发明内容
本发明目的之一是提供含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂用于促进动物生长的用途。
本发明目的之二是提供含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂用于保护动物肝脏的用途。
本发明目的之三是提供含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂用于提高动物的抗氧化能力,降低脂质过氧化物的产生,提高免疫防御力和抗病力的用途。
本发明目的之四是提供含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂用于提高鱼体的抗应激力,避免出现“应激性出血”问题,促进鱼体粘液分泌,解决养殖中鱼体鳞片松动、易脱落,体表粘液缺失问题的用途。
所述用途中的一种可以用来生产动物饲料,所述动物饲料包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂,所述动物饲料包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂重量百分比为0.05%~0.2%。
所述动物饲料还可选择的包含小麦和/或玉米、大豆、豆粕、麸皮、细米糠、棉粕、菜粕、肉粉、肉骨粉、鱼粉、酵母、盐、磷酸二氢钙、矿物质、维生素、氨基酸、沸石粉、膨润土、豆油等其它原料,所述动物饲料中的其它原料可由本领域技术人员根据动物营养需要而选择或设计;或包含适合动物生长的标准动物饲料/基础动物饲料。
所述动物基础饲料配方:鱼粉1%~30%,豆粕5%~35%,棉粕5%~30%,菜粕5%~30%,肉粉(或肉骨粉)2%~10%,小麦5%~20%,玉米5%~20%,大豆2%~6%,麸皮5%~20%,细米糠5%~25%,酵母粉1%~5%,沸石粉1%~2%,膨润土1%~2%,复合维生素0.1%,复合矿物质0.8%~1%,磷酸二氢钙1.8%~2.2%,豆油1%~3%;
所述包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合添加剂的动物饲料为,上述动物基础饲料中包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合添加剂0.05%~0.2%。
所述复合维生素和复合矿物质为本领域常用添加剂,其配方差异在本发明中不影响最终使用结果。本发明中述及的复合维生素和复合矿物质与此处含义相同。
本发明常用的复合维生素为每kg复合维生素中含有,维生素A:100~400万IU,维生素D3:50~200万IU,维生素E:30~120g,维生素K3:2~15g,维生素B1:5~20g,维生素B2:5~20g,维生素B6:2~30g,B12:0~1g,烟酸:5~60g,泛酸:5~60g,叶酸:0.5~10g,生物素:0~0.15g,肌醇:30~200g,维生素C:50~200g,余量为玉米蛋白粉;优选饲料中复合维生素添加量为0.1%。例如所述复合维生素配方之一为每kg复合维生素中含有,以维生素计,维生素A:200万IU,维生素D3:100万IU,维生素E:60g,维生素K3:5g,维生素B1:10g,维生素B2:10g,维生素B6:20g,B12:0.1g,烟酸:30g,泛酸:20g,叶酸:5g,生物素:0.1g,肌醇:100g,维生素C磷酸酯(35%含量):300g,余量为玉米蛋白粉,饲料中该复合维生素添加量为0.1%。
本发明常用的复合矿物质为每kg复合矿物质中元素含量为,铁元素10~30g,铜元素0.2~1g,锰元素3~8g,锌元素6~20g,碘元素0.02~0.1g,钴元素0.001~0.12g,硒元素0.01~0.08g,镁元素10~30g,余量为沸石粉,饲料中复合矿物质添加量优选为0.8%~1%。例如所述复合矿物质配方之一为每kg复合矿物质中元素含量为,铁元素18.75g,铜元素0.4375g,锰元素3.75g,锌元素15g,碘元素0.0813g,钴元素0.00875g,硒元素0.0625g,镁元素22.5g,余量为沸石粉补足,饲料中该复合矿物质添加量为0.8%。
所述动物饲料可以制成粉料、膨化料、硬颗粒料、半湿性饲料中的任何一种形式。
本发明所述含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂由重量百分比计的以下原料组成:姜黄素或姜黄素衍生物0.1%~30%,维生素C 5%~35%,肌醇3~20%,其余为玉米芯粉;优选为姜黄素或姜黄素衍生物0.5%~28%,维生素C 10%~35%,肌醇5~20%,其余为玉米芯粉;更优选为姜黄素或姜黄素衍生物1%~25%,维生素C 10%~35%,肌醇10~20%,其余为玉米芯粉。
维生素C为重要的抗氧化剂,可以保护维生素E及多元不饱和脂肪酸,避免被氧化或与过氧自由基以及氢氧自由基等游离基反应,而降低营养素活性。
本发明所述维生素C优选为维生素C-2-磷酸酯,相当于维生素C效价35%;维生素C-2-磷酸酯对水分、pH、无机盐、光、氧、热的稳定性大大提高,在水产动物饲料中稳定性和生物利用率有很大的提高。
肌醇即环已六醇,分子式为C6H12O6。属于维生素类物质,主要以磷酯酰肌醇形式广泛存在于动物和微生物细胞中。在生物体内具有信号传递的作用,还是构成细胞膜和脂蛋白的磷脂质成分,为趋脂因子,能促进细胞新陈代谢、促进脂肪代谢、降低血脂、抑制胆固醇的生成及动脉硬化等。高等动物若缺少肌醇,会出现生长停滞,毛发脱落,体内生理活动失去平衡。当水产动物肌醇摄入不足时,会造成鱼类生长缓慢、贫血,鱼鳍腐烂,同时导致部分鱼类出现消化和免疫功能降低、表皮粘液减少等症状。
所述含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的制备方法为:
1)将含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂配方中原料分别进行粉碎,过80目标准筛,备用;
所述由含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂配方为由重量百分比计的以下原料组成:姜黄素或姜黄素衍生物0.1%~30%,维生素C 5%~35%,肌醇3~20%,其余为玉米芯粉;
2)按配方分别称取姜黄素或姜黄素衍生物,维生素C,肌醇,玉米芯粉;备用;
所述维生素C优选为维生素C-2-磷酸酯,相当于维生素C效价35%;
3)将配方中各原料加入至混合机中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂。
所述含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂可用于制备饲料或养殖动物。
本发明含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂将姜黄素或姜黄素衍生物与维生素C和肌醇复配使用,三者协同增效作用,功能协调平衡,能够显著提高鱼体的抗应激力,避免出现“应激性出血”问题,促进鱼体粘液分泌,改善鳞片脱落问题,效果较单一组份的作用显著。同时对水产动物脂肪肝、肝纤维化等肝脏疾病的改善和调整效果显著,降低血清转氨酶活性,预防和治疗效果较单一组份显著。
本发明含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂优点:
1)复合饲料添加剂有更好的流动性,改善在饲料中的混合均匀度,操作简便易行,并且有效地避免了运输、贮存过程中引起的活性损失或降低。
2)该复合饲料添加剂活性在贮存过程中得以保存。
3)该复合饲料添加剂不会对由其喂养的动物引起明显的副作用(如对胃、肠道的伤害,刺激胃黏膜和肠道黏膜,影响动物食欲)。
4)该复合饲料添加剂在饲料中的添加量以含有姜黄素或姜黄素衍生物重量比计,饲料中含姜黄素或姜黄素衍生物在0.01%~0.025%范围时,具有明显的促生长效果,使用剂量和成本低,对肝脏的保护和修复具有很好的效果。
5)该含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂可以方便轻易地与任何标准饲料/基础饲料混合,使该复合添加剂可以大规模、简便有效地在养殖场推广应用。
6)在动物出现健康问题(如肝损伤)时,即可以将该含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂与标准饲料/基础饲料混合后饲喂动物;也可以将该复合添加剂单独饲喂动物。
本发明目的之五是提供一种包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料,用来促进动物生长。
