CN102397269B - 查尔酮类化合物在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents

查尔酮类化合物在制备抗炎药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属药物化学领域，具体涉及特定的查尔酮类化合物在制备抗炎药物及与炎症相关疾病的治疗药物中的应用，这些查尔酮化合物能够抑制TNF-α、IL-6、COX-2、IL-1β和IL-12等多种炎症因子的表达和释放，也能明显抑制炎症调控相关的核转录因子-κB的核转位，抑制炎症信号通路ERK和p38的磷酸化，体内实验能明显提高LPS诱导小鼠致死的生存率。

Description

查尔酮类化合物在制备抗炎药物中的应用
技术领域：
本发明属药物化学领域，具体而言，本发明涉及特定的查尔酮类化合物在制备抗炎药物及与炎症相关疾病的治疗药物中的应用，这些查尔酮类化合物通过抑制多种炎症因子的表达和释放从而达到很好的体外和体内抗炎作用。
背景技术：
天然的查尔酮属于黄酮类化合物，广泛存在于水果蔬菜和天然药物中，并且具有抗炎、抗肿瘤、镇痛、抗溃疡、抗菌作用、抗疟疾等多种生物学活性，且毒性非常低。例如，中国专利申请第200910264515.1号从镰形棘豆中分离出了查尔酮，其具有抑制肿瘤细胞生长、增殖以及抑制急性和慢性炎症的药理活性。
但是，结构上与查尔酮相似的其他查尔酮类化合物的功能活性差异非常大，无法从结构上预测具最终的诸如抗炎等的药理活性。例如，中国专利申请第03809678.1号公开了能够治疗或预防自身免疫病和炎性疾病的查尔酮衍生物，其结构上具有稠环A，与本发明的相差很大。
本发明人经过长期和艰苦的研究实践，在没有结构-功能定向启示的情况下，从大量的查尔酮类化合物中获得了特定的查尔酮类化合物，它们具有抗炎的药理活性。
发明内容：
本发明目的在于提供23个查尔酮类化合物在制备抗炎药物及与炎症相关疾病的治疗药物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种用于治疗炎性疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的权利要求1所述的查尔酮类化合物中的任何一种或多种或其可药用盐及其药用辅料。
具体而然，本发明所述23个查尔酮化合物为如下所述结构：
L4H4的分子式为C15H12ClNO，化学名称为：2-chloro-4’amino Chalcone。L4H8的分子式为C15H12FNO，化学名称为：2-fluoro-4’aminoChalcone。L4H21的分子式为C17H17NO3，化学名称为：2，3-dimethoxyphenyl-4’aminoChalcone。L4H25的分子式为C15H12BrNO，化学名称为：2-bromo-4’aminoChalcone。L5H5的分子式为C16H15NO2，化学名称为：4-methoxy-3’aminoChalcone。L5H21的分子式为C17H17NO3，化学名称为：2，3-dimethoxy-3’-aminoChalcone。L6H1的分子式为C16H12Cl2O2，化学名称为：2，4-dichloro-4’-methoxyChalcone。L6H3的分子式为C17H16O4，化学名称为：4-hydroxy-3，4’-dimethoxyChalcone。L6H4的分子式为C16H13ClO2，化学名称为：2-chloro-4’-methoxyChalcone。L6H8的分子式为C16H13FO2，化学名称为：2-fluoro-4’methoxyChalcone。L6H9的分子式为C16H12F2O2，化学名称为：2，6-difluoro-4’methoxyChalcone。L6H14的分子式为C19H20O5，化学名称为：2，4，6，4’-teramethoxyChalcone。L6H16的分子式为C18H18O4，化学名称为：2，4，4’trimethoxy Chalcone。L6H21的分子式为C18H18O4，化学名称为：2，3，4’-trimethoxy Chalcone。L6H25的分子式为C16H13BrO2，化学名称为：2-bromo-4’-methoxyChalcone。L6H34的分子式为C16H12F2O2，化学名称为：3，4-dichloro-4’-methoxyChalcone。L7H14的分子式为C18H18O5，化学名称为：2，4，6-trimethoxy-2’-hydroxyChalcone。L26H16的分子式为C17H14F2O3，化学名称为：2，4-dimethoxy-3’，4’，-difluoroChalcone。L28H2的分子式为C20H23NO4，化学名称为：4-dimethylamino-3’，4’，5’-trimethoxyChalcone。L28H16的分子式为C20H22O6，化学名称为：2，4-dimethoxy-3’，4’，5’-trimethoxyChalcone。L40H1的分子式为C17H23Cl2O，化学名称为：2，4-dichloro-3’，4’dimethoxy Chalcone。L40H4的分于式为C17H15ClO3，化学名称为：2-chloro-3’，4’dimethoxy Chalcone。L40H16的分子式为C19H20O5，化学名称为：2，4-dimethoxy-3’，4’dimethoxy Chalcone。L40H25的分于式为C17H15BrO3，化学名称为：2-bromo-3’，4’-dimethoxy Chalcone。
就已经报道的查尔酮抗炎活性的文献而然，其抗炎筛选模型一般以对环氧合酶活性的抑制、脂氧合酶活性的抑制、NO释放的抑制、前列腺素PGE2生成的抑制等为主，未发现同时选用TNF-α和IL-6释放地抑制筛选的模型。因此，本发明首先用化合物对LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞释放炎症因子(TNF-α和IL-6)抑制的模型进行了化合物体外抗炎活性的初筛(详情见实施例2)，本发明的有效查尔酮类似物都具有较好的抗炎活性，以L6H3、L6H4、L6H9、L28H2、L40H16五个化合物尤为明显。因此选择这5个化合物进一步进行了抑制LPS刺激巨噬细胞释放炎症因子的量效关系(详情见实施例3)研究，发现它们对TNF-α和IL-6的抑制基本都具有较好的量效关系，对两种因子抑制活性的IC50基本都达到了小于10μM的较好水平。药物对炎症的抑制，应该从多种炎症因子的抑制水平进行考察，因此进一步选择以上5个化合物，进行了以下两方面的研究：化合物抑制LPS诱导的小鼠原代巨噬细胞TNF-α、IL-6、COX-2、IL-1β和IL-12的mRNA的表达的研究(详情见实施例4)；化合物抑制小鼠原代巨噬细胞中高糖诱导的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的mRNA的表达(详情见实施例8)；从两种模型的研究进一步发现，化合物基本都能明显抑制各种炎症因子mRNA的表达。以上各种炎性因子的表达水平与核转录因子-κB(NF-κB)有关，当NF-κB的核转位增加时，炎性因子表达增加，反之，炎性因子表达降低。因此，我们选择化合物L6H4和L6H9，进一步研究了化合物抑制LPS诱导的NF-κB p65的核转位，发现两个化合物都能否明显降低NF-κB p-65的核转位(详情见实施例5)，抑制NF-κB p-65的核转位可能是两个化合物的抗炎机制之一。MAPKs(尤其是ERK和p38)通路对各种炎症因子的表达起着重要作用，ERK和p38的磷酸化增加时，能够促进炎性因子的表达，抗炎药物一般都能够抑制ERK和p38的磷酸化。因此，选择五个活性化合物测定了它们对LPS诱导的ERK和P38磷酸化的抑制作用，发现化合物(10μM)基本都能对p-ERK和p-p38起到抑制作用(详情见实施例6)。L6H4和L6H9两个化合物浓度为5.0、10和20μM时，对p-ERK和p-p38的抑制均有较好的量效关系，尤其是在20μM时，对ERK和p38的磷酸化完全抑制(详情见实施例6)。最后我们也从体内表征了化合物的抗炎活性，选择活性化合物L6H4和L6H9，研究了化合物对LPS致小鼠死亡的生存率的影响，发现LPS组小鼠在5天之内全部死亡，加药组小鼠致死率明显降低，L6H4和L6H9组小鼠生存率分别为70％和80％(详情见实施例7)，这些化合物具有开发为抗炎药物的前景。
