CN103181922A - 一类含哌啶酮的单羰基姜黄素类化合物在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属药物化学领域，具体涉及特定的含哌啶酮的单羰基姜黄素类化合物在制备抗炎药物及与炎症相关疾病的治疗药物中的应用，这些姜黄素化合物能够抑制炎症因子IL-6的表达和释放，也能明显逆转炎症调控相关的IκB的降解，抑制炎症信号通路ERK和JNK的磷酸化，体内实验能明显提高LPS诱导小鼠致死的生存率。

Description

一类含哌啶酮的单羰基姜黄素类化合物在制备抗炎药物中的应用

技术领域：

本发明属药物化学领域，具体而言，本发明涉及一类姜黄素的结构类似物在制备抗炎药物及与炎症相关疾病的治疗药物中的应用，这些姜黄素类化合物通过抑制多种炎症因子的表达和释放从而达到很好的体外和体内抗炎作用。

背景技术：

炎症做为一种重要的病理过程在人体中十分常见，它本身是作为机体对于外来的或者异体的刺激的一种自身免疫应答。而当这种应答失调或者过分应答导致机体的自损伤时，就演变成了炎症。所以大多数的疾病都伴随着炎症的介导和发生，而炎症的介导和发生又使得疾病对于机体的损伤加重，如风湿性关节炎、糖尿病合并症、癌症、动脉粥样硬化、炎性肠病等。在这些过程中，促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等都起到了重要的作用。

姜黄素是几乎所有姜科植物都含有的一种重要活性成分。在印度、巴西、菲律宾、日本、韩国等地都有上千年的食用和药用记载。姜黄素是一个药理活性强、适应症广的化合物。近年来，药物化学和药理学研究发现姜黄素具有抗炎、抗肿瘤、抗血管生成、抗突变、抗菌、抗病毒、抗氧化和神经保护等多种药理作用，姜黄素在美国已经进入I期临床实验阶段。其抗炎活性包括对巨噬细胞释放多种炎症因子的释放等。正是因为多生物活性，以及低分子量、无毒等特点，姜黄素曾被认为是理想的化学治疗药物之一。然而，进一步的研究发现姜黄素在体内的活性偏低、体内吸收少、代谢过快和生物利用度低，极大地限制了它的应用。但是，考虑到它确切的生物活性、相对简单的分子结构，姜黄素仍不失为一种优秀的结构修饰和抗炎药物筛选的先导化合物，目前，以保留其药物安全性、增加抗炎活性和水溶性为目的的姜黄素类似物设计、合成、评估和筛选研究吸引了很多药物研发机构和药物公司。通过大量的文献和专利查阅，我们发现，虽然目前普遍认为姜黄素结构中的活性基团是其酚羟基和β-二酮基团，但在不含有这两个活性基团的姜黄素类似物研究方面，也发现不含有β-二酮的单羰基姜黄素类似物有时候也表现出更强的活性，这对于β-二酮基团是姜黄素的活性必需基团提出了质疑。而且，由于β-二酮结构的存在，姜黄素的稳定性较弱，只有在PH＜6.5时才具有较好的稳定性。据此，去掉β-二酮基团我们前期设计了以丙酮、环己酮和环戊酮为中间碳链的稳定的姜黄素单羰基类似物并表征了其抗炎活性(授权专利号：ZL200710066787.1)；在本发明中，考虑到中间碳链对于单羰基姜黄素类化合物活性的重要影响，我们通过将N原子上不同取代基的哌啶酮作为中间碳链的主体部分，合成得到34个单羰基姜黄素类化合物并表征其抗炎活性和作用机制。结果证明这种设计对药理活性的提高起到积极的作用。

发明内容：

本发明目的在于提供14个单羰基姜黄素类化合物在制备抗炎药物及与炎症相关疾病的治疗药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种用于治疗炎性疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的权利要求1所述的姜黄素类化合物中的任何一种或多种或其可药用盐及其药用辅料。

具体而言，本发明所述14个单羰基姜黄素化合物为如下所述结构：

F4的分子式为C₂₄H₂₇NO₅，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮。F5的分子式为C₂₂H₂₁Cl₂NO，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(2-氯苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮。F6的分子式为C₂₂H₂₃NO₅，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二羟基苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮。F8的分子式为C₂₆H₃₁NO₅，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮。F11的分子式为C₂₂H₂₃NO₅，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮。F12的分子式为C₂₀H₁₇Cl₂NO，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(2-氯苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮。F13的分子式为C₂₀H₁₇F₂NO，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(2-氟苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮。F16的分子式为C₂₂H₂₃NO₃，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(2-甲氧基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮。F18的分子式为C₂₄H₂₇NO₅，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮。F19的分子式为C₂₁H₁₇C₁₄NO，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(2，4-氯苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮。F29的分子式为C₁₉H₁₇NO₃，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(4-羟基苯亚甲基)哌啶-4-酮。F33的分子式为C₁₉H₁₆O₄，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(3-羟基苯亚甲基)哌啶-4-酮。F35的分子式为C₂₅H₂₉NO₇，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(3，4，5-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮。F36的分子式为C₂₃H₂₅NO₅，化学名称为：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮。