本发明目的之六是提供一种包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料,用来保护动物肝脏。
本发明目的之七是提供一种包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料,用来提高动物的抗氧化能力,降低脂质过氧化物的产生,提高免疫防御力和抗病力。
本发明目的之八是提供一种包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料,用来提高鱼体的抗应激力,避免出现“应激性出血”问题,促进鱼体粘液分泌,解决养殖中鱼体鳞片松动、易脱落,体表粘液缺失的问题。
根据所述发明目的五至八所述的动物饲料包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂,所述动物饲料包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂重量百分比为0.05%~0.2%。
所述动物饲料还可选择的包含小麦和/或玉米、大豆、豆粕、麸皮、细米糠、棉粕、菜粕、肉粉、肉骨粉、鱼粉、酵母、盐、磷酸二氢钙、矿物质、维生素、氨基酸、沸石粉、膨润土、豆油等其它原料,所述动物饲料中的其它原料可由本领域技术人员根据动物营养需要而选择或设计;或包含适合动物生长的标准动物饲料/基础动物饲料。
所述动物饲料配方:鱼粉1%~30%,豆粕5%~35%,棉粕5%~30%,菜粕5%~30%,肉粉(或肉骨粉)2%~10%,小麦5%~20%,玉米5%~20%,大豆2%~6%,麸皮5%~20%,细米糠5%~25%,酵母粉1%~5%,沸石粉1%~2%,膨润土1%~2%,复合维生素0.1%,复合矿物质0.8%~1%,磷酸二氢钙1.8%~2.2%,豆油1%~3%,含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合添加剂0.05%~0.2%。
所述复合维生素和复合矿物质为本领域常用添加剂,其配方差异在本发明中不影响最终使用结果。本发明中述及的复合维生素和复合矿物质与此处含义相同。
所述动物饲料可以制成粉料、膨化料、硬颗粒料、半湿性饲料中的任何一种形式。
本发明所述含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂由重量百分比计的以下原料组成:姜黄素或姜黄素衍生物0.1%~30%,维生素C 5%~35%,肌醇3~20%,其余为玉米芯粉;优选为姜黄素或姜黄素衍生物0.5%~28%,维生素C 10%~35%,肌醇5~20%,其余为玉米芯粉;更优选为姜黄素或姜黄素衍生物1%~25%,维生素C 10%~35%,肌醇10~20%,其余为玉米芯粉。
当本发明包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料用于饲养健康动物时,能够促进动物生长,保护动物肝脏,提高动物的抗氧化能力、降低脂质过氧化物的产生、提高免疫防御力和抗病力,提高鱼体的抗应激力、避免出现“应激性出血”问题、促进鱼体粘液分泌、解决养殖中鱼体鳞片松动、易脱落、体表粘液缺失问题。
当本发明包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料用于饲养动物的养殖周期中,养殖前期和中期即生长期和育肥期时,能够优先促进动物生长。促进动物生长时动物饲料中姜黄素或姜黄素衍生物重量百分比含量优选为0.01%~0.025%。
当本发明包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料用于饲养动物在肝脏受损或病变时,能够优先保护和修复动物肝脏。
当本发明包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料用于饲养动物在健康状况下降时,能够优先提高动物的抗氧化能力、降低脂质过氧化物的产生、提高免疫防御力和抗病力。
当本发明包含含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料用于饲养动物在养殖过程中,尤其在高温季节拉网、捕鱼等外界刺激时,能够优先提高鱼体的抗应激力、避免出现“应激性出血”问题、促进鱼体粘液分泌、解决养殖中鱼体鳞片松动、易脱落、体表粘液缺失问题。
本发明目的之九是提供一种饲养动物并能够促进动物生长,保护动物肝脏,提高动物的抗氧化能力、降低脂质过氧化物的产生、提高免疫防御力和抗病力,提高鱼体的抗应激力、避免出现“应激性出血”问题、促进鱼体粘液分泌、解决养殖中鱼体鳞片松动、易脱落、体表粘液缺失问题的方法,包括:
(1)准备含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂;
(2)制备动物饲料;
(3)采用所述动物饲料饲养所述动物。
本发明目的之十是提供一种含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂,可促进动物生长,和/或保护动物肝脏,和/或提高动物的抗氧化能力、降低脂质过氧化物的产生、提高免疫防御力和抗病力,和/或提高鱼体的抗应激力、避免出现“应激性出血”问题、促进鱼体粘液分泌、解决养殖中鱼体鳞片松动、易脱落,体表粘液缺失的问题。
本发明含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂可以单独,或者,与标准饲料/基础饲料混合在一起,在动物生长阶段连续饲喂,有效地促进动物体内生理生化代谢过程,调节动物生长发育,可促进动物生长,和/或保护动物肝脏,和/或提高动物的抗氧化能力、降低脂质过氧化物的产生、提高免疫防御力和抗病力,和/或提高鱼体的抗应激力、避免出现“应激性出血”问题、促进鱼体粘液分泌、解决养殖中鱼体鳞片松动、易脱落,体表粘液缺失的题。
本发明适合于所有的养殖水产动物,如鱼、虾、蟹、蛙、甲鱼等等。
姜黄素从姜黄根茎中提取,为二酮类化合物,为姜黄的主要有效成份,可以从郁金和莪术等提取。姜黄素类化合物为姜黄中含有以姜黄素为主的分子结构略有差异的三种酚性单体,即姜黄素(Ⅰ,curcumin)、脱甲氧基姜黄素(Ⅱ,Demethoxycurcumin)和双脱甲氧基姜黄素(Ⅲ,Bisdemethoxycurcumin),分子式分别为C21H20O6、C20H18O5和C19H16O4,三者含量之比约为姜黄素:脱甲氧基姜黄素:双脱甲氧基姜黄素=7:2:1。姜黄素为橙黄色结晶粉末,味稍苦,不溶于水。溶于乙醇、丙二醇,易溶于冰醋酸和碱溶液,在碱性时呈红褐色,在中性、酸性时呈黄色。对还原剂的稳定性较强,着色性强,一经着色后就不易退色,但对光、热、铁离子敏感,耐光性、耐热性、耐铁离子性较差。在食品生产中主要用于肠类制品、罐头、酱卤制品等产品的着色。医学研究表明,姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。分子式:C21H20O6,分子量:368.37,熔点:186~187℃。结构式如下:
所述脱氧基姜黄素,双脱甲氧基姜黄素与姜黄素成分结构相近,不稳定,易氧化,在碱性溶液中易降解。近年来研究发现脱甲氧基姜黄素降血脂的活性明显高于姜黄素;防止细胞脂类过氧化物的形成,双脱甲氧基姜黄素效果优于去甲氧基姜黄素。
其中脱甲氧基姜黄素分子式:C20H18O5,分子量:338.35,熔点:175~176℃;双脱甲氧基姜黄素分子式:C19H16O4,分子量:308.33,熔点:231~232℃。
脱甲氧基衍生物具有降低胆固醇、β脂蛋白和甘油三脂的作用,特别是能降低主动脉中的胆固醇及甘油三脂;可增加胆汁的分泌和生成,并能增强胆囊收缩;有强力的抗真菌作用,对肝炎病毒有抑制作用。此外有改善生物体消化系统的功能。结构式如下:
其中脱甲氧基姜黄素:R1= -H , R2= -OCH3
双脱甲氧基姜黄素:R1=R2= -H
所述姜黄素衍生物为姜黄素芳环衍生物或N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯或姜黄素环酮衍生物;
所述N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯的衍生物包括:N-马来酰-甘氨酸-姜黄素单酯、N-马来酰-缬氨酸-姜黄素单酯、N-马来酰-异亮氨酸-姜黄素单酯、N-马来酰-亮氨酸-姜黄素单酯;
所述姜黄素环酮衍生物包括:2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H),
2,6-双(3,4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=-OH,R2=-H),