本发明所述抗炎化合物可以应用于制备抗炎药物及与与炎症相关疾病的治疗药物中，所述疾病的病因至少部分地是.由炎症引起，所述疾病包括但不限于以下疾病：缓解类风湿关节炎、骨关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎、风湿性关节炎、各种慢性关节炎的急性发作期或持续性的关节肿痛症状；治疗非关节性的各种软组织风湿性疼痛，如肩痛、腱鞘炎、滑囊炎、肌痛及运动后损伤性疼痛；急性的轻、中度疼痛，如，手术后、创伤后、劳损后、原发性痛经、牙痛、头痛；缺血性再灌注，如，脑缺血再灌注、心肌缺血再灌注；动脉粥样硬化。
一种用于治疗炎性疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的以上所述23个查尔酮类化合物中的任何一种或多种或其可药用盐及其药用辅料。“药物组合物”指本发明所述23个查尔酮类化合物中的任何一种或多种或其可药用盐与现已上市的抗炎药物联合使用，制备得到的防治炎症疾病类药物的组合物，已上市的抗炎药物包括各种甾体类抗炎药物和非甾体类抗炎药物。
本文中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将具制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
下面将结合实施例及说明书附图详细说明本发明。
附图说明：
图1查尔酮类化合物对LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞释放IL-6和TNF-α的抑制。检测IL-6的方法：1.2×106个RAW 264.7巨噬细胞用DMEM培养液培养于37℃，24小时后更新培养液并加入受测化合物预处理2小时，再用0.5ug/ml的LPS处理22小时，收集培养液用ELISA检测IL-6含量；收集细胞检测总蛋白浓度，ELISA结果用相应的总蛋白浓度相除较准。以LPS对照组的IL-6含量定标为100。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。检测TNF-α的方法同前，除了用ELISA检测TNF-α含量。
图2五个活性化合物抑制LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞释放IL-6和TNF-α的量效关系。检测TNF-α的方法：1.2×106个RAW 264.7巨噬细胞用DMEM培养液培养于37℃，24小时后更新培养液并加入各种浓度(2.5，5.0，10.0μM)的受测化合物预处理2小时，再用0.5μg/ml的LPS继续处理22小时，收集培养液用ELISA检测TNF-α含量；收集细胞检测总蛋白浓度，ELISA结果用相应的总蛋白浓度相除较准。用相对于LPS对照组的相对含量表示测试组TNF-α的含量。每个化合物重复测试4-7次，计算平均值和误差值。检测IL-6的方法同前，除了用ELISA检测IL-6含量。(*P＜0.05，**P＜0.01)
图3五个活性化合物抑制LPS诱导的小鼠原代巨噬细胞炎症因子mRNA的表达。细胞用10μM的化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)处理22h。用RT-qPCR测定细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、COX-2、IL-1β和IL-1的mRNA水平。用β-actin的mRNA作为内标，用相对于DMSO组的相对含量表示。(*P＜0.05，**P＜0.01)
图4活性化合物L6H4和L6H9抑制LPS诱导的NF-κB p65的核转位。MPMs细胞分别用化合物(L6H4或L6H9或对照DMSO)预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h，细胞用P65抗体和Cy3荧光素偶联二抗孵育，细胞核用DAPI染色。用荧光显微镜拍照(200×)。五次重复实验得到相同结论。
图5五个活性化合物对LPS诱导的ERK和P38磷酸化的抑制作用。MPMs细胞分别用10μM化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h。western blot检测p-ERK、ERK、p-p38和p38的水平，actin为内参。柱状图代表western blot中蛋白条带的光密度比值，以LPS组值为1，每个柱条为三次实验的平均值和误差值(*P＜0.05，**P＜0.01，vs LPS group)。
图6 L6H4(A)和L6H9(B)对LPS诱导的ERK和P38磷酸化抑制作用的量效关系。巨噬细胞用各种浓度的化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h。western blot检测p-ERK、ERK、p-p38和p38的水平，actin为内参。柱状图代表western blot中蛋白条带的光密度比值，以LPS组值为1，图中值为三次实验的平均值和误差值(*P＜0.05，**P＜0.01，vs LPS group)。
图7 L6H4和L6H9提高小鼠对LPS致死的生存率。小鼠用vehicle(saline)或15mg/kg的L6H4 or L6H9注射(i.v.)给药15min后，注射(i.v.)20mg/kg的LPS。连续7大每隔12h记录生存率(A)和体重(B)。每组的动物为n＝10(**P＜0.01，vs.LPS group)。
图8五个活性化合物抑制MPMs细胞中高糖(HG)诱导的炎症因子mRNA的表达。1×106个MPMs细胞用化合物(10μM)or vehicle(DMSO)预处理2h后，用HG(25mM)刺激3h。低糖(LG，5.5mM葡萄糖)组细胞用PRMI-1640培养基培养。用RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的mRNA水平。柱状图代表三次独立实验的平均值±SEM，asterisks indicatesignificant inhition(*P＜0.05，**P＜0.01，vs HG group)。
具体实施方式：
本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1化合物的合成
