CN110613707A - 去甲氧基姜黄素在杀灭和预防水产动物体外寄生虫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了去甲氧基姜黄素在杀水产动物小瓜虫以及刺激虫药物中的新用途。还公开了含有该化合物的杀虫剂，它是由下列重量百分比的原料组成：去甲氧基姜黄素20‑30％，表面活性剂10‑20%，渗透剂5‑10%，其余为水，上述原料的总和为100％。该制剂对环境毒性低、不易产生耐药性，能有效杀灭鱼类感染的刺激隐核虫和小瓜虫，其效果显著，同时，该制剂制备工艺简单，生产成本低，使用方法简单，便于推广应用。

Description

去甲氧基姜黄素在杀灭和预防水产动物体外寄生虫中的应用

技术领域

本发明属于化学产品用途技术领域，具体为去甲氧基姜黄素在杀灭和预防水产动物体外寄生虫中的应用。

背景技术

去甲氧基姜黄素，C₂₀H₁₈O₅，主要存在于姜科植物姜黄（Curcuma longa L.）的根茎，其结构式为：

具有抗肿瘤、抗炎、抗HVI、抗菌、抗氧化等多种药理作用，而且毒副作用少，具有良好的应用前景。但是对寄生虫的杀灭作用却还没有报道。本专利申请人首次发现去甲氧基姜黄素具有较好的杀灭鱼类寄生虫小瓜虫的作用。

小瓜虫是几乎可以感染所有淡水和海水鱼类的重要体外寄生虫，给水产业造成了巨大的危害。而治疗这种寄生虫最有效的药物是硝酸亚汞和孔雀石绿，而这两种药物均具有致癌等作用，故而已被禁用。随着这两种药物的禁用，目前国内外对这种寄生虫的防治主要采用甲醛、硫酸铜、高锰酸钾、溴硝醇等，但是这些药物对小瓜虫没有显著的疗效，同时长期使用带来了药物残留、环境污染、耐药性等问题，因而急需对小瓜虫具有较好杀灭作用同时对环境友好的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供去甲氧基姜黄素的新用途，即在杀灭和预防水产动物体外寄生虫中的应用。

进一步，去甲氧基姜黄素在杀灭和预防水产动物体外淡水小瓜虫和海水刺激隐核虫中的应用。

更进一步，在杀灭和预防淡水鱼类体外小瓜虫和海水鱼类刺激隐核虫中的应用。

进一步，去甲氧基姜黄素在制备杀灭和预防水产动物体外寄生虫药物中的应用。

进一步，去甲氧基姜黄素在制备杀灭和预防水产动物体外小瓜虫药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种杀灭水产动物体外小瓜虫的杀虫剂，包括下列重量百分比的原料：去甲氧基姜黄素20-30％，表面活性剂10-20%，渗透剂5-10%，其余为水。

作为优选，所述溶解剂为水或二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺。

作为优选，所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。

作为优选，所述渗透剂为氮酮（不具杀小瓜虫作用）。

本发明还提供一种杀灭水产动物体外小瓜虫的杀虫剂的制备方法，其特征在于，

1）按所述重量份称取去甲氧基姜黄素、表面活性剂、渗透剂、溶解剂，备用；

2）将溶解剂加入去甲氧基姜黄素中，并搅拌至去甲氧基姜黄素完全溶解；

3）将表面活性剂加入步骤2）所得的混合溶液中搅拌均匀；

4）将渗透剂和溶剂加入到步骤3）所得的混合溶液中，搅拌均匀，即得杀虫剂。

上述杀虫剂的使用方法及使用量：用水稀释后泼洒于养殖塘中，使用剂量为2.0-4.0 mL/m³。

本发明采用去甲氧基姜黄素，毒性小，对水产动物无毒害、残留少；利用特定溶解剂及溶剂，溶解效果好，并且溶解剂可以协助杀虫剂进入小瓜虫体内，对小瓜虫的杀灭效果显著；杀虫剂的制备简单、使用方便，生产成本低。

附图说明

附图1为去甲氧基姜黄素对小瓜虫幼虫的杀灭效果；

附图2 A为去甲氧基姜黄素作用包囊6h后的显微结构（40×）；

附图2 B为正常分裂包囊的显微结构（40×）；

附图3为去甲氧基姜黄素刺激隐核虫幼虫的杀灭作用。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明以及本发明药剂的药效，以下通过发明人给出的依本发明技术方案所完成的具体的实施例对本发明作进一步的详细描述，这些仅是本发明较好的实施例，但不限于这些实施例。