2,6-双(3-甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=H,R2=-OCH3),
2,6-双(3,5-二叔丁基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-C(CH3)3),
2,6-双(3,5-二甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-OCH3);
所述姜黄素衍生物为姜黄素芳环衍生物,姜黄素在小肠中吸收不好,口服效果差,生物利用度不高,且代谢快,要达到治疗效果需要反复口服姜黄素,因此,对其结构进行改造的一个目的是提高其生物利用度。所以利用姜黄素中的酚羟基,通过共价键连接姜黄素分子与配体形成生物配合物,提高对细胞膜的通透性。
其中R= -CH3CO,R1=-CH3CO;或者R=-NH2CH2CO,R1= -NH2CH2CO;或者R=-CH3,R1=-CH3;或者R=-CH2COOCH3,R1= -CH2COOCH3;或者R=-COOH; R1=-COOH。
所述姜黄素衍生物为N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯,主要是为了提高姜黄素的抗癌活性及选择性,从几种氨基酸出发,经过马来酸酐活化后与姜黄素结合,得到四个化合物。一方面可以改善姜黄素的脂溶性,一方面又加强了姜黄素在体内的活性。N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯的制备可采用现有技术方法,(如刘建敏,姜凤超;“抗肿瘤前药-姜黄素衍生物的设计合成及初步活性测试”中国药师[J],2005年第8卷第7期,543~545;)
其中R= -H;或者R= -CH(CH3)2;或者R= -CH(CH3)CH2CH3; 或者
R= -(CH2)2CH(CH3)2
合成方法如下:(1)N-马来酸-甘氨酸的合成。将甘氨酸(R=H)与一定量的马来酸酐在室温下反应,抽滤,滤饼分别用水、无水乙醇、乙醚洗涤,真空干燥的白色粉末,收率89%。
按照以上方法,分别用缬氨酸(R=-CH(CH3)2)、异亮氨酸(R=-CH(CH3)CH2CH3)和亮氨酸(R=-(CH2)2CH(CH3)2)代替甘氨酸进行反应,制得相应产物。
(2)N-马来酰-甘氨酸-姜黄素单酯合成
将N-马来酸-甘氨酸溶于一定量的氯化亚砜,搅拌,加热至回流,反应至无气体产生。减压蒸馏除去剩余的氯化亚砜,向残留物中加入四氯化碳,减压蒸馏,连续三次以除尽氯化亚砜,所得物用CHCl2溶解得溶液备用。
然后将一定量的姜黄素溶解于二氯甲烷后,加入三乙胺,搅拌,缓慢滴加上述溶液,室温继续搅拌,抽滤,滤液分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次,有机层以无水硫酸镁干燥,旋转蒸发减压下除去溶剂,得棕色固状物,过滤,真空干燥后得到棕红色固体。甲醇-水(80%)重结晶,真空干燥,得棕红色粉末状固体N-马来酰-甘氨酸-姜黄素单酯,产率27%,熔点93~97℃。
按照以上方法,分别制得深褐色粉末N-马来酰-缬氨酸-姜黄素单酯,熔点:106~109℃。
砖红色粉末N-马来酰-异亮氨酸-姜黄素单酯,熔点:80~83℃。
深红色粉末N-马来酰-亮氨酸-姜黄素单酯,熔点:105~107℃。
以上四种姜黄素衍生物,经过体外细胞试验数据显示,对于胰腺癌细胞株SW-1990细胞的抗瘤活性均优于姜黄素。
所述姜黄素衍生物为姜黄素环酮衍生物,为在α-碳位置成环酮的结构修饰,以增加其抗癌及抗氧活性。制备方法可采用现有技术方法,如邓兵,杜志云,唐煌等:“姜黄素类似物的合成及其清除自由基的研究”化学研究与应用[J],2006年第18卷第9期,1124~1126;
其中:R1=R2=-H; 或者 R1=-OH,R2=-H;或者 R1=H,R2=-OCH3;或者 R1=R2=-C(CH3)3;或者R1=R2=-OCH3
合成方法如下:将芳香醛及环己酮置于圆底烧瓶中,加入浓盐酸,于室温搅拌30min后放置两天,于反应瓶中加入20ml 水,过滤沉淀得到粗产品。用合适的溶剂进行处理或重结晶得到姜黄素类似物。
用甲醇重结晶,得到产品2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H),产率95%,熔点>300℃。
用乙醇重结晶,得到产品2,6-双(3,4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=-OH,R2=-H),产率90%,熔点>300℃。
直接水洗烘干,得到产品2,6-双(3-甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=H,R2=-OCH3),产率98%,熔点:178~179℃。
用丙酮/水(V:V=4:1)重结晶,得到产品2,6-双(3,5-二叔丁基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-C(CH3)3),产率65%,熔点:188~190℃。
用乙醇重结晶,得到产品2,6-双(3,5-二甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-OCH3),产率62%,熔点:134~135℃。
以上五种姜黄素环酮衍生物,利用清除1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基的方法,进行抗自由基试验测定,均表现出对DPPH自由基一定的清除能力,抗氧化自由基的活性均比姜黄素活性强。
有益效果:
本发明含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂具有以下优点:
(1)能够促进动物生长,改善和保护肝脏,提高动物抗氧化能力,降低脂质过氧化物的产生,提高免疫防御力和抗病力,提高养殖动物的生产性能,降低饵料系数,对鱼体无副作用;(2)可以预防和治疗养殖动物肝脏疾病,提高鱼体免疫力,降低养殖动物疾病爆发率,提高养殖经济效益;(3)提高鱼体的抗应激力,效果较单一成份对鱼体体质的提高明显,可避免出现“应激性出血”问题,促进鱼体粘液分泌,解决养殖及运输过程中鱼体“发毛”即鳞片松动、易脱落,体表粘液缺失的问题;(4)所用姜黄素或姜黄素衍生物完全可以替代抗生素和促长类药物在水产饲料中应用,保障养殖水产品的食用安全性,维护养殖鱼类健康,是一种新型环保、安全、绿色的饲料添加剂,具有先进性和创新性;(5)所用原料均为安全、无残留、绿色环保型原料,对养殖动物为绿色的添加剂;原料来源稳定,生产工艺简单,添加成本低,使用效果稳定,可提高生产性能和养殖效益。
具体实施方法:
实施例1:
姜黄素购自西安应化生物技术有限公司,商品名:姜黄提取物,其中姜黄素含量为95.36%,为黄色粉末状物。
实施例2:
所述姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素为姜黄素类化合物,合成方法采用胡新龙(浙江工业大学,2007年学位论文)“姜黄素的提取、分离、化学修饰及其衍生物的抗肿瘤的活性研究”报道姜黄素中含有一部分挥发油成分,且姜黄素不溶于水,因此可以用挥发油提取器先去挥发油等脂溶性物质,然后采用乙醇溶液作为提取溶媒提取川姜黄粉末,得到姜黄素。流程如附图5。
工艺条件:首先去挥发油,浸泡时间24 h,姜黄粉末粒度中(20-30目),提取时间1.5h,固液比1:5,去掉挥发油后,继续用75%乙醇进行提取,时间为3 h,液固比为6:1的情况下,提取3次就可以将姜黄粉末中的总姜黄素基本提取完全。继而进行总姜黄素分离提纯,称量所得的总姜黄素5 g,充分溶于5~10 ml DMF中,加入100~200目硅胶10g,使硅胶充分吸附总姜黄素,并于真空状态下,60℃烘干,得红棕色粉末,备用。称取已活化的100g 200-300目的硅胶,氯仿溶解湿法装填硅胶G于Ф=24 mm,L=500 mm的玻璃层析柱中,并用加压球加压,使硅胶充分压实。柱床高H=250 mm。 控制流速v=1.5 ml/min。CHCl3/CH3OH(99:1v/v)的混合溶液为洗脱液,待洗脱液液面与硅胶柱顶端相差约3~5 cm时,加入吸附姜黄素样品的硅胶,使之均匀沉于层析硅胶上端。立即加入洗脱剂开始洗脱,并使流速保持在V=I.5 ml/min。层析柱中呈现明显的三条隔离的色带,当亮黄色溶液流出时,收集流出液。每20 ml一管,共39管,约780 mL溶液。各小管CHCl3:CH3OH:HCOOH=96:4:0.1v/v的混合溶液为展开剂展开,TLC法追踪,并合并具有相同Rf值的产物,得姜黄素晶体(3.21g)、去甲氧基姜黄素(0.90g)和双去甲氧基姜黄素(0.61g)。