将1mmol相应的取代苯甲醛和取代苯乙酮溶于10-20mL无水乙醇中，5-8℃下加入40％NaOH溶液5-10滴，5-8℃反应5-24h后，用TLC检测反应的进行。反应完后，加入1-2倍反应液体积的水，析出沉淀，抽滤，真空干燥过夜后得粉末状产物，经硅胶柱色谱纯化后得纯度均大于98％的化合物。在合成的数百个化合物中，药理活性差别很大，有代表性的化合物及其理化性质如下所述：
对比化合物L1H2：(E)-4-(dimethylamino)Chalcone(L1H2).Yellow crystal，32.4％ yield，mp 97.8～98.9℃.1H-NMR(CDCl3)δ：8.003(d，J＝7.8Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.793(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.552(d，J＝8.4Hz，2H，H-2，H-6)，7.545(t，1H，H-4’)，7.491(t，2H，H-3’，H-5’)，7.337(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，6.698(d，J＝8.4Hz，2H，H-3，H-5)，3.046(s，6H，N(CH3)2-4).ESI-MS m/z：252.7(M+1)+，calcd for C17H17NO：251.32.
对比化合物L1H16：(E)-2，4-dimethoxyphenyl Chalcone(L1H16).Yellow syrupy，62.2％yield，1H-NMR(CDCl3)δ：8.056(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，8.003(d，J＝9.0Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.572(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.566(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.557(t，1H，H-4’)，7.497(t，2H，H-3’，H-5’)，6.533(d，J＝8.4Hz，1H，H-5)，6.475(s，J＝2.4Hz，1H，H-3).ESI-MS m/z：269.0(M+1)+，calcd for C17H16O3：268.31.
对比化合物L1H22：(E)-2-trifluoromethyl Chalcone(L1H22).Light Yellow power，66.0％yield，mp 54.8～56.1℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.112(d，J＝7.8Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.738(d，J＝8.4Hz，2H，H-2，H-6)，7.718(d，J＝15Hz，1H，H-β)，7.698(d，J＝15.0Hz，1H，H-α)，7.649(t，1H，H-4’)，7.559(t，2H，H-3’，H-5’)，6.837(d，J＝9Hz，2H，H-3，H-5).IR(cm-1)：3238(O-H)，1649(C＝O)，1463，1580(Ar)，1598(C＝C)，1167(C-O).ESI-MS m/z：277.6(M+1)+，calcd for C16H11F3O：276.25.
对比化合物L4H16：(E)-2，4-dimethoxy-4’-aminoChalcone(L4H16).Yellow power，54.8％ yield，mp 57.1～59.1℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.019(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.917(dd，J＝1.8Hz，7.2Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.812(d，J＝9.0Hz，1H，H-6)，7.562(d，J＝8.4Hz，1H，H-5)，7.545(d，1H，H-α)，6.690(dd，J＝1.8Hz，7.2Hz，2H，H-3’，H-5’)，6.472(s，J＝1.8Hz，1H，H-3)，4.114(brs，2H，NH2-4)，3.892(s，3H，OCH3-2)，3.875(s，3H，OCH3-4).IR(cm-1)：vmax(cm-1)：3310，3205(NH2)，1393(C＝O)，1580，1465(Ar)，1585(C＝C).ESI-MS m/z：285.1(M+1)+，calcd forC17H17NO3：283.32.
有效化合物L4H4：(E)-2-chloro-4’-amino Chalcone(L4H4)：yellow power，81.1％ yield，mp 132.3-135.7℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.132(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.926(d，J＝8.4Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.733(d，J＝9.6Hz，1H，H-6)，7.490(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.431(d，J＝9Hz，1H，H-3)，7.307(m，1H，H-5)，7.302(m，1H，H-3)，6.700(d，J＝8.4Hz，2H，H-3’，H＝5’)，4.190(brs，2H，NH2-4’).ESI-MS m/z：258.3(M+1)+，calcd for C15H12ClNO：257.71.
有效化合物L4H16：(E)-2，4-dimethoxy-4’-aminoChalcone(L4H16)：Yellow power，54.8％yield，mp 57.1-59.1℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.019(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.917(dd，J＝1.8Hz，7.2Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.812(d，J＝9.0Hz，1H，H-6)，7.562(d，J＝8.4Hz，1H，H-5)，7.545(d，1H，H-α)，6.690(dd，J＝1.8Hz，7.2Hz，2H，H-3’，H-5’)，6.472(s，J＝1.8Hz，1H，H-3)，4.114(brs，2H，NH2-4)，3.892(s，3H，OCH3-2)，3.875(s，3H，OCH3-4).ESI-MS m/z：285.1(M+1)+282.3(M-1)-，calcd for C17H17NO3：283.32.