实施例1：

称取去甲氧基姜黄素20g，在二甲基亚砜中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-20 10g，称取渗透剂8 g，加入剩余量的水混合搅拌均匀即得杀虫剂。

实施例2：

称取去甲氧基姜黄素30g，在二甲基亚砜中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-20 20g，称取渗透剂10g，加入剩余量的水混合搅拌均匀即得杀虫剂。

实施例3：

称取去甲氧基姜黄素25g，在水中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-20 15g，称取渗透剂8g，加入剩余量的水混合搅拌均匀即得杀虫剂。

实施例4：

称取去甲氧基姜黄素25g，在30毫升二甲基亚砜中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-2010g，称取渗透剂8 g，加入剩余量的水混合搅拌均匀即得杀虫剂。

上述实施例可以列举很多，再此不一一列举，从申请人所做的大量实验得到的数据证明，只要是按照本发明的技术方案的参数范围选择，即可制备出达到本发明目的的水产动物小瓜虫和刺激隐核虫的杀虫剂。

上述杀虫剂可直接泼洒于池塘中，以池塘水量为参考，从经济方面考虑建议使用剂量为3.0 mL/m³均可。

以下是本发明的药效分别对小瓜虫的试验：

1 材料与方法

1.1 试验鱼

严重感染小瓜虫的金鱼（来自浙江省淡水水产研究所苗种基地。随机选取10尾鱼，取全鳃镜检观察统计鳃上小瓜虫数量，试验鱼小瓜虫感染率为100%。

1.2 去甲氧基姜黄素的追踪分离及结构鉴定

将干燥的莪术茎叶，50～60目过筛备用，根据预实验确定莪术杀虫活性部位为乙醇提取部分，故利用乙醇对其进行提取，经浓缩后利用硅胶柱层析进行分离。以TLC检测分析为指导，合并相似流份，对各个流份组进行杀虫活性药效测定（体外杀小瓜虫掠食体、滋养体和包囊），不具杀虫活性的流分丢弃，具有较强杀虫效果的流分组继续进行追踪分离（HPLC）直至分离得到活性单体，对活性单体进行质谱、核磁氢谱以及核磁碳谱鉴定，并与文献报道中的图谱数据进行比对，确定该化合物为去甲氧基姜黄素。

1.3 体外杀虫试验

将严重感染小瓜虫的金鱼放入烧杯中，待小瓜虫游出后，用吸管将成熟小瓜虫收集放入平皿中，一部分虫体用于小瓜虫幼虫的培养，一部分用于包囊的收集。

1.3.1 对小瓜虫幼体的体外杀虫试验

试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入约2ml不同浓度的去甲氧基姜黄素（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mg/L）和约100个小瓜虫幼虫，于用药后10 min、1 h、2 h、3 h、4 h镜检观察一次，4h后统计各孔的小瓜虫死亡率。试验设置和充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。

小瓜虫死亡判断标准：虫体纤毛不运动，胞质不流动，胞膜破裂，细胞核破碎。

1.3.2 对小瓜虫包囊的体外杀虫试验

试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入约2ml不同浓度的去甲氧基姜黄素（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/L）和30个小瓜虫包囊，于用药后4h镜检观察一次，4h后统计各孔的小瓜虫包囊死亡率。试验设置充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。

小瓜虫包囊死亡判断标准：包囊未分裂或包囊未孵出幼虫。

1.4 去甲氧基姜黄素杀虫剂的体内杀灭小瓜虫试验

体内杀虫试验用药为按照实施例1的杀虫剂，（预实验先进行渗透剂的杀虫药效，表明其没有杀虫作用）。

在一个体积为1m³的水泥池中放入120尾健康未感染任何寄生虫的草鱼，暂养一周后，放入600000个小瓜虫幼虫进行感染，感染24h后，将感染有小瓜虫的草鱼进行分组，每组10尾鱼，并放入100L的鱼缸中。根据体外杀虫试验设置杀虫剂的杀虫试验浓度1.0 3.0和5.0 mL/m³。于体积为80cm×60cm×40cm的玻璃缸内盛入充分曝气的自然水，pH 7.0～7.5，水温25±1℃。按照设定好的浓度向水体中加入不同浓度的杀虫剂，并搅拌均匀，并在第3天和第5天，每个试验组重新加换新的杀虫剂。