实施例3:
所述的姜黄素芳环衍生物的制备方法:
将200ng姜黄素(1.62mmol)溶于40ml丙酮中,加入4ml氯乙酸乙酯、40mgNaI和314mg无水碳酸钾,加热回流24h。过滤,浓缩溶液,用硅胶柱层析纯化,洗脱液为环己烷/乙酸乙酯/乙醇(V(C6H12):V(CH3COOC2H5):V(C2H5OH))=4:5:1,得到229mg姜黄素二碳酸乙酯,产率78%。将200g溶于20ml丙酮/水(V(CH3COCH3):V(H2O))=4:1),加入22mg KOH,不断搅拌,直至TLC检测到姜黄素二碳酸乙酯反应完全。用稀盐酸酸化反应液,蒸馏除去丙酮,并用乙酸乙酯萃取,收集乙酸乙酯层,用无水硫酸钠干燥,蒸馏除去溶剂,用V(C2H5OH):V(H2O)=2:1重结晶,得177mg姜黄素二碳酸,黄色针状晶体,熔点194~195℃。参考方法依据为杜志云,徐学涛,潘文龙;“姜黄素类化合物及姜黄素衍生物对酪氨酸酶抑制作用的研究”日用化学工业[J],2008年第38卷第3期,172~175。
实施例4
所述姜黄素衍生物N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯制备方法:
(1)N-马来酸-甘氨酸的合成:将7.5g(100mmol)甘氨酸(R=-H)悬浮于10ml水中,45℃水浴,搅拌30min,然后一次性加入9.8g(100mmol)马来酸酐,室温下搅拌4h,抽滤,滤饼分别用水、无水乙醇、乙醚洗涤,真空干燥的白色粉末,收率89%。
按照以上方法,分别用缬氨酸(R=-CH(CH3)2)、异亮氨酸(R=-CH(CH3)CH2CH3)和亮氨酸(R=-(CH2)2CH(CH3)2)代替甘氨酸进行反应,制得相应产物。
(2)N-马来酰-甘氨酸-姜黄素单酯合成
将N-马来酸-甘氨酸1.6g(10mmol)溶于20mmol的氯化亚砜,搅拌,加热至回流,反应至无气体产生。减压蒸馏除去剩余的氯化亚砜,向残留物中加入10ml四氯化碳,减压蒸馏,连续三次以除尽氯化亚砜,所得物用10ml CHCl2溶解得溶液备用。
然后将3.7g姜黄素溶解于50ml二氯甲烷后,加入三乙胺2.8ml(20mmol),0℃搅拌,缓慢滴加上述溶液,滴加完毕后补加CHCl2 50ml,室温继续搅拌17h,抽滤,滤液分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次,有机层以无水硫酸镁干燥,旋转蒸发减压下除去溶剂,得棕色固状物,过滤,真空干燥后得到棕红色固体。甲醇-水(80%)重结晶,真空干燥,得棕红色粉末状固体,产率27%,熔点93~97℃。
按照以上方法,分别制得深褐色粉末N-马来酰-缬氨酸-姜黄素单酯,熔点:106-109℃。砖红色粉末N-马来酰-异亮氨酸-姜黄素单酯,熔点:80~83℃。深红色粉末N-马来酰-亮氨酸-姜黄素单酯,熔点:105~107℃。
实施例5
所述姜黄素环酮衍生物的制备方法:
将0.01mol芳香醛及0.005mol环己酮置于圆底烧瓶中,加入0.1ml浓盐酸,于室温(25~30℃)搅拌30min后放置两天,于反应瓶中加入20ml 水,过滤沉淀得到粗产品。用合适的溶剂进行处理或重结晶得到姜黄素类似物,有以下几种产物:
(1)用甲醇重结晶,得到产品2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H),产率95%,熔点>300℃。
(2)用乙醇重结晶,得到产品2,6-双(3,4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=-OH,R2=-H),产率90%,熔点>300℃。
(3)直接水洗烘干,得到产品2,6-双(3-甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=H,R2=-OCH3),产率98%,熔点:178~179℃。
(4)用丙酮/水(V:V=4:1)重结晶,得到产品2,6-双(3,5-二叔丁基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-C(CH3)3),产率65%,熔点:188~190℃。
(5)用乙醇重结晶,得到产品2,6-双(3,5-二甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-OCH3),产率62%,熔点:134~135℃。
实施例6:
含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的制备方法:
1) 将所用原料维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),姜黄素或姜黄素衍生物(即姜黄素芳环衍生物或N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯或姜黄素环酮衍生物),肌醇,玉米芯粉分别进行粉碎,过80目标准筛,备用。
2) 按配方分别称取维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):200g,姜黄素或姜黄素衍生物((即姜黄素芳环衍生物或N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯或姜黄素环酮衍生物))200g,肌醇(含量98%):60g,玉米芯粉540g,备用。
3) 将维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),姜黄素或姜黄素衍生物(即姜黄素芳环衍生物或N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯或姜黄素环酮衍生物),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。该复合添加剂在动物饲料中的添加量为0.1%。
所述姜黄素衍生物为姜黄素芳环衍生物或N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯或姜黄素环酮衍生物;
所述N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯的衍生物包括:N-马来酰-甘氨酸-姜黄素单酯、N-马来酰-缬氨酸-姜黄素单酯、N-马来酰-异亮氨酸-姜黄素单酯、N-马来酰-亮氨酸-姜黄素单酯;
所述姜黄素环酮衍生物包括:2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H),
2,6-双(3,4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=-OH,R2=-H),
2,6-双(3-甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=H,R2=-OCH3),
2,6-双(3,5-二叔丁基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-C(CH3)3),
2,6-双(3,5-二甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-OCH3)。
实施例7:
含有姜黄素的复合饲料添加剂的制备方法:
1) 将所用原料姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇,玉米芯粉分别进行粉碎,过80目标准筛,备用。
2) 按配方分别称取姜黄素2 g,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):1000g,肌醇(含量98%):200g,玉米芯粉798g,备用。
3) 将姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素复合饲料添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。该复合饲料添加剂在动物饲料中的添加量为0.2%。
实施例8:
含有姜黄素的复合饲料添加剂的制备方法:
1) 将所用原料姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇,玉米芯粉分别进行粉碎,过80目标准筛,备用。
2) 按配方分别称取姜黄素250g,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):150g,肌醇(含量98%):100g,玉米芯粉500g,备用。