有效化合物L4H8：(E)-2-fluoro-4’-aminoChalcone(L4H8).yellow power，91.6％ yield，mp 138.7～140.4℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：7.936(d，J＝7.8Hz，2H，H-2’H-6’)，7.863(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.653(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.619～7.647(m，1H，H-6)，7.345～7.362(m，1H，H-4)，7.170～7.196(m，1H，H-5)，7.105～7.138(m，1H，H-3)，6.704(d，J＝7.8Hz，2H，H-3’，H-5’)，4.185(brs，2H，NH2-4’).IR(cm-1)：3216，3329(NH2)，1650(C＝O)，1485，1557，1587(Ar)，1602(C＝C).ESl-MS m/z：240.2(M-1)-，calcd for C15H12FNO：241.26.
有效化合物L4H21：(E)-2，3-dimethoxyphenyl-4’-aminoChalcone(L4H21)：orarngeyellow power，68.9％ yield，mp 135.6-136.8℃,1H-NMR(CDCl3)，δ：8.051(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.929(d，J＝8.4Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.602(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.274(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.083(t，1H，H-5)，6.948(d，J＝8.4Hz，1H，H-4)，6.700(d，J＝8.4Hz，2H，H-3’，H-5’)，4.190(brs，2H，NH2-4’)，3.888(s，3H，OCH3-2)，3.876(s，3H，OCH3-3).ESI-MS m/z：284.1(M+1)+，calcd forC17H17NO3：283.32.
对比化合物L5H2：(E)-4-dimethylamino-3’-aminoChalcone(L5H2).salmon pink power，53.8％ yield，mp 130.5～135.1℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：7.768(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.536(d，J＝8.4Hz，2H，H-2，H-6)，7.375(d，J＝7.2Hz，1H，H-6’)，7.308(s，1H，H-2’)，7.287(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.246～7.260(m，1H，H-5)，6.860(dd，J＝2.4Hz，7.8Hz，1H，H-4’)，6.689(d，J＝9.0Hz，2H，H-3，H-5)，3.811(brs，2H，NH2-3’)，3.042(s，6H，(CH3)2N-4).ESI-MS m/z：266.9(M+1)+，calcd for C17H18N2O：266.34.
有效化合物L5H5：(E)-4-methoxy-3’-aminoChalcone(L5H5)：Light Yellow power，18.1％yield，mp 148.1-150.6℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：7.758(d，J＝16.2Hz，1H，H-β)，7.589(dd，J＝1.8Hz，6.6Hz，2H，H-2，H-6)，7.385(d，J＝7.8Hz，1H，H-6’)，7.361(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.334(t，J＝3.62Hz，1H，H-2’)，7.278(d，J＝7.8Hz，1H，H-5’)，6.930(dd，J＝1.8Hz，7.2Hz，2H，H-3，H-5)，6.903(dd，J＝1.8Hz，7.8Hz，1H，H-4’)，3.852(s，3H，OCH3-4).ESI-MS m/z：253.8(M+1)+，calcdfor C16H15NO2：253.3.
有效化合物L5H21：(E)-2，3-dimethoxy-3’-aminoChalcone(L5H21)：Light Yellow power，57.2％ yield，mp 95.4.6-96.8℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.141(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.925(d，J＝7.8Hz，1H，H-6’)，7.867(s，1H，H-2’)，7.786(d，J＝7.8Hz，1H，H-6)，7.628(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.533(t，1H，H-5)，7.150(t，1H，H-5’)，7.084(d，J＝8.4Hz，1H，H-4)，6.977(t，1H，H-4’)，3.989(s，3H，OCH3-2)，3.942(s，3H，OCH3-3).ESI-MS m/z：281.9(M-1)-，calcd for C17H17NO3：283.32.
有效化合物L6H1：(E)-2，4-dichloro-4’-methoxyChalcone(L6H1)：White power，88.3％yield，mp 130.0-132.6℃.CDCl3，δ：8.014(d，J＝8.4Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.772(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.537(d，J＝9Hz，2H，H-2，H-6)，7.342(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，6.960(d，J＝9Hz，2H，H-3，H-5)，6.686(d，J＝8.4Hz，2H，H-3’，H-5’)，3.052(s，6H，N(CH3)2-4’).ESI-MS m/z：307.5(M+1)+，308.5(M+1)+，caIcd for C16H12Cl2O2：307.17.
有效化合物L6H3：(E)-4-hydroxy-3，4’-dimethoxyChalcone(L6H3).orange crystal，20.1％yield，mp 156.4～158.7℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.014(d，J＝8.4Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.772(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.537(d，J＝9Hz，2H，H-2，H-6)，7.342(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，6.960(d，J＝9Hz，2H，H-3，H-5)，6.686(d，J＝8.4Hz，2H，H-3’，H-5’)，3.052(s，6H，N(CH3)2-4’).ESI-MSm/z：285.3(M+1)+，calcd for C17H16O4：284.31.
有效化合物L6H4：(E)-2-chloro-4’-methoxyChalcone(L6H4)：White power，96.0％ yield，mp 87.8-89.3℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.159(d，J＝16.2Hz，1H，H-β)，8.038(d，J＝9Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.742(d，J＝6.6Hz，1H，H-3)，7.495(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.442(d，J＝9Hz，1H，H-6)，7.326(t，1H，H-4)，7.314(t，1H，H-5)，6.989(d，J＝8.4Hz，2H，H-3’，H-5’)，3.896(s，3H，OCH3-4’).ESI-MS m/z：274.2(M+1)+，calcd for C16H13ClO2：272.73.