在本发明中，我们首先用化合物对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞释放炎症因子(IL-6)抑制的模型进行了化合物体外抗炎活性的初筛(详情见实施例2)，本发明的有效单羰基姜黄素类似物都具有较好的抗炎活性，以F8、F29、F33、F35和F36五个化合物尤为明显。因此选择这5个化合物进一步进行了抑制LPS刺激巨噬细胞释放炎症因子的量效关系(详情见实施例3)研究，发现它们对IL-6的抑制基本都具有较好的量效关系，其抑制活性的IC₅₀基本都达到了小于10μM的较好水平。LPS被TLR4受体识别从而激活MyD88依赖的炎症信号通路，其下游包括核转录因子-κB(NF-κB)以及分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)两种不同的机制。为了验证活性化合物对炎症的作用机制，我们进一步选择以上F8、F29、F35和F36四个化合物，对其进行了以下两方面的研究：化合物刺激IκB的释放从而抑制NF-κB的核转位，当NF-κB的核转位增加时，炎性因子表达增加，反之，炎性因子表达降低(详情见实施例4)；化合物抑制MAPKs(尤其是ERK和JNK)通路中ERK和JNK的磷酸化，ERK和p38的磷酸化增加时，能够促进炎性因子的表达(详情见实施例5)。从两种通路的研究进一步发现，化合物F35和F36(10μM)基本都能明显刺激IκB的释放同时抑制ERK和JNK的磷酸化，两个化合物浓度为2.5、5.0和10μM时均有较好的量效关系，尤其是在化合物F36，对ERK和JNK的磷酸化均有非常优越的抑制作用。最后我们也从体内表征了化合物的抗炎活性，选择活性化合物F35和F36，研究了化合物对LPS致小鼠死亡的生存率的影响，发现80％的LPS组小鼠在4天之内死亡，加药组小鼠致死率明显降低，F35和F36组小鼠生存率分别为80％和60％(详情见实施例6)，这些化合物具有开发为抗炎药物的前景。

本发明所述抗炎化合物可以应用于制备抗炎药物及与与炎症相关疾病的治疗药物中，所述疾病的病因至少部分地是由炎症引起，所述疾病包括但不限于以下疾病：缓解类风湿关节炎、骨关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎、风湿性关节炎、各种慢性关节炎的急性发作期或持续性的关节肿痛症状；治疗非关节性的各种软组织风湿性疼痛，如肩痛、腱鞘炎、滑囊炎、肌痛及运动后损伤性疼痛；急性的轻、中度疼痛，如，手术后、创伤后、劳损后、原发性痛经、牙痛、头痛；缺血性再灌注，如，脑缺血再灌注、心肌缺血再灌注；动脉粥样硬化。

一种用于治疗炎性疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的以上所述34个单羰基姜黄素类化合物中的任何一种或多种或其可药用盐及其药用辅料。“药物组合物”指本发明所述34个单羰基姜黄素类化合物中的任何一种或多种或其可药用盐与现已上市的抗炎药物联合使用，制备得到的防治炎症疾病类药物的组合物，已上市的抗炎药物包括各种甾体类抗炎药物和非甾体类抗炎药物。

本文中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

下面将结合实施例及说明书附图详细说明本发明。

附图说明：

图1单羰基姜黄素类化合物对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞释放IL-6的抑制。检测IL-6的方法：1.2×10⁶个RAW264.7巨噬细胞用DMEM培养液培养于37℃，24小时后更新培养液并加入受测化合物预处理2小时，再用0.5ug/ml的LPS处理22小时，收集培养液用ELISA检测IL-6含量；收集细胞检测总蛋白浓度，ELISA结果用相应的总蛋白浓度相除较准。以LPS对照组的IL-6含量定标为100。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。