3) 将姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素的复合饲料添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。该复合饲料添加剂在动物饲料中的添加量为0.1%。
实施例9:
含有姜黄素的复合饲料添加剂的制备方法:
1) 将所用原料姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇,玉米芯粉分别进行粉碎,过80目标准筛,备用。
2) 按配方分别称取姜黄素300g,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):150g,肌醇(含量98%):50g,玉米芯粉500g,备用。
3) 将姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素的复合饲料添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。该复合饲料添加剂在动物饲料中的添加量为0.1%。
实施例10:
含有姜黄素衍生物即N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯的复合饲料添加剂的制备方法:
1) 将所用原料维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),姜黄素衍生物(即N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯:具体为N-马来酰-甘氨酸-姜黄素单酯或N-马来酰-缬氨酸-姜黄素单酯或N-马来酰-异亮氨酸-姜黄素单酯或N-马来酰-亮氨酸-姜黄素单酯),肌醇,玉米芯粉分别进行粉碎,过80目标准筛,备用。
2) 按配方分别称取维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):150g,姜黄素衍生物(即N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯:具体为N-马来酰-甘氨酸-姜黄素单酯或N-马来酰-缬氨酸-姜黄素单酯或N-马来酰-异亮氨酸-姜黄素单酯或N-马来酰-亮氨酸-姜黄素单酯)250g,肌醇(含量98%):100g,玉米芯粉500g,备用。
3) 将维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%)姜黄素衍生物(即N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯:具体为N-马来酰-甘氨酸-姜黄素单酯或N-马来酰-缬氨酸-姜黄素单酯或N-马来酰-异亮氨酸-姜黄素单酯或N-马来酰-亮氨酸-姜黄素单酯),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素衍生物的复合饲料添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。该复合添加剂在动物饲料中的添加量为0.1%。
实施例11:
含有姜黄素环酮衍生物的复合饲料添加剂的制备方法:
1) 将所用原料维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),姜黄素衍生物(即姜黄素环酮衍生物的五种衍生物中的任何一种:2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H)、或2,6-双(3,4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=-OH,R2=-H)、或2,6-双(3-甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=H,R2=-OCH3)、或2,6-双(3,5-二叔丁基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-C(CH3)3)、或2,6-双(3,5-二甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-OCH3)),肌醇,玉米芯粉分别进行粉碎,过80目标准筛,备用。
2) 按配方分别称取维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):150g,姜黄素衍生物(即姜黄素环酮衍生物的五种衍生物中的任何一种:2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H)、或2,6-双(3,4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=-OH,R2=-H)、或2,6-双(3-甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=H,R2=-OCH3)、或2,6-双(3,5-二叔丁基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-C(CH3)3)、或2,6-双(3,5-二甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-OCH3))300g,肌醇(含量98%):100g,玉米芯粉450g,备用。
3) 将维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%)姜黄素衍生物(即姜黄素环酮衍生物的五种衍生物中的任何一种:2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H)、或2,6-双(3,4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=-OH,R2=-H)、或2,6-双(3-甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=H,R2=-OCH3)、或2,6-双(3,5-二叔丁基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-C(CH3)3)、或2,6-双(3,5-二甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-OCH3)),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素衍生物的复合饲料添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。该复合饲料添加剂在动物饲料中的添加量为0.1%。
实施例12:
添加含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料的配方组成:按照风干物质重量百分比计,包括鱼粉1~30%,豆粕5~30%,菜粕5~30%,棉粕5~30%,肉粉(或肉骨粉)2~10%,小麦5~20%,麸皮5~20%,细米糠5~25%,豆油(和/或菜油,和/或猪油)1~3%,沸石粉1~2%,膨润土1~2%,复合维生素0.1%,复合矿物质0.8%~1%,磷酸二氢钙1.8~2.2%,含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合型饲料添加剂0.1%,总量为100%。
所述复合维生素配方为每kg复合维生素中含有,以维生素计,维生素A:200万IU,维生素D3:100万IU,维生素E:60g,维生素K3:5g,维生素B1:10g,维生素B2:10g,维生素B6:20g,B12:0.1g,烟酸:30g,泛酸:20g,叶酸:5g,生物素:0.1g,肌醇:100g,维生素C磷酸酯(35%含量):300g,余量为玉米蛋白粉。
所述复合矿物质配方为每kg复合矿物质中元素含量为,铁元素18.75g,铜元素0.4375g,锰元素3.75g,锌元素15g,碘元素0.0813g,钴元素0.00875g,硒元素0.0625g,镁元素22.5g,余量为沸石粉补足。
所述含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂中,按照重量百分比计含有,姜黄素或姜黄素衍生物0.2%~30%,维生素C 5%~35%,肌醇3~20%,余量为载体玉米芯粉。