有效化合物L6H8：(E)-2-fluoro-4’-methoxyChalcone(L6H8)：White power，91.5％ yield，mp 86.3-87.8℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.045(d，J＝7.8Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.885(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.659(d，J＝16.8Hz，1H，H-α)，7.634(d，J＝7.8Hz，1H，H-6)，7.372(m，1H，H-4)，7.194(t，1H，H-5)，7.131(d，J＝8.4Hz，1H，H-3)，6.988(d，J＝7.8Hz，2H，H-3’，H-5’)，3.894(s，3H，OCH3-4’).ESI-MS m/z：278.9(M+23)+，calcd for C16H13FO2：256.27
有效化合物L6H9：(E)-2，6-difluoro-4’-methoxyChalcone(L6H9).White power colorlesscrystal，38.2％ yield，mp 88.4～90.5℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.037(d，J＝8.4Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.823(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.618(d，J＝16.2Hz，1H，H-α)，7.322～7.3369(m，1H，H-4)，7.061～7.088(m，2H，H-3，H-5)，6.992(d，J＝8.4Hz，H-3’，H-5’)，3.900(s，3H，-OCH3-4’).ESI-MS m/z：274.1(M+1)+，calcd for C16H12F2O2：274.26
有效化合物L6H14：(E)-2，4，4’，6-tetramethoxyChalcone(L6H14)：Yellow power crystal，45.3％ yield，mp 142.5-144.6℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.232(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，8.024(d，J＝7.8Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.885(d，J＝9.6Hz，1H，H-α)，6.961(d，J＝8.4Hz，2H，H-3’，H-5’)，6.141(s，2H，H-3，H-5)，3.905(s，6H，OCH3-2，OCH3-6)，3.876(s，3H，OCH3-4’)，3.856(s，3H，OCH3-4).ESI-MS m/z：329.0(M+1)+，calcd for C19H20O5：328.36.
有效化合物L6H16：(E)-2，4，4’-trimethoxy Chalcone(L6H16).Yellow power crystal，59.7％yield，mp 84.2～85.8℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.037(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，8.028(d，J＝8.4Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.570(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.556(d，J＝8.4Hz，1H，H-α)，6.972(d，J＝8.4Hz，2H，H-3’，H-5’)，6.534(dd，J＝9Hz，1H，H-5)，6.527(s，1H，H-3)，3.901(s，3H，OCH3-4)，3.883(s，3H，OCH3-4’)，3.856(s，3H，OCH3-2).ESI-MS m/z：297.9(M-1)-，calcd for C18H18O4：298.33.
有效化合物L6H21：(E)-2，3-dimethoxy-4’-methoxyChalcone(L6H21)：White power crystal，82.6％ yield，mp 99.0-99.5℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.077(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，8.040(d，J＝8.4Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.612(d，J＝16.2Hz，1H，H-α)，7.276(d，J＝7.2Hz，1H，H-6)，7.094(t，1H，H-5)，6.982(d，J＝8.4Hz 2H，H-3’，H-5’)，6.964(d，J＝7.2Hz，1H，H-4)，3.894(s，3H，OCH3-4’)，3.891(s，3H，OCH3-2)，3.886(s，3H，OCH3-3).ESI-MS m/z：299.2(M+1)+，calcd for C18H18O4：298.33.
有效化合物L6H25：(E)-2-bromo-4’-methoxyChalcone(L6H25)：White power，99.0％yield，mp 42.9-43.8℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.109(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，8.039(d，J＝9.0Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.729(d，J＝7.8Hz，1H，H-6)，7.639(d，J＝7.8Hz，1H，H-3)，7.437(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.361(t，1H，H-5)，7.246(t，1H，H-4)，6.991(d，J＝9Hz，2H，H-3’，H-5’)，3.898(s，3H，OCH3-4’).ESI-MS m/z：319.7(M+1)+，calcd for C16H13BrO2：317.18.
有效化合物L6H31：(E)-3，4-dichloro-4’-methoxyChalcone(L6H31)：Light Yellow power，68.1％ yield，mp 126.0-127.4℃.1H-NMR(CDC13)，δ：8.035(dd，J＝1.8Hz，7.2Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.721(d，J＝1.8Hz，1H，H-2)，7.678(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.519(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.486(d，J＝7.8Hz，1H，H-5)，7.448(dd，J＝1.8Hz，8.4Hz，1H，H-6)，6.992(dd，J＝1.8Hz，7.2Hz，2H，H-3’，H-5’)，3.899(s，3H，OCH3-4’).ESI-MS m/z：307.3/309.3(M+1)+，calcd for C16H12C12O2：307.17.
有效化合物L6H34：(E)-3，4-dichloro-4’-methoxyChalcone(L6H34)：White power，83.4％yield，mp 132.5-134.7℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.032(d，J＝8.4Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.694(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.468(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.456(d，1H，H-α)，7.354(brs，1H，H-2)，7.183～7.227(m，1H，H-5)，6.991(d，J＝8.4Hz，2H，H-3’，H-5’)，3.899(s，3H，OCH3-4).ESI-MSm/z：275.9(M+1)+，calcd for C16H12F2O2：274.26.
有效化合物L7H1：(E)-2，4-dichloro-2’-hydroxyChalcone(L7H1)：Light Yellow power，39.8％ yield，mp 162.2-164.4℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：12.002(s，1H，OH-2’)，8.224(d，J＝15Hz，1H，H-β)，7.889(d，J＝7.8Hz，1H，H-6’)，7.703(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.624(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.521(t，3H，H-4’)，7.493(s，1H，H-3)，7.330(d，J＝6Hz，1H，H-5)，7.037(t，1H，H-3’)，6.952(t，1H，H-5’).ESI-MS m/z：291.2(M-1)-，calcd for C15H10Cl2O2：293.14.