试验第5天时，每个浓度组取出3尾草鱼，并放入烧杯中，按照体外杀虫试验的方法收集包囊，并观察包囊的死亡和分裂情况。

试验第10天，将所有组内的草鱼取出，全鳃制片、镜检，统计每尾草鱼在鳃部小瓜虫存活数量，计算平均杀虫率。

杀虫率(%)=(对照组的小瓜虫平均存活数量－试验组的小瓜虫平均存活数量)/对照组的小瓜虫平均存活数量×100%。

鱼平均死亡率(%)=(投放的鱼数量-镜检时的鱼存活数量)/投放的鱼数量×100%。

1.5. 去甲氧基姜黄素对草鱼的急性毒性试验

试验在体积为80L的玻璃缸中进行，每个缸中放置健康的草鱼10尾，预实验结果显示，去甲氧基姜黄素对草鱼的24h全部死亡浓度为65 mg/L，对草鱼96h不死亡的浓度为50 mg/L。故而根据等对数梯度方法设计药物的毒性浓度梯度分别为：50.0、52.8、55.8、58.8、61.9和 65.1 mg/L，48h后统计草鱼死亡数量，并计算甲氧基姜黄素对草鱼的半致死浓度。每个浓度组做3个重复，试验设置一个对照组。

2 结果

试验数据用SPSS16.0统计学软件进行处理，所有参数均用均数±标准差(±SD)表示。

2.1体外杀小瓜虫试验

去甲氧基姜黄素对小瓜虫幼虫的体外杀灭作用见附图1。由附图1可知：去甲氧基姜黄素对小瓜虫具有较强的杀灭作用，并且随着浓度的增加其杀灭作用逐渐增强，他对小瓜虫幼虫10 min-、1 h-、2 h-、3 h和4 h-半数致死有效浓度（EC₅₀）(95% CI) 的浓度分别为0.71 (0.68-0.74)、0.56 (0.52-0.60)、0.38(0.34-0.42)、0.35 (0.33-0.37) 和0.29(0.28-0.30) mg/L，其浓度为1.0 mg/L时，10 min以内即可100%杀死对小瓜虫幼虫。

去甲氧基姜黄素对小瓜虫包囊的体外杀灭作用见表1。由表1可知：去甲氧基姜黄素在浓度为3.0 mg/L包囊破裂且未分裂，也未孵出幼虫图2A），其对包囊的杀虫率为100%。其浓度为2.5、2.0、1.5 及1.0 mg/L时对包囊的杀灭率分别为93.3%、86.7%和56.7%，而1.0mg/L浓度组对包囊基本没有作用，全部包囊均孵化出来（图2B）。

2.2 去甲氧基姜黄素杀虫剂的体内杀虫试验

去甲氧基姜黄素杀虫剂对寄生于草鱼上的体内杀虫试验结果如表2。由表2可知：去甲氧基姜黄素杀虫剂对小瓜虫具有较强的杀灭作用，使用药物后，草鱼体表和鳃上的小瓜虫数量明显减少，且其掉落后的包囊的幼虫孵化率明显减少。当其浓度为5.0 mL/m³时，草鱼的死亡率为6.7%，其鳃上和鳍条的小瓜虫数为286.5±23.8, 浓度为3.0 mL/m³时，草鱼的死亡率为10.0%，其鳃上和鳍条的小瓜虫数为325.6±15.5。而对照组的草鱼死亡率为100%，鳃和鳍条上小瓜虫的数量为866.2±104.6。结果表明去甲氧基姜黄素杀虫剂对感染有小瓜虫的试验鱼具有较强的保护作用,从经济方面考虑，建议使用浓度为3.0 mL/m³。

2.3 去甲氧基姜黄素对草鱼的急性毒性试验

浓度为50.0 mg/L去甲氧基姜黄素用药24h后草鱼死亡率为0，且草鱼活性正常，也未见异常反应。浓度为65.1 mg/L去甲氧基姜黄素用药6h后草鱼即出现呼吸急促，跳跃等异常反应，96h后草鱼全部死亡。去甲氧基姜黄素对草鱼的96h LD₅₀为58.2 mg/L。

