CN102166210A - 1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学药物领域，具体涉及一种1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。本发明发现含苄基或对溴苯基的1-脱氧野尻霉素衍生物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。该类1-脱氧野尻霉素衍生物作为高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于治疗糖尿病，肥胖症，病毒感染等疾病,具有广阔的应用前景。

Description

1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用

技术领域

本发明属于化学药物领域，具体涉及一种1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

背景技术

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)化学名为(2R, 3R, 4R, 5S)-2-(羟甲基-3,4,5一三羟基)吡啶，是一种不能在人体代谢的氮杂糖。由于DNJ的结构类似于葡萄糖，相当于吡喃糖环上的氧被氮取代，使DNJ在酶催化的糖代谢过程中与糖基中间体形成竞争，可以完全占据酶的活化口袋^[1]，从而表现出很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，在糖尿病的治疗方面显现了高效的药理活性^[2]。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制小肠α-葡萄糖苷酶，减缓碳水化合物的水解和葡萄糖的吸收，从而避免餐后血糖和血浆胰岛素的过度增高，由于其副作用小，仅限于肠道不良反应，已成为治疗I型和II型糖尿病的一线药物，临床常见品种有阿卡波糖(Acarbose，拜糖平)，米格列醇(Miglitol)和桑枝颗粒剂^[3]。

DNJ是目前糖尿病治疗市场上唯一国际公认的零伤害生物制剂，但至今DNJ仍未作为治疗糖尿病的药物上市^[4]。一方面是由于天然产物中DNJ含量甚低且纯化困难，而人工合成难度又较大，成本高，目前DNJ商品大多为DNJ粗提物；另一方面是DNJ在体外实验中是糖苷酶有效的抑制剂，但体内单独作用，至少要经过质膜和内质网两个膜障碍，才能到达抑制位点，导致抑制剂在酶水平和细胞水平有所差异。因此人们为了增加DNJ的体内活性，在DNJ结构中引入疏水性基团以增加其亲脂性^[5]，合成了大量的DNJ衍生物，其中N-羟乙基-1-脱氧野尻霉素已被成功开发为治疗糖尿病的新药--米格列醇，由于其高效低毒，因而使糖尿病在治疗方面有了一个质的飞跃^[6]。因此近年来设计合成新型DNJ衍生物受到世界各国药物化学家的高度重视。DNJ及其衍生物作为高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，可用于治疗糖尿病，肥胖症，病毒感染等疾病^[7]。

本发明发现一类新型DNJ衍生物是高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，在糖尿病治疗方面有较好的应用前景。

参考文献：

[1] Yoshimizu M, T, et al. Clinica Chimica Acta, 2008, 391(1-2), 68-73.

[2] McDonnell C, et al. J. Org. Chem. 2004, 69, 3565-3568.

[3] 田金英，张天娇，叶菲. 临床和实验医学杂志. 2005, 4, 105 –106.

[4] Kuriyama C, et al.Bioorg. Med. Chem., 2008, 16(15), 7330-7336.

[5] Andersson U, et a1. Biochem Pharmacol,2004, 67(4), 697-705.

[6] Minami Y, et a1. Bioorg Med Chem, 2008, 16(6), 2734-2740.

[7] Kong W H, et al. J Agric Food Chem, 2008, 56(8), 2613-2619。

发明内容

本发明的目的在于提供一种1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。所述1-脱氧野尻霉素衍生物结构通式如下:

其中：R为苄基或对溴苯基等芳基，具体结构为：

本发明中，所述1-脱氧野尻霉素衍生物的合成路线如下：

具体合成步骤如下：

1）制备化合物1

1

向圆底烧瓶中加入1-脱氧野尻霉素、苯基环氧化合物和有机溶剂，室温反应12-24h，TLC显示反应完成后，真空旋转蒸去甲醇，硅胶柱分，即得所需产品；其中，1-脱氧野尻霉素与苯基环氧化合物的摩尔比为1:1-1:1.1，有机溶剂采用无水甲醇或甲醇/水。