图2五个活性化合物抑制LPS刺激RAW264.7巨噬细胞释放IL-6的量效关系。检测IL-6的方法：1.2×10⁶个RAW264.7巨噬细胞用DMEM培养液培养于37℃，24小时后更新培养液并加入各种浓度(2.5，5.0，10.0μM)的受测化合物预处理2小时，再用0.5μg/ml的LPS继续处理22小时，收集培养液用ELISA检测IL-6含量；收集细胞检测总蛋白浓度，ELISA结果用相应的总蛋白浓度相除较准。用相对于LPS对照组的相对含量表示测试组IL-6的含量。每个化合物重复测试4-7次，计算平均值和误差值。(*P＜0.05，**P＜0.01)

图3四个活性化合物对LPS诱导的IκB降解的逆转作用。MPMs细胞分别用10μM化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h。western blot检测IκB的水平，GAPHD为内参。柱状图代表western blot中蛋白条带的光密度比值，以LPS组值为1，每个柱条为三次实验的平均值和误差值(*P＜0.05，**P＜0.01，vs LPS group)。

图4F35和F36对LPS诱导的IκB降解的逆转作用的量效关系。巨噬细胞用各种浓度的化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h。western blot检测IκB的水平，GAPHD为内参。柱状图代表western blot中蛋白条带的光密度比值，以LPS组值为1，图中值为三次实验的平均值和误差值(*P＜0.05，**P＜0.01，vs LPS group)。

图5四个活性化合物对LPS诱导的ERK、JNK和P38磷酸化的抑制作用。MPMs细胞分别用10μM化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h。western blot检测p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38和p38的水平，GAPHD为内参。柱状图代表western blot中蛋白条带的光密度比值，以LPS组值为1，每个柱条为三次实验的平均值和误差值(*P＜0.05，**P＜0.01，vs LPS group)。

图6F35和F36对LPS诱导的ERK磷酸化的抑制作用以及F36对LPS诱导的JNK磷酸化的抑制作用的量效关系。巨噬细胞用各种浓度的化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h。western blot检测p-ERK、ERK、p-JNK和JNK的水平，GAPDH为内参。柱状图代表western blot中蛋白条带的光密度比值，以LPS组值为1，图中值为三次实验的平均值和误差值(*P＜0.05，**P＜0.01，vs LPS group)。

图7F35和F36提高小鼠对LPS致死的生存率。小鼠用vehicle(saline)或15mg/kg的F35或F36注射(i.v.)给药15min后，注射(i.v.)20mg/kg的LPS。连续7天每隔12h记录生存率(A)和体重(B)。每组的动物为n＝10(**p＜0.01，vs.LPS group)。

具体实施方式：

本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。

实施例1化合物的合成

将2mmol相应的酮和4mmol相应的取代苯甲醛溶于无水乙醇∶水(10∶1)中，5-8℃下加入40％NaOH溶液5-10滴(若苯甲醛含有羟基，则用HCl气体作为催化剂)，5-8℃反应5-24h后，用TLC检测反应的进行。反应完后，加入1-2倍反应液体积的水，析出沉淀，抽滤，真空干燥过夜后得粉末状产物，经硅胶柱色谱纯化后得纯度均大于98％的化合物。有代表性的化合物及其理化性质如下所述：

对比化合物F1：(2E，5E)-2，5-二(3，4-二羟基苯亚甲基)环戊酮(F1).13.7％yield，mp260.7℃.¹H-NMR(DMSO-d₆)，δ：9.563(brs，2H，OH-4)，9.211(brs，2H，OH-3)，7.238(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.113(d，J＝1.8Hz，2H，Ar-H²×2)，7.006(dd，J₁＝1.8Hz，J₂＝8.4Hz，2H，Ar-H⁶×2)，6.834(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H⁵×2)，3.001(s，4H，CH₂-O-CH₂).ESI-MS m/z：323.1(M-1)^-，calcd for C₁₉H₁₆O₅：324.33.

对比化合物F2：(2E，6E)-2，6-二(3，4-二羟基苯亚甲基)环己酮(F2).69％yield，mp234.4℃.¹H-NMR(DMSO-d₆)，δ：9.438(brs，2H，OH-4)，9.131(brs，2H，OH-3)，7.446(s，2H，Ar-CH＝C×2)，6.980(d，J＝1.8Hz，2H，Ar-H²×2)，6.873(dd，J₁＝1.8Hz，J₂＝8.4Hz，2H，Ar-H⁶×2)，6.799(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H⁵×2)，2.845(t，J＝4.8Hz，4H，CH₂-C-CH₂)，1.725(t，J＝4.8Hz，2H，C-CH₂-C).ESI-MS m/z：339.1(M+1)⁺，calcd for C₂₀H₁₈O₅：338.35.