去甲氧基姜黄素杀灭寄生鱼类刺激隐核虫的体外药效试验

1 材料与方法

1.1 试验鱼

严重感染刺激隐核虫的大黄鱼来自福建福鼎某苗种基地。

1.2 体外杀虫试验

将严重感染刺激隐核虫的大黄鱼放入体积为1m³圆桶中，于第二天上午放水用刷子轻轻刷桶底，收集底部的刺激隐核虫。并用吸管将成熟虫体收集放入烧杯中，一部分虫体用于幼虫的培养，一部分用于包囊试验。

1.2.1 去甲氧基姜黄素对刺激隐核虫幼虫的体外杀灭试验

试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入约2ml不同浓度的药液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mg/L）和约100个幼虫，于用药后4h统计各孔的幼虫死亡率。试验设置DMSO对照组和充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。

幼虫死亡判断标准：虫体纤毛不运动，胞质不流动，胞膜破裂，细胞核破碎。

1.2.2 去甲氧基姜黄素对包囊的体外杀灭试验

试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入约2ml不同浓度的药液（（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/L）和30个包囊，于用药后4h镜检观察一次，4h后统计各孔的刺激隐核虫包囊死亡率。试验设置DMSO对照组和充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。

包囊死亡判断标准：包囊未分裂或包囊未孵出幼虫。

1.3 数据处理

试验数据用SPSS16.0统计学软件进行处理，所有参数均用均数±标准差(±SD)表示。

2 结果

2.1 去甲氧基姜黄素的体外杀虫试验

去甲氧基姜黄素对幼虫的体外杀灭作用见图3。由图3可知：去甲氧基姜黄素对刺激隐核虫幼虫具有较强的杀灭作用，随着浓度的增加其杀灭作用逐渐增强，他对幼虫的4 h-半数致死有效浓度（EC₅₀）(95% CI) 的浓度分别为 2.9 (2.7-3.1), mg/L,其浓度为1.0 mg/L时，作用4h对幼虫的杀灭率为100%。

去甲氧基姜黄素对小瓜虫包囊的体外杀灭作用见表3。由表3可知：去甲氧基姜黄素在浓度为8.0 mg L^-1 包囊未分裂，也未孵出幼虫，其对包囊的杀虫率为100%。其浓度为6.0 ,4.0, 2.0 及1.0 mg L^-1 时对包囊的杀灭率分别为94.4%, 62.2%, 16.7% 和5.5%。其4 h-EC₅₀ (95% CI) 为3.8 (3.7-3.9) mg L^-1。

Claims (10)

1.去甲氧基姜黄素在杀灭和预防水产动物体外寄生虫中的应用。

2.去甲氧基姜黄素在杀灭和预防水产动物体外的小瓜虫和刺激隐核虫中的应用。

3.去甲氧基姜黄素在制备杀灭和预防水产动物体外寄生虫药物中的应用。

4.去甲氧基姜黄素在制备杀灭和预防水产动物体外的小瓜虫和刺激隐核虫药物中的应用。

5.含去甲氧基姜黄素或以去甲氧基姜黄素为主要成分的在杀灭和预防水产动物体外的小瓜虫刺激隐核虫药物中的应用。

6.一种杀灭水产动物体外寄生虫的杀虫剂，其特征在于，包括下列重量百分比的原料：去甲氧基姜黄素20-30％，表面活性剂10-20%，渗透剂5-10%，其余为水。

7.根据权利要求6所述的一种杀灭水产动物体外寄生虫的杀虫剂，其特征在于，所述溶解剂为水或二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺。

8.根据权利要求6所述的一种杀灭水产动物体外小瓜虫的杀虫剂，其特征在于，所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。

9.根据权利要求6所述的一种杀灭水产动物体外小瓜虫的杀虫剂，其特征在于，所述渗透剂为氮酮。

10.如权利要求6所述的杀虫剂的制备方法，其特征在于，1）按所述重量份称取去甲氧基姜黄素、表面活性剂、渗透剂、溶解剂和水，备用；

2）将溶解剂加入去甲氧基姜黄素中，并搅拌至去甲氧基姜黄素完全溶解；

3）将表面活性剂加入步骤2）所得的混合溶液中搅拌均匀；

4）将溶剂加入到步骤3）所得的混合溶液中，搅拌均匀，即得防治剂。