草鱼，感染强度为0。姜黄素浓度在0.5mg/L和0.125mg/L之间处理组的感染强度和感染率与对照相比均有显著的差异。浓度为0.06mg/L的姜黄素虽然不能完全阻止多子小瓜虫感染草鱼，但该浓度下多子小瓜虫的感染强度显著低于对照组。

实施例5：姜黄素对多子小瓜虫的在体预防与治疗实验

(1)药液配制：根据实施例1方法，称取2.25g姜黄素配制成20000和0mg/L(对照组)的药液各112.5mL。

(2)选取75尾轻度感染多子小瓜虫的草鱼苗(体表白点数20±8个)和180尾未感染多子小瓜虫的健康鱼随机分配到15个水族箱中(事先加入10L曝气自来水)，平均每个水族箱放入5尾已感染多子小瓜虫的草鱼苗和10尾健康的草鱼苗。随后向各水族箱中加入上述配制的药液，混匀，使姜黄素的最终浓度分别处于4、2、1、0.5和0mg/L，每组3个平行。试验期间，每天更换相同体积的新鲜曝气自来水并加药，保持各水族箱药物浓度与第一天相同，持续用药10天，停药5天，记录死亡的草鱼数，并及时清理。各缸由供氧泵供氧，温度控制在23±0.5℃。在第15天，用150mg/L的麻醉剂(MS222)麻醉草鱼，记录姜黄素各浓度组草鱼体表的白点个数，统计感染率、感染强度和存活率。

感染率(％)＝(体表存在白点的鱼数/总鱼数)×100％；

感染强度＝体表白点总数/体表存在白点的鱼数；

存活率(％)＝(实验后存活鱼数/实验前总鱼数)×100％；

结果显示：浓度为1和0.5mg/L时患病鱼与健康鱼的存活率与对照组相比均有显著的差异。随着浓度的升高，患病鱼与健康鱼的感染率和感染强度显著降低。姜黄素在4mg/L浓度下，十天内可完全治愈多子小瓜虫病。2mg/L浓度下患病鱼和健康鱼的存活率分别为93.3±11.5％和100.0±0.0％。说明在此浓度下，2mg/L的姜黄素起到了明显的治疗作用和完全的预防作用(表1)。

表1姜黄素对多子小瓜虫在体治疗与预防实验

注：“I”表示实验前已感染多子小瓜虫的草鱼；“N”表示实验前未感染多子小瓜虫的草鱼；“－”表示15天后所有的鱼都死亡；同一纵栏内数值右上角标有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，标有不同字母则表示差异显著(P<0.05)。

实施例6：姜黄素对草鱼的急性毒性实验

(1)预实验：测定实验草鱼在24h内全部死亡的姜黄素浓度为60mg/L，96h内不发生死亡浓度为50mg/L。

(2)将210尾草鱼分别放入21个水族箱中(平均每个水族箱10尾，事先加入5L曝气自来水)，水温控制在23±0.5℃，并用充气泵供氧。在预实验的基础上设置60、58、56、54、52、50和0mg/L(对照组)七个姜黄素浓度组进行急性毒性实验。实验期间随时观察实验鱼的中毒情况，如发现草鱼死亡，立即捞出，以免破坏水质，影响实验结果。96h统计实验结果，计算半致死浓度(LC₅₀)和95％置信区间。

结果表明：急性毒性实验中，姜黄素处理组草鱼未出现死亡的浓度为54mg/L；浓度为56mg/L时，12h开始出现死亡，而后到48h草鱼对环境逐渐适应，未见鱼死亡；浓度为58mg/L时，12h内鱼出现急性中毒死亡；浓度为60mg/L时，12h内草鱼全部中毒死亡(表2)。

姜黄素的毒性低，对草鱼的96h半致死浓度(LC₅₀)为56.8mg/L，是其4h杀幼虫的半有效浓度(EC₅₀)0.303mg/L的187.4倍，是其5h杀成虫的半有效浓度(EC₅₀)2.891mg/L的19.6倍，对鱼安全(表3)。

表2姜黄素对草鱼的急性毒性实验

注：同一纵栏内数值右上角标有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，标有不同字母则表示差异显著(P<0.05)。

表3姜黄素杀多子小瓜虫幼虫和成虫效果(EC₅₀)以及对草鱼的急性毒性实验(LC₅₀)

注：95％CI表示95％置信区间。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.姜黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

2.根据权利要求1所示的应用，其特征在于：所述的鱼类寄生纤毛虫指多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)。

3.根据权利要求1所示的应用，其特征在于：所述的姜黄素的有效治疗浓度为4～14mg每升鱼类养殖用水。

4.根据权利要求1所示的应用，其特征在于：所述的药物的剂型为药液或粉剂。