添加含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂的动物饲料具体饲料配方如下:鱼粉10%,豆粕10%,菜粕15%,棉粕15%,肉粉5%,小麦15%,麸皮8%,细米糠15%,豆油1%,菜油1%,沸石粉1%,膨润土1%,复合维生素0.1%,复合矿物质0.8%,磷酸二氢钙2%,含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂0.1%,总量为100%。
所述含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合饲料添加剂,按照重量百分比计含有,姜黄素或姜黄素衍生物200g,维生素C磷酸酯(35%含量)300g,肌醇60g,余量为载体玉米芯粉440g,饲料中添加量为0.1%。
所述饲料制备方法为分别对饲料配方中的各原料进行粉碎,过40目筛,按照配方比例进行称量、混合、调质、制粒、冷却、风干,得所述动物饲料。
所述姜黄素衍生物为姜黄素芳环衍生物或N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯或姜黄素环酮衍生物;
所述N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯的衍生物包括:N-马来酰-甘氨酸-姜黄素单酯、N-马来酰-缬氨酸-姜黄素单酯、N-马来酰-异亮氨酸-姜黄素单酯、N-马来酰-亮氨酸-姜黄素单酯;
所述姜黄素环酮衍生物包括:2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H),
2,6-双(3,4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=-OH,R2=-H),
2,6-双(3-甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=H,R2=-OCH3),
2,6-双(3,5-二叔丁基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-C(CH3)3),
2,6-双(3,5-二甲氧基-4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-OCH3)。
实施例13:
草鱼基础饲料配方如下:以风干物质重量百分比计:含有小麦16%,麸皮6%,细米糠12%,豆粕6%,菜粕23%,鱼粉4%,进口肉骨粉3%,磷酸二氢钙2%,膨润土2%,豆油2%,复合维生素0.1%,复合矿物质 0.8%,其余为棉粕,总量为100%;按照上述配方比例将各原料进行混合,调质、制粒、冷却、风干,制备得所用的草鱼基础饲料;以此基础饲料养殖的草鱼设为对照组。
包含含有姜黄素的复合型添加剂的草鱼用饲料:在上述草鱼用基础饲料配方基础上添加含有姜黄素的复合添加剂0.1%,按照上述配方比例将各原料进行混合,调质、制粒、冷却、风干,制备得所用的饲料;以此饲料养殖的草鱼设为试验组。
所述含有姜黄素的复合型添加剂配方为:姜黄素300g,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):150g,肌醇(含量98%):50g,玉米芯粉500g。
采用上述两种饲料对草鱼进行养殖试验,下述试验(1)和试验(2)养殖试验对象为:健康草鱼,平均规格41.26±0.12g,试验组和对照组每组设3个平行,每个平行养殖98尾草鱼,养殖试验周期为2个月。
数据处理:试验数据均以“平均值±标准差”表示,结果用Excel中的t检验法进行显著性分析,P<0.05为差异显著。
试验结果如下:
(1)对鱼体生长和形体指标的影响
从表一中结果可见,试验组的增重率和特定生长率均显著高于对照组(P<0.05),试验组和对照组间的饵料系数存在显著差异性,且试验组显著低于对照组(P<0.05)。
鱼体的形体指标肥满度和内脏指数结果显示,对照组与试验组间无显著性差异(P>0.05),试验组的肥满度均值高于对照组,而内脏指数则相反。表明试验组与对照组相比,试验组对于鱼体的形体指标无显著的影响。但是试验组能够促进鱼体的生长,提高鱼体的生长性能;表明含有姜黄素的复合添加剂对于鱼体具有一定的促生长效果,对鱼体的形体指标无影响,能够达到市场需要的外观体型。
表一:对鱼体生长和形体指标的影响
组别 |
初重(g) |
末均重 (g) |
增重率(%) |
特定生长率 |
对照组 |
41.35±0.09 |
96.35±0.58 |
133.02±1.88 a |
1.51±0.01 a |
试验组 |
41.18±0.27 |
109.7±0.82 |
166.36±0.21b |
1.75±0.00 b |
组别 |
饲料系数 |
肥满度 |
内脏指数% |
|
对照组 |
1.82±0.01 a |
1.67±0.33 a |
9.03±1.62 a |
|
试验组 |
1.64±0.03 b |
1.88±0.10 a |
9.65±0.86 a |
|
注明:不同字母代表具有显著性差异,相同字母代表无著性差异,各组间显著性水平为α=0.05。
(2)对鱼体肝脏功能、抗氧化能力和脂质过氧化物的影响
对鱼体生理指标的测定,结果见表二。试验结果显示试验组对鱼体的生理指标具有的一定的影响作用。
转氨酶是催化氨基酸氧化分解时氨基转移到α-酮酸的酶,正常情况下主要存在于肝细胞内,在血清中的含量也很低,包括谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)。谷丙转氨酶主要分布在肝细胞浆,谷草转氨酶主要分布在肝细胞浆和肝细胞的线粒体中。肝细胞坏死时ALT和AST就会升高。其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致。当肝脏发生严重坏死或破坏时,才能引起谷草转氨酶在血清中浓度升高。在人体医学上以血清转氨酶活力大小作为肝功能是否正常的重要指标之一。血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性在对照组和试验组间无显著性差异(P>0.05),试验组转氨酶活性低于对照组,且试验组的AST/ALT低于对照组。显示了含有姜黄素的复合型添加剂对鱼体肝功能具有保护和调节作用,保证肝脏的正常生理状态。
总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)反映机体抗氧能力和免疫防御能力。溶菌酶(LSZ)是一种非特异性体液免疫因子,活性变化可以反映鱼类非特异性免疫力的变化。丙二醛(MDA)是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应后的氧化终产物,具有细胞毒性。对照组和试验组超氧化物歧化酶、溶菌酶均无显著性差异(P>0.05);总抗氧化能力和丙二醛结果显示,对照组和试验组间二者具有显著性差异(P<0.05),且试验组总抗氧化能力活性显著高于对照组,而丙二醛含量显著低于对照组。表明添加复合型添加剂后对鱼体的总体抗氧化能力提高了,且能够降低丙二醛含量,降低脂质过氧化物过机体的毒害作用,显示了复合添加剂中姜黄素,维生素C和肌醇对于鱼体自身抗氧能力的提高具有效果显著。
对鱼体血清生理指标综合分析,表明含有姜黄素的复合型添加剂对肝脏具有一定的保护和调节作用,保持正常的生理状态,可降低鱼体脂质过氧化产物的产生,提高鱼体的抗氧化能力和防御能力,对鱼体机体健康度的提高具有重要的作用。
表二:对鱼体肝功能、抗氧化能力和脂质过氧化物的影响
组别 | AST(U/mL) | ALT (U/mL) | AST/ALT | SOD (U/mL) |
对照组 | 41.44±1.35 a | 63.23±4.03 a | 0.66 | 106.73±7.39 a |
试验组 | 36.71±5.40 a | 60.45±0.89 a | 0.61 | 102.25±1.98 a |
组别 | T-AOC (U/mL) | LSZ (U/mL) | MDA (nmol/mL) | |
对照组 | 7.89±0.37 a | 186.03±11.65 a | 30.22±0.41 a | |
试验组 | 10.24±0.43 b | 193.77±13.45 a | 20.89±0.63 b | |
注明:不同字母代表具有显著性差异,相同字母代表无著性差异,各组间显著性水平为α=0.05。
(3)外界环境刺激下鱼体外观体征比较
对鱼体抗应激能力测定,采用模拟长途运输装置,放置试验草鱼,平均规格为100g左右,每组放置20尾鱼进行测试,试验用水提前曝气处理,每桶水为10L,每组3个重复数。模拟时间4h,8h,水温设置为15℃和20℃。试验结束,观察鱼体情况。
试验结果见表三。结果显示,鱼体在活力,成活率和体表粘液及游动等症状方面是试验组优于对照组,表明含有姜黄素复合型添加剂对鱼体体质和抗应激能力具有明显的调节作用。