有效化合物L7H14：(E)-2，4，6-trimethoxy-2’-hydroxyChalcone(L7H14)：Yellow power，8.3％ yield，mp 128.3-130.2℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：13.272(s，1H，OH-2’)，8.391(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，8.022(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.905(dd，J＝8.1Hz，1H，H-6’)，7.436～7.464(m，1H，H-4’)，6.998(dd，J＝8.7Hz，1H，H-3’)，6.899～6.926(m，1H，H-5’)，6.148(s，2H，H-3，H-5)，3.937(s，6H，OCH3-2，OCH3-6)，3.872(s，3H，OCH3-4).ESI-MS m/z：315.4(M+1)+，calcd for C18H18O5：314.33.
有效化合物L26H16：(E)-2，4-dimethoxy-3’，4’，-difluoro Chalcone(L26H16).Yellowpower，83.2％ yield，mp 128.8～129.9℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.054(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.827～7.862(m，1H，H-5’)，7.775～7.797(m，1H，H-2’)，7.562(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.466(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.244～7.287(m，1H，H-6’)，6.544(dd，J＝2.4Hz，8.4Hz，1H，H-5)，6.483(d，J＝1.8Hz，1H，H-3)，3.913(s，3H，OCH3-2)，3.865(s，3H，OCH3-4)，ESI-MS m/z：305.3(M+1)+，calcd for C17H14F2O3：304.29
有效化合物L28H2：(E)-4-dimethylamino-3’，4’，5’-trimethoxy Chalcone(L28H2).YeIlowpower，41.9％ yield，mp 145.0～146.2℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：7.760(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.525(d，J＝8.4Hz，2H，H-2，H-6)，7.247(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.228(s，2H，H-2’，H-6’)，6.688(d，J＝8.4Hz，2H，H-3，H-5)，3.912(s，6H，OCH3-3’，OCH3-5’)，3.892(s，3H，OCH3-4’)，3.016(s，6H，N(CH3)2-4).ESI-MS m/z：342.3(M+1)+，calcd for C20H23NO4：341.4
有效化合物L28H16：(E)-2，3’，4，4’，5’-pentamethoxy Chalcone(L28H16)：Yellow power，90.0％ yield，mp 125.7-127.7℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.047(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.578(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.475(d，J＝16.2Hz，1H，H-α)，7.263(s，2H，H-2’，H-6’)，6.549(dd，J＝1.8Hz，8.4Hz，1H，H-5)，6.487(d，J＝2.4Hz，1H，H-3)，3.947(s，6H，OCH3-3’，OCH3-5’)，3.933(s，3H，OCH3-2)，3.905(s，3H，OCH3-4’)，3.865(s，3H，OCH3-4).ESI-MS m/z：359.0(M+1)+，calcd forC20H22O6：358.39.
有效化合物L40H1：(E)-2，4-dichloro-3’，4’-dimethoxy Chalcone(L40H1)：White power，87.0％ yield，mp 132.2-135.1℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.079(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.679(d，J＝8.4Hz，1H，H-6’)，7.660(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.613(d，J＝0.6Hz，1H，H-3)，7.479(d，J＝15.0Hz，1H，H-α)，7.471(s，1H，H-2’)，7.302(dd，J＝1.2Hz，8.4Hz，1H，H-5)6.932(d，J＝8.4Hz，1H，H-5’)，3.943(s，6H，OCH3-3’，OCH3-4’).ESI-MS m/z：337.1，339.1(M+1)+，calcd forC17H23Cl2O：337.2.
有效化合物L40H5：(E)-4-methoxy-3’，4’-dimethoxy Chalcone(L40H5)：White power，81.1％ yield，mp 83.3-85.2℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：7.778(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.677(dd，J＝1.2Hz，8.4Hz，1H，H-6’)，7.623(d，J＝1.8Hz，1H，H-2’)，7.608(d，J＝8.4Hz，2H，H-3，H-6)，7.446(d，J＝15.0Hz，1H，H-α)，6.940(d，J＝8.4Hz，2H，H-3，H-5)，6.929(d，J＝7.8Hz，1H，H-5’)，3.971(s，6H，OCH3-3’，OCH3-4’)，3.858(s，3H，OCH3-3).ESI-MS m/z：299.5(M+1)+，calcd forC18H18O4：298.33.
有效化合物L40H4：(E)-2-chloro-3’，4’-dimethoxy Chalcone(L40H4).White power，93.7％yield，mp 70.2～72.8℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.186(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.770(d，J＝7.8Hz，1H，H-6’)，7.704(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.651(s，1H，H-2’)，7.522(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.475(d，J＝7.8Hz，1H，H-3)，7.345～7.358(m，2H，H-4，H-5)，6.964(d，J＝8.4Hz，1H，H-5’)，3.985(s，6H，OCH3-3’，OCH3-4’).ESI-MS m/z：303.6(M+1)+，305.6(M+1)+，calcd for C17H15ClO3：302.75
有效化合物L40H16：(E)-2，3’，4，4’-tetramethoxy Chalcone(L40H16)：Yellow power，74.1％yield，mp 111.3-112.6℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.040(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.666(dd，J＝1.8Hz，8.4Hz，1H，H-6’)，7.6235(d，J＝1.8Hz，1H，H-2’)，7.575(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.563(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，6.928(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，6.539(dd，J＝2.4Hz，8.4Hz，1H，H-5)，6.482(d，J＝2.4Hz，1H，H-3)，3.970(s，3H，OCH3-4’)，3.962(s，3H，OCH3-3’)，3.905(s，3H，OCH3-2)，3.858(s，3H，OCH3-4).ESI-MS m/z：329.1(M+1)+，calcd for C19H20O5：328.36.
有效化合物L40H25：(E)-2-bromo-3’，4’-dimethoxy Chalcone(L40H25).White power，75.3％ yield，mp 99.2～103.5℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.107(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.230(dd，J＝1.2Hz，7.8Hz，1H，H-3)，7.675(dd，J＝1.8Hz，8.4Hz，1H，H-3’)，7.642(dd，J＝1.2Hz，8.4Hz，1H，H-6)，7.622(d，J＝1.8Hz，1H，H-2’)，7.432(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.364(t，J＝7.8Hz，1H，H-5)，7.243(dd，J＝1.2Hz，7.2Hz，1H，H-4)，6.935(d，J＝8.4Hz，1H，H-5’)，3.974(s，6H，OCH3-3’，OCH3-4’).ESI-MS m/z：349.6(M+1)+，347.7(M+1)+，calcd for C17H15BrO3：347.2.