对比化合物F3：(1E，4E)-1，5-二(3，4-二羟基苯基)-1，4-二烯-3-戊酮(F3).15％yield，mp149～151.7℃.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：9.697(s，2H，Ar-CH＝C×2)，9.524(s，2H，Ar-C＝CH×2)，7.265(m，4H，Ar-H²×2，Ar-H⁵×2)，6.904(d，2H，Ar-H⁶×2).ESI-MS m/z：296.9(M-1)^-，calcd for C₁₇H₁₄O₅：298.29.ESI-MS m/z：296.9(M-1)^-，calcd for C₁₇H₁₄O₅：298.29.

有效化合物F4：(3E，5E)-3，5-二(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮(F4).36.5％yield，mp213.8～214.7℃.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：7.833(S，2H，Ar-CH＝C×2)，7.139(s，2H，Ar-H²×2)，7.033(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H⁶×2)，6.946(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H⁵×2)，3.842(s，6H，3-OCH₃×2)，3.356(S，4H，-CH₂-N-CH₂-)，2.500(s，2H，N-CH₂)，1.678-1.716(m，2H，-CH₂-)，0.889(t，J＝7.2Hz，3H，-CH₃).ESI-MS m/z：410.1(M+1)⁺，calcd forC₂₄H₂₇NO₅：409.47.

有效化合物F5：(3E，5E)-3，5-二(2-氯苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮(F5).76.6％yield，mp126.2～127.9℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：8.003(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.452～7.468(m，2H，Ar-H⁶×2)，7.281～7.320(m，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁴×2)，7.235～7.251(m，2H，Ar-H⁵×2)，3.692(s，4H，N-CH₂-C×2)，2.420(t，J＝7.8Hz，2H，N-CH₂)，1.343～1.384(m，2H，N-C-CH₂)，0.809(t，J＝7.8Hz，3H，CH₃).ESI-MS m/z：386.2，388.1(M+1)⁺，calcd forC₂₂H₂₁Cl₂NO：386.31.

有效化合物F6：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二羟基苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮(F6).43.15％yield，mp232.2～233.8℃.¹H-NMR(DMSO-d₆)，δ：7.700(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.221(d，J＝1.8Hz，2H，Ar-H²×2)，6.900(d，J＝7.8Hz，2H，Ar-H⁶×2)，6.871(d，J＝7.8Hz，2H，Ar-H⁵×2)，4.524(s，4H，CH₂-N-CH₂)，3.146～3.151(m，2H，N-CH₂)，1.655～1.694(m，2H，N-C-CH₂)，0.912～0.925(m，3H，CH₃).ESI-MS m/z：380.1(M-1)^-，calcd forC₂₂H₂₃NO₅：381.42.

有效化合物F8：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-1-丙基哌啶-4-酮(F8).61.1％yield，mp162.7～165.2℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.769(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.021(dd，J₁＝1.8Hz，J₂＝8.4Hz，2H，Ar-H⁶×2)，6.955(d，J＝1.2Hz，2H，Ar-H²×2)，6.928(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H⁵×2)，3.952(s，6H，3-OCH₃×2)，3.924(s，6H，4-OCH₃×2)，3.854(s，4H，CH₂-N-CH₂)，2.520(t，2H，N-CH₂)，1.483(m，2H，CH₃CH₂)，0.884(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃).ESI-MS m/z：438.3(M+1)⁺，calcd for C₂₆H₃₁NO₅：437.53.

对比化合物F9：(3E，5E)-3，5-二(2，4-二氯苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F9).88.6％yield，mp145.9～147.6℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.913(s，1H，Ar-CH＝C)，7.481(d，J＝1.8Hz，2H，Ar-H³×2)，7.305(dd，J₁＝1.8H z，J₂＝7.8Hz，2H，Ar-H⁶×2)，7.187(d，J＝7.8Hz，2H，Ar-H⁵×2)，3.735(s，4H，CH₂-N-CH₂)，2.453(s，3H，N-CH₃).ESI-MSm/z：427.8，425.9，429.8(M+1)⁺，calcd for C₂₀H₁₅Cl₄NO：427.15.

对比化合物F10：(3E，5E)-3，5-二(4-(二甲氨基)苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F10).16.8％yield，mp225.8～227.3℃；¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.785(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.345(d，J＝9.0Hz，4H，Ar-H²×2，Ar-H⁶×2)，6.716(d，J＝8.4Hz，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁵×2)，3.845(s，4H，CH₂-N-CH₂)，3.023(s，12H，4-N(CH₃)×2)，2.510(s，3H，N-CH₃).ESI-MS m/z：376.1(M+1)⁺，calcd for C₂₄H₂₉N₃O：375.51.