对照组和试验组鱼体的成活率随着不同的水温和时间存在一定的变化,随着时间的延长和水温的升高,鱼体的外观体征出现了差异化。随着时间的延长和温度升高,对照组的鱼体体表粘液分泌减少,体表表现出不同程度的“粗糙感”,鱼体活力降低且出现了一定程度的死亡。对照组在20℃/8h时的死亡率高于15℃/8h。对照组在15℃/8h 和20℃/8h时分别与实验组有显著的差异性。总体比较,试验组优于对照组,且随着时间延长和温度的升高,试验组鱼体成活率高,提高了经济效益。试验组添加剂的使用,能够改善和提高鱼类的抗应激能力。
表三:模拟运输下鱼体外观体征和成活率的比较
注明:不同字母代表具有显著性差异,相同字母代表无著性差异,各组间显著性水平为α=0.05。
实施例14:
制备含有姜黄素的复合添加剂:
1) 将所用原料姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇,玉米芯粉进行粉碎,过80目标准筛,备用。
2) 按配方分别称取姜黄素250g,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):300g,肌醇(含量98%):60g,玉米芯粉390g,备用。
3) 将姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。动物饲料中的添加量为0.1%。
草鱼基础饲料配方,按照重量百分比计,玉米10%,麦麸20%,米糠10%,麦芽根6%,豆粕10%,菜粕17%,鱼粉2%,豆油1%,磷酸二氢钙2%,膨润土1%,复合维生素0.1%,复合矿物质0.8%,余量为棉粕,总量为100%;将各原料经过调质、制粒、冷却、风干后制成草鱼基础饲料,用于养殖草鱼。以此基础饲料养殖的草鱼设为对照组。
包含含有姜黄素的复合型添加剂的草鱼用饲料:在上述草鱼基础饲料配方基础上添加含有姜黄素的复合添加剂0.1%,按照上述配方比例将各原料进行混合,调质、制粒、冷却、风干,制备得所用的饲料;以此饲料养殖的草鱼设为试验组。
采用上述两种饲料对草鱼进行养殖试验,下述试验(a)和试验(b)养殖试验对象为:健康草鱼,平均规格41.50±0.30g,每组3个平行,每个平行养殖100尾草鱼,养殖试验周期为2个月。
数据处理:试验数据均以“平均值±标准差”表示,结果用Excel中的t检验法进行显著性分析,P<0.05为差异显著。
试验结果如下:
(a)对鱼体生长和形体指标的影响
从表四中可见,对照组和试验组在鱼体的增重率和特定生长率方面,两组间存在显著性差异(P<0.05),试验组的增重率和特定生长率高于对照组。饵料系数表示饲料投喂的总量与鱼体增重量的比值,饵料系数高,表明增加单位重量所需饲料量大,饲料转化效率低。饵料系数结果显示两组间无显著性差异(P>0.05),但是试验组的饵料系数低于对照组。整体分析表明,含有姜黄素的复合添加剂能够促进鱼体的生长,具有促生长效果,提高鱼体的生产性能。
鱼体形体指标肥满度和内脏指数结果显示,对照组和试验组间均无显著性差异(P>0.05)。结果表明含有姜黄素的复合添加剂对鱼体具有促生长作用,而对于鱼体的形体指标无显著影响,鱼体能够达到正常的形体指标要求。
表四:对鱼体生长和形体指标的影响
组别 | 初重(g) | 末重(g) | 增重率% | 特定生长率 |
对照组 | 41.59±0.43 | 103.31±0.54 | 148.41±3.89a | 1.63±0.03a |
试验组 | 41.51±0.20 | 108.27±0.83 | 160.84±3.27b | 1.71±0.02b |
组别 | 饲料系数 | 肥满度 | 内脏指数 | |
对照组 | 1.74±0.06a | 1.82±0.09a | 10.10±0.99a | |
试验组 | 1.72±0.03a | 1.89±0.48a | 10.05±1.51a | |
注明:不同字母代表具有显著性差异,相同字母代表无著性差异,各组间显著性水平为α=0.05。
(b)对鱼体肝功能、抗氧化能力及脂质过氧化产物的影响
表五结果显示,鱼体对照组和试验组的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性存在显著性差异(P<0.05),试验组活性低于对照组,AST/ALT比值试验组低于对照组。表明,与对照组相比,试验组对维护鱼体肝脏正常生理功能具有显著的作用。
鱼体的抗氧化能力指标和非特异性免疫力指标结果显示,鱼体的超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,在对照组和试验组间均存在显著性差异(P<0.05);对照组和试验组间的溶菌酶(LSZ)活性无显著性差异(P>0.05)。总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶和溶菌酶活性试验组高于对照组,而超氧化物歧化酶则相反。丙二醛(MDA)含量试验组显著低于对照组(P<0.05)。表明含有姜黄素的复合添加剂能够提高鱼体的抗氧化能力,降低脂质过氧化物产物的量,进而降低对鱼体的毒害作用,可提高鱼体自身免疫力,且效果显著。
表五:对鱼体生理指标的影响
组别 | AST(U/mL) | ALT(U/mL) | AST/ALT | SOD(U/mL) |
对照组 | 56.47±8.78 a | 71.30±1.92 a | 0.79 | 119.58±3.20 a |
试验组 | 34.37±3.14 b | 65.10±0.44 b | 0.53 | 103.86±5.09 b |
组别 | GSH-Px (U/mL) | T-AOC (U/mL) | LSZ (U/mL) | MDA(nmol/mL) |
对照组 | 407.14±10.71 a | 11.92±0.72 a | 201.53±17.76 a | 22.34±0.72 a |
试验组 | 444.64±15.00 b | 13.32±0.33 b | 224.80±29.25 a | 13.32±0.42 b |
注明:不同字母代表具有显著性差异,相同字母代表无著性差异,各组间显著性水平为α=0.05。
(c)外界环境刺激下草鱼外观体征比较
采用模拟长途运输装置,放置试验草鱼,平均规格为100g左右,每组放置20尾鱼进行测试,自然曝气处理的自来水,每桶水为10L,每组3个重复数。模式时间4h,8h,水温设置为15℃和20℃。试验结束,观察鱼体情况。
结果见表六,结果显示,随着环境应激时间的延长,鱼体的外观体征出现了分化,对照组在15℃时对鱼体的影响基本正常,但是随着时间的延长,鱼体出现了轻微的变化,主要体现在鱼体体表的粘液减少,出现少量死亡现象。在20℃/8h时,对照组与试验组、及对照组自身20℃/8h与15℃/8h时相比较,出现了较大变化,鱼体体表粘液减少严重,出现轻度出血点,表明随着环境应激时间的延长,鱼体体质的抵抗力出现了分化。试验组明显优于对照组。表明含有姜黄素的复合添加剂对于鱼体体质改善和抗应激能力的增强具有一定的效果,尤其是鱼类受到环境条件的应激作用下,效果显著。
表六:模拟运输对鱼体外观体征和成活率的比较
实施例15:
制备含有姜黄素的复合添加剂:
(1) 将所用原料姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇,玉米芯粉进行粉碎,过80目标准筛,备用。
(2) 按配方分别称取姜黄素2g,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):1000g,肌醇(98%):200g,玉米芯粉798g,备用。
(3) 将姜黄素,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素或姜黄素衍生物的复合添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。动物饲料中的添加量为0.2%。
草鱼基础饲料配方,按照重量百分比计,次粉15%,麦麸10%,米糠10%,麦芽根6%,豆粕10%,菜粕20%,鱼粉4%,豆油1%,磷酸二氢钙2%,膨润土1%,复合维生素0.1%,复合矿物质0.8%,余量为棉粕,总量为100%;将各原料经过调质、制粒、冷却、风干后制成草鱼基础饲料,用于养殖草鱼。以此基础饲料养殖的草鱼设为对照组。
包含含有姜黄素的复合型添加剂的草鱼用饲料:在上述草鱼基础饲料配方基础上添加含有姜黄素复合添加剂0.2%,按照上述配方比例将各原料进行混合,调质、制粒、冷却、风干,制备得所用的饲料;以此饲料养殖的草鱼设为试验组。