2）制备化合物2

                                        2

向圆底烧瓶中加入1-脱氧野尻霉素、对溴苯基环氧化合物和有机溶剂，室温反应12-24h，TLC显示反应完成后，真空旋转蒸去甲醇，硅胶柱分，即得所需产品；其中，1-脱氧野尻霉素与对溴苯基环氧化合物的摩尔比为1:1-1:1.1，有机溶剂采用无水甲醇或甲醇/水。

本发明合成的新型芳香性1-脱氧野尻霉素衍生物，具有a-葡萄糖苷酶抑制活性，同时也可以作为进一步修饰的药物中间体，具有开发成新的治疗糖尿病药物的潜在应用价值。该合成路线具有操作简便、反应条件温和、节省溶剂、减少污染等优点，便于工业化生产。

本发明中，1-脱氧野尻霉素衍生物1是非竞争性抑制剂，Ki = 156 μM，IC50 = 306 μM；1-脱氧野尻霉素衍生物2是竞争性抑制剂，Ki = 353 μM，IC50 = 3.9 mM。

本发明公开的两种1-脱氧野尻霉素衍生物作为高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，由于其具有芳香环的稳定性，因此不容易分解，它可以耐强酸和强碱，并能在多种氧化和还原条件下保持稳定，因此有广阔的应用前景，可用于治疗糖尿病，肥胖症，病毒感染等疾病。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明，但不能限制本发明的内容。

实施例1：化合物1的制备

               1

向圆底烧瓶中加入1-脱氧野尻霉素10 mg(0.06 mmol)、环氧化合物12 mg(0.07 mmol)、甲醇/H₂O（50 μL/50 μL），室温反应12h。TLC检测显示反应基本完成后，真空旋转蒸发除去甲醇，之后在反应瓶中加入无水乙醇，共沸除去水。硅胶柱（EtOAc/CH₃OH = 4:1）分离得白色固体9 mg，收率48.0%。

产物表征数据如下：¹HNMR (500 MHz, D₂O) : δ = 7.37 (s, 5H), 4.54 (t, 2H), 3.98 (m, 1H), 3.82 (m, 2H), 3.43-3.52 (m, 3H), 3.00 (m, 1H), 2.76 (m, 1H), 2.53 (m, 1H), 3.25(m, 3H), 2.33 (m, 2H) 。

实施例2：化合物1的制备

 1

向圆底烧瓶中加入1-脱氧野尻霉素10 mg(0.06 mmol)、环氧化合物12 mg(0.07 mmol)、甲醇（70 μL），室温反应24h。TLC检测显示反应完成后，真空旋转蒸发除去甲醇。硅胶柱（EtOAc/CH₃OH = 4:1）分离得白色固体17 mg，收率85.0%。

表征数据如下：¹HNMR (500 MHz, D₂O) : δ = 7.37 (s, 5H), 4.54 (t, 2H), 3.98 (m, 1H), 3.82 (m, 2H), 3.43-3.52 (m, 3H), 3.00 (m, 1H), 2.76 (m, 1H), 2.53 (m, 1H), 3.25(m, 3H), 2.33 (m, 2H) 。

实施例3：化合物2的制备

                                2

向圆底烧瓶中加入1-脱氧野尻霉素10 mg(0.06 mmol)、环氧化合物16 mg(0.07 mmol)、甲醇（70 μL），室温反应24h。TLC检测显示反应完成后，真空旋转蒸发除去甲醇，硅胶柱（EtOAc/CH₃OH = 4:1）分离得白色固体19 mg，收率81.0%。

表征数据如下：¹HNMR (500 MHz, D₂O) : δ = 7.38 (t, 2H), 6.83 (t, 2H), 4.17 (m, 1H), 3.78-3.98 (m, 4H), 3.56 (m, 1H), 3.12 (m, 2H), 3.13 (m, 1H), 2.96 (d,J = 13.5 Hz 1H), 2.67 (m, 1H), 2.37 (m, 2H) 。

实施例4：α-葡萄糖苷酶抑制活性(对实施例1-实施例3所得产物检测对酶的抑制作用)