对比化合物L41H5：(E)-4-methoxy-3’，5’-difluoro Chalcone(L41H5).Light Yellow power，67.7％ yield，mp 101.2～102.1℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：7.820(d，J＝15.6Hz，1H，H-β)，7.615(dd，J＝1.8Hz，8.4Hz，2H，H-2，H-6)，7.511(m，J＝2.4Hz，7.8Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.285(d，J＝15.6Hz，1H，H-α)，7.019(tt，J＝1.8Hz，1H，H-4)，6.951(dd，J＝1.8Hz，8.4Hz，2H，H-3，H-5)，3.869(s，3H，OCH3-4).ESI-MS m/z：275.1(M+1)+，calcd for C16H12F2O2：274.26.
对比化合物L41H16：(E)-2，4-dimethoxy-3’，5’-difluoro Chalcone(L41H16).Yellow power，69.4％ yield，mp 144.4～149.3℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.069(d，J＝16.2Hz，1H，H-β)，7.564(d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，7.500(dd，J＝1.8Hz，7.2Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.429(d，J＝15.6，1H，H-α)，6.997(tt，J＝1.8Hz，8.4Hz，1H，H-4’)，6.547(dd，J＝1.8Hz，8.4Hz，1H，H-5)，6.483(d，J＝1.8Hz，1H，H-3)，3.916(d，3H，OCH3-2)，3.867(d，3H，OCH3-4).ESI-MS m/z：305.3(M+1)+，calcdfor C17H14F2O3：304.29
对比化合物L41H17：(E)-2-methoxy-3’，5’-difluoro Chalcone(L41H17).Light Yellowpower，74.1％ yield，mp 94.5～96.7℃.1H-NMR(CDCl3)，δ：8.163(d，J＝16.2Hz，1H，H-β)，7.655(dd，J＝1.8Hz，7.8Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.543(dd，J＝1.8Hz，7.8Hz，1H，H-6)，7.544(d，J＝16.2Hz，1H，H-α)，7.439(dt，J＝1.8Hz，8.4Hz，1H，H-4’)，7.048～7.066(m，1H，H-4)，7.034～7.048(m，1H，H-5)，6.990(d，J＝8.4Hz，1H，H-3)，3.964(s，3H，OCH3-2).ESI-MS m/z：274.5(M+1)+，calcd forC16H12F2O2：274.26.
实施例2化合物对LPS刺激巨噬细胞释放炎症因子的抑制
采用化合物对LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞释放炎症因子(TNF-α和IL-6)抑制的方法测试了化合物的体外初步抗炎活性，具体方法如下：1.2×106个RAW 264.7巨噬细胞用DMEM培养液培养于37℃，24小时后更新培养液，并加入受测化合物(终浓度为10μM)预处理2小时，再用0.5μg/mL的LPS继续处理22小时，收集培养液用ELISA法检测TNF-α和IL-6含量；收集细胞检测总蛋白浓度，ELISA结果用相应的总蛋白浓度相除较准，以LPS对照组的TNF-α和IL-6含量定标为100；每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。测试时用阳性药物姜黄素(curcumin，cur)做对照。化合物对TNF-α和IL-6释放的抑制活性见图1。本发明的有效化合物都具有较好的抑制IL-6和TNF-a释放的活性；而对比化合物活性不佳，不具有药用前景。大部分有效化合物对LPS刺激的IL-6释放减少了50％以上，具体而言，活性明显优于姜黄素的化合物：L4H21，L6H3，L28H2，L28H16，L40H3；比姜黄素较好的是：L4H8，L4H25，L6H4，L6H8，L6H16，L6H21，L6H25，L40H4，L40H16，L40H21；对TNF-a的抑制明显较好的是：L6H3，L6H4，L6H8，L6H9，L6H14，L6H16，L6H21，L6H25，L6H34，L7H14，L28H16，L28H2，L40H16。
实施例3活性化合物抑制LPS刺激巨噬细胞释放炎症因子的量效关系
进一步测试了活性化合物抑制LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞释放TNF-α和IL-6的量效关系，方法：同实施例2。实验数据见图2。化合物对TNF-α和IL-6的抑制活性均具有较好的量效关系，L6H3、L6H4、L6H9、L28H2、L40H16对TNF-α抑制活性的IC50分别为38.6、7.32、8.42、2.90、2.76μM，对IL-6抑制活性的IC50分别为2.7、8.22、5.55、6.88、5.35μM，由此可见这些化合物都具有药用前景。
实施例4活性化合物抑制LPS诱导的小鼠原代巨噬细胞mRNA的表达
除了TNF-α、IL-6外，COX-2、IL-1β和IL-12均为炎症相关的重要因子。因此，提取ICR小鼠腹腔原代巨噬细胞，用RT-qPCR测定了化合物对LPS诱导的细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、COX-2、IL-1β和IL-12的mRNA水平的抑制作用。具体方法：提取小鼠腹腔原代巨噬细胞培养后，用10μM的化合物(L6H3、L6H4、L28H2和L40H16)分别预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)处理22h；用RT-qPCR测定细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、COX-2、IL-1β和IL-1的mRNA水平。
TNF-α正义引物：5’-TGGAACTGGCAGAAGAGG-3’，TNF-α反义引物：
5’-AGACAGAAGAGCGTGGTG-3’；              IL-6正义引物：
5’-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3’，         IL-6正义引物：
5’-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3’；        COX-2正义引物：
5’-TGGTGCCTGGTCTGATGATG-3’，            COX-2正义引物：
5’-GTGGTAACCGCTCAGGTGTTG-3’；           IL-12正义引物：
5’-GGAAGCACGGCAGCAGAATA-3’，            IL-12正义引物：
5’-AACTTGAGGGAGAAGTAGGAATGG-3’；        IL-1β正义引物：
5’-ACTCCTTAGTCCTCGGCCA-3’，IL-1β正义引物：5’-CCATCAGAGGCAAGGAGGAA-3’；β-actin  正义引物：5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’，β-actin  正义引物：5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’.