采用上述两种饲料在天津地区进行草鱼养殖试验,养殖池塘均为10亩,投放规格为100g左右,平均放苗数1200尾/亩,平均水深在1.5-1.8米左右,养殖过程中对试验组和对照组的鱼体分别进行检查,发现试验组体表粘液分泌正常,解剖内脏发现肝胰脏颜色鲜红,有弹性,肠道肠壁厚,无肠炎症状,摄食正常。而对照组鱼体粘液正常,解剖内脏发现肝胰脏颜色轻度发白,有轻微脂肪肝现象,肠道有轻度充血的肠炎症状。夏季高温季节,对鱼体的抗应激力和体质进行检查,对草鱼进行捕捞,捕捞试验组的草鱼直接放入装有井水的桶中,观察鱼体体表变化,结果鱼体体表粘液仍正常分泌,体表光滑,鳞片附着紧密、鳞片下未见有出血点,鱼体未出现“应激性出血”症状,鱼体的游动状态正常。说明试验组鱼体体质好,抗应激能力强。10月中旬捕捞试验组草鱼,平规格可达到2.5斤,较对照组池塘鱼体平均规格大0.2斤,养殖过程中,试验组使用鱼药量降低,水产品为绿色安全。
实施例16:
含有姜黄素芳环衍生物(即姜黄素二碳酸)的复合饲料添加剂的制备方法:
(1) 将所用原料姜黄素芳环衍生物(即姜黄素二碳酸),维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇,玉米芯粉分别进行粉碎,过80目标准筛,备用。
(2) 按配方分别称取姜黄素芳环衍生物(即姜黄素二碳酸)200g,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):300g,肌醇(含量98%):60g,玉米芯粉440g,备用。
(3) 将姜黄素芳环衍生物(即姜黄素二碳酸),维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素衍生物(即姜黄素二碳酸)的复合饲料添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。动物饲料中的添加量为0.1%。
武昌鱼基础饲料配方,按照重量百分比计,小麦15%,麦麸10%,米糠10%,麦芽根4%,豆粕6%,菜粕24%,鱼粉3%,豆油1.5%,磷酸二氢钙2%,膨润土1%,复合维生素0.1%,复合矿物质0.8%,余量为棉粕,总量为100%;将各原料经过调质、制粒、冷却、风干后制成基础饲料,用于养殖武昌鱼。以此基础饲料养殖的武昌鱼设为对照组。
在上述武昌鱼基础饲料配方中添加包含有姜黄素衍生物(即姜黄素二碳酸)的复合饲料添加剂0.1%,按照上述配方比例将各原料进行混合,调质、制粒、冷却、风干,制备得所用的饲料;以此饲料养殖的武昌鱼设为试验组。
采用上述两种饲料在辽宁沈阳地区进行养殖,养殖池塘面积均为10亩左右,放养武昌鱼规格在50-100g/尾,平均每亩放养密度为1500尾,水深1.8米左右,水源为地下水,养殖时间为170天。养殖过程中,定期捕鱼,观察鱼体健康度,打样结果显示试验组鱼体的体表正常,未出现“出血,粘液少、体表粗糙”的症状,解剖内脏中肝胰脏和肠道正常。养殖结束,与对照组相比较,试验组池塘当年年底养殖规格平均达到400~500g/尾左右,较对照组大;体质健康,出鱼结果显示鱼体无出血症状,粘液分泌正常,经长途运输后,武昌鱼无死亡现象,表明鱼体体质和抗应激能力强,饵料系数较对照组的低0.1,节约饲料,降低了养殖成本,提高养殖经济效益。
实施例17:
含有N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯(即N-马来酰-D-甘氨酸-姜黄素单酯)的复合饲料添加剂的制备方法:
1) 将所用原料N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯(即N-马来酰-D-甘氨酸-姜黄素单酯),维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇,玉米芯粉分别进行粉碎,过80目标准筛,备用。
2) 按配方分别称取N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯(即N-马来酰-D-甘氨酸-姜黄素单酯)200g,维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):300g,肌醇(含量98%):100g,玉米芯粉400g,备用。
3) 将N-马来酰-D-氨基酸-姜黄素单酯(即N-马来酰-D-甘氨酸--姜黄素单酯),维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素衍生物(即N-马来酰-D-甘氨酸--姜黄素单酯)的复合添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。动物饲料中的添加量为0.1%。
鲤鱼基础饲料配方为,按照重量百分比计,玉米12%,米糠14%,豆粕12%,菜粕21%,鱼粉8%,血球蛋白粉3%,豆油2%,磷酸二氢钙2%,复合维生素0.1%,复合矿物质0.8%,膨润土2%,余量为棉粕,总量为100%。将各原料经过调质、制粒、冷却、风干后制成基础饲料,用于养殖鲤鱼。以此基础饲料养殖的鲤鱼设为对照组。
在上述鲤鱼基础饲料中添加有含有姜黄素衍生物(即N-马来酰-D-甘氨酸--姜黄素单酯)的复合添加剂,添加量为0.1%。按照上述配方比例将各原料进行混合,调质、制粒、冷却、风干,制备得所用的饲料;以此饲料养殖的鲤鱼设为试验组。
采用上述两种饲料在室外网箱中养殖,饲喂100g左右鲤鱼,每个养殖试验组3个处理,每个网箱放100尾鱼,饲喂45d以后,观察对于鲤鱼肝脏症状,以及对生长和饲料利用的影响。试验结束时,对所有试验鱼称重并计算增重率和饵料系数,结果显示,试验组增重率均优于对照组,其中,平均增重率较对照组提高了14.44%;而饲料系数较对照组降低了8.62%。
取10尾鱼,解剖观察鱼体的内脏和肝胰脏情况。结果显示,对照组肝胰脏颜色偏白,显示了轻度的脂肪肝症状。而试验组肝胰脏颜色鲜红,未见脂肪浸入的症状,表现为正常状态见图1和图2。试验组鱼体活力优于对照组,体表粘液正常,抗应激能力较强。
表七:对鱼体生长的影响
注明:不同字母代表具有显著性差异,相同字母代表无著性差异,各组间显著性水平为α=0.05。
实施例18:
含有姜黄素环酮衍生物的复合饲料添加剂的制备方法:
1) 将所用原料维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),姜黄素环酮衍生物(即2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H)),肌醇,玉米芯粉分别进行粉碎,过80目标准筛,备用。
2) 按配方分别称取维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%):500g,姜黄素环酮衍生物(即2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H))180g,肌醇(含量98%):150g,玉米芯粉1170g,备用。
3) 将维生素C-2-磷酸酯(维生素C含量35%),姜黄素环酮衍生物(即2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H)),肌醇(含量98%),玉米芯粉,加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合,混合均匀度达到95%以上,变异系数≤5%,制备得含有姜黄素环酮衍生物(即2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H))的复合饲料添加剂。所述复合添加剂可用于制备饲料或养殖动物。动物饲料中的添加量为0.2%。
北京地区池塘养殖草鱼鱼种出现了脂肪肝的症状,主要表现为鱼体摄食减弱,鱼体抗应激能力差,并有部分死亡现象,鱼体体表粘液较少,对鱼体解剖分析发现,鱼体肝脏颜色发白,有脂肪浸入的情况,胆囊肿大,为典型的脂肪肝症状,见图3。针对上述情况使用含有姜黄素环酮衍生物的复合饲料添加剂的饲料进行调整,方案如下:草鱼基础饲料配方:小麦10%,麦麸10%,米糠12%,豆粕15%,菜粕20%,麦芽根8%,玉米纤维饲料5%,鱼粉2%,豆油1%,磷酸二氢钙2%,膨润土2%,沸石粉2%,复合维生素0.1%,复合矿物质0.8%,余量为棉粕,总量100%。在上述基础配方中,添加含有姜黄素环酮衍生物(即2,6-双(4-羟基苯亚甲基)环己酮(R1=R2=-H))的复合饲料添加剂,添加量为0.2%。按照上述配方比例将各原料进行混合,调质、制粒、冷却、风干,制备所用的饲料用于饲喂草鱼,经过1个月时间的饲喂,死亡率逐渐减低,最后并没有死亡情况发生;鱼体摄食能力加强,活力和抗应激能力较投喂前有明显的改善。对鱼体解剖发现,脂肪肝症状明显减弱,表现为肝脏颜色转变为鲜红色,并未发现明显的脂肪浸入现象,见图4,胆囊恢复正常;体表粘液分泌正常,与调整前相比较,鱼体基本转为正常状态。