α-葡萄糖苷酶抑制活性检测采取如下方法：

15 μl对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG) (5 mM)于37℃预热10分钟。6 μl α-葡萄糖苷酶 (5 U／ml)，15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)，15 μl α-葡萄糖苷酶抑制剂（5 mM)以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至135 μl于37℃预热10分钟。将预热后的底物溶液与含抑制剂的酶溶液混合，于37℃反应二十分钟，用等体积的碳酸钠溶液（1M）终止反应，取200 μl反应液使用酶标仪在405 nm测OD值。

是否是可逆抑制的判定方法：

取一定量的抑制剂与一定量的酶溶液混合在一起，保温一定时间，取混合溶液作不同程度的稀释，测定反应速度。用反应速度对测活系统中的酶浓度作图，根据曲线的特征可以判定是否是可逆抑制剂。

反应条件：实验分成含抑制剂与不含抑制剂两组，每组又根据抑制剂或酶浓度不同分别标注编号。第一组，取15 μl的待测α-葡萄糖苷酶抑制剂（浓度5 mM，2.5 mM，1.25 mM，625 μM，312.5 μM)与6 μl α-葡萄糖苷酶（5 U，2.5 U，1.25 U，0.625 U，0.3125 U）混合，加入15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)并以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至135 μl于37℃预热10分钟；第二组，取6 μl α-葡萄糖苷酶（5 U，2.5 U，1.25 U，0.625 U，0.3125 U），加入15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)并以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至135 μl于37℃预热10分钟。在上述两组十只管中，加入15 μl 于37℃预热的底物硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG) (5 mM)，混合后37℃反应二十分钟，用等体积的碳酸钠溶液（1M）终止反应，取200 μl反应液使用酶标仪在405 nm测OD值。在加入化合物1，2后，与不加抑制剂相比，曲线斜率会随着抑制剂浓度的升高而降低。说明化合物1，2是α-葡萄糖苷酶的可逆抑制剂。

可逆抑制类型判断及Ki值测定：

实验以抑制剂浓度不同分为三组，每组又按照加入底物量不同分别标注五个编号。第一组不含抑制剂，含15μl谷胱甘肽（1 mg／ml)与6 μl α-葡萄糖苷酶，以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至120 μl于37℃预热10分钟；第二组含终浓度为200 μM的抑制剂，组成如下：15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)，6 μl抑制剂（5 mM）与6 μl α-葡萄糖苷酶，以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至120 μl于37℃预热10分钟；第三组含终浓度为500 μM的抑制剂，组成如下：15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)，15 μl抑制剂（5 mM）与6 μl α-葡萄糖苷酶以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至120 μl于37℃预热10分钟。每组按编号加入在37℃下预热十分钟的底物，使其初始终浓度分别为1 mM，500 μM，250 μM，125 μM，62.5 μM，于37℃反应二十分钟，用等体积的碳酸钠溶液（1M）终止反应，取200 μl反应液使用酶标仪在405 nm测OD值。以1/v~1/[S]作图，判定抑制剂类型，并获得抑制剂的Ki值。根据结果作图，可以看出化合物1为α-葡萄糖苷酶的非竞争抑制剂，Ki值为156 μM；而化合物2为竞争性抑制剂，Ki值为353 μM。按此方法测定阿卡波糖的Ki值为165 μM。

IC50测定：15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)，6 μl α-葡萄糖苷酶和一定量的待测α-葡萄糖苷酶抑制剂混合，以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至135 μl，抑制剂终浓度分别为50，100，200，400，500，800，1000 μM。混合液37℃保温10分钟，再向上述混合液内加入于37℃下预热十分钟的底物（5 mM）15 μl，反应在37℃下进行20分钟，用等体积的碳酸钠溶液（1M）终止反应，取200 μl反应液使用酶标仪在405 nm测OD值。所得结果利用IC50计算器计算。

IC50 = 306 μM                        IC50 = 3.9 mM

按此方法测定阿卡波糖的IC50=295μM。

Claims (2)

1.一种1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用，其特征在于所述1-脱氧野尻霉素衍生物结构通式如下：

其中，R为苄基或对溴苯基，具体结构为：

。

2.如权利要求1所述的应用具有治疗糖尿病、肥胖症或病毒感染。