活性结果见图3。LPS(0.5μg/m1)能够明显增加TNF-α、IL-6、COX-2、IL-1β和IL-12的mRNA水平，最高可以使IL-12的水平上升600倍；除了L6H9(对COX-2)和L28H2(对COX-2和IL-1β)外，L6H9和L28H2对其它因子，以及其它化合物对各种因子mRNA的抑制效果均很明显。
实施例5化合物抑制LPS诱导的NF-κB p65的核转位
核转录因子-κB(NF-κB)是一种具有基因转录多向调控作用的因子，NF-κB信号通路与炎症引发有着重要关系。正常生理状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκBα结合，处于非活性状态，LPS刺激细胞后，可以引起IκBα降解，释放出NF-κB p65，NF-κB的核定位位点暴露而使其进入细胞核，NF-κB能够结合一系列有基因启动子有κB位点的基因，启动相应基因的转录，TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和COX-2等炎症因子的基因都属于此种基因。另一个方面，能够抑制NF-κB核转位的药物具有较好的抗炎作用，因此，选择抗炎活性化合物L6H4和L6H9进行了化合物抑制LPS诱导的NF-κB p65的核转位实验。
实验方法步骤：原代巨噬细胞分别用化合物(L6H4或L6H9或对照DMSO)预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h，采用NF-κB p-65转位试剂盒(Beyotime Biotech，Nantong，China)对细胞进行免疫荧光标记，即NF-κB p-65用P65抗体和Cy3荧光素偶联二抗(540nm下红色)孵育，细胞核用DAPI染色(350nm下蓝色)，用荧光显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)拍照(200×)，为了得到两种颜色的图像，红色和蓝色图片进行了重合处理，重合处的颜色是紫色。五次重复实验得到相同结果。实验结果见图4，与DMSO组相比，LPS组的核内的紫色明显增加，即NF-κB p-65的核转位明显增加，而两个化合物都能否明显降低NF-κB p-65的核转位，抑制NF-κB p-65的核转位可能是两个化合物的抗炎机制之一。
实施例6活性化合物对LPS诱导的ERK和P38磷酸化的抑制作用
在炎症引发信号通路的上游，MAPKs(尤其是ERK和p38)的磷酸化增强对LPS诱导的NF-κB依赖的各种炎症因子的表达起着重要作用，抗炎药物能够抑制ERK和p38的磷酸化，因此，选择活性化合物测定了它们对LPS诱导的ERK和P38磷酸化的抑制作用。培养原代ICR小鼠巨噬细胞，MPMs细胞分别用10μM化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h。western blot检测p-ERK、ERK、p-p38和p38的水平。实验结果见图5和图6。所测试的五个化合物L6H3、L6H4、L6H9、L28H2、L40H16，除L6H3对p-ERK的抑制作用不明显外，其它化合物对p-ERK和p-p38均有很明显的抑制作用；选择最佳活性化合物L6H4和L6H9，进一步研究它们(浓度2.5、5.0、10和20μM)对p-ERK和p-p38抑制活性的量效关系，发现两个化合物浓度为5.0、10和20μM时，对p-ERK和p-p38的抑制均有较好的量效关系，尤其是在20μM时，对ERK和p38的磷酸化完全抑制。
实施例7活性化合物对LPS致小鼠死亡的生存率的影响
选择活性化合物L6H4和L6H9，用macrogol 15 hydroxystearate(BASF)在有或没有中碳链甘油酯(MCT，BASF)的情况下37℃水浴溶解化合物，化合物浓度为2mg/mL。选择18-22g的雄性B6小鼠，按照15mg/kg(每只200μL)的剂量腹腔注射给药，15分钟后注射LPS(20mg/kg)。连续7天每隔12h记录生存率(A)和体重(B)。空白对照组注射相同体积的载体。实验结果见图7。LPS组小鼠在5天之内全部死亡，加药组小鼠致死率明显降低，L6H4和L6H9组小鼠生存率分别为70％和80％。给化合物组在0-60h内体重有降低，但是60h后体重重新增加。由此可见，L6H4和L6H9能够明显增加LPS对小鼠致死的生存率，具有开发为抗炎药物的前景。
实施例8活性化合物抑制小鼠原代巨噬细胞中高糖诱导的炎症因子mRNA的表达
除LPS外，多种因素都可以诱导炎症，比如高糖(HG)，因此我们选择活性化合物L6H3、L6H4、L6H9、L28H2、L40H16，测试了活性化合物对小鼠原代巨噬细胞中高糖(HG)诱导的炎症因子mRNA的表达的影响。实验方法：1×106个小鼠原代巨噬细胞用化合物(10μM)orvehicle(DMSO)预处理2h后，用HG(25mM)刺激3h，低糖对照为5.5mM的葡萄糖，细胞培养液为PRMI-1640培养基；用RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的mRNA水平；具体详情参照实施例4。柱状图代表三次独立实验的平均值±SEM，asterisks indicate significantinhition(*P＜0.05，**P＜0.01，vs HG group)。实验结果见图8，除L28H2(对IL-6)和L40H16(对IL-1β)外，这两个化合物对其它因子和其它化合物对所测试的四种因子的mRNA表达具有明显的抑制作用。

Claims (1)

1.如下所示的化合物在制备通过抑制TNF-α和IL-6的释放而治疗的炎症相关疾病的药物中的应用：
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