有效化合物F11：(3E，5E)-3，5-二(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F11).17.1％yield，mp190.2～192.7℃.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：7.821(S，2H，Ar-CH＝C×2)，7.418(dd，J₁＝1.8Hz，J₂＝7.8Hz，1H，Ar-H⁶×2)，7.131(d，J＝1.2Hz，2H，Ar-H²×2)，6.969(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H⁶×2)，3.841(s，6H，3-OCH₃×2)，3.345(S，4H，-CH₂-N-CH₂-)，2.500(s，3H，N-CH₃).ESI-MS m/z：382.1(M+1)⁺，calcd for C₂₂H₂₃NO₅：381.42

有效化合物F12：(3E，5E)-3，5-二(2-氯苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F12).78.5％yield，mp143.9～145.2℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：8.010(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.458(d，J＝9.0Hz，2H，Ar-H⁶×2)，7.285～7.322(m，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁴×2)，7.231～7.262(m，2H，Ar-H⁵×2)，3.659(s，4H，CH₂-N-CH₂)，2.379(s，3H，N-CH₃).ESI-MSm/z：358.3，360.1，361.1(M+1)⁺，calcd for C₂₀H₁₇Cl₂NO：358.26.

有效化合物F13：(3E，5E)-3，5-二(2-氟苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F13).95.2％yield，mp138.5～141.8℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：δ：7.902(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.355～7.371(m，2H，Ar-H⁶×2)，7.294(dt，J＝1.2Hz，7.2Hz，2H，Ar-H³×2)，7.187(dt，J₁＝0.6Hz，J₂＝7.2Hz，2H，Ar-H⁴×2)，7.128(dt，J₁＝0.6Hz，J₂＝8.4Hz，2H，Ar-H⁵×2)，3.653(s，4H，N-CH₂×2)，2.409(s，3H，N-CH₃).ESI-MS m/z：326.2(M+1)⁺，calcd for C₂₀H₁₇F₂NO：325.35

对比化合物F14：(3E，5E)-3，5-二(4-羟基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F14).36.7％yield，mp116.5～117.8℃.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：7.758(d，J＝8.4Hz，4H，Ar-CH＝C×2，Ar-H²×2，Ar-H⁶×2)，6.927(d，J＝8.4Hz，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁵×2)，3.324(S，4H，-CH₂-N-CH₂-)，2.498(s，3H，N-CH₃).ESI-MS m/z：319.7(M-1)^-，calcd forC₂₀H₁₉NO₃：321.37.

对比化合物F15：(3E，5E)-3，5-二(4-氟苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F15).67.8％yield，mp173.8～175.8℃.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：7.559-7.595(m，6H，Ar-CH＝C×2，Ar-H⁶×2，Ar-H²×2)，7.311(d，J＝8.4Hz，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁵×2)，3.316(S，4H，-CH₂-N-CH₂-)，2.500(s，3H，N-CH₃).ESI-MS m/z：324.36(M-1)^-，calcd for C₂₀H₁₇F₂NO：325.35.

有效化合物F16：(3E，5E)-3，5-二(2-甲氧基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F16).35.92％yield，mp108.2～110.9℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：8.093(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.335～7.363(m，2H，Ar-H⁶×2)，7.183(dd，J₁＝1.2Hz，J₂＝7.8Hz，Ar-H⁴×2)，6.974(t，J＝7.8Hz，Ar-H⁵×2)，6.924(d，J＝8.4Hz，Ar-H³×2)，3.857(s，6H，2-OCH₃×2)，3.735(s，4H，CH₂-N-CH₂)，2.404(s，3H，N-CH₃).ESI-MS m/z：350.1(M+1)⁺，calcd for C₂₂H₂₃NO₃：349.42.

对比化合物F17：(3E，5E)-3，5-二(2，3-二甲氧基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F17).38.1％yield，mp126.6～128.4℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.173(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.052(d，J＝7.8Hz，2H，Ar-H⁶×2)，7.027(t，J＝7.8Hz，2H，Ar-H⁴×2)，7.003(d，J＝7.8Hz，2H，Ar-H⁵×2)，3.887(s，4H，CH₂-N-CH₂)，3.851-3.876(m，12H，2-OCH₃×2，3-OCH₃×2)，3.838(s，3H，N-CH₃).ESI-MS m/z：410.2(M+1)⁺，calcd for C₂₄H₂₇NO₅：409.47.

有效化合物F18：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-1-甲基哌啶-4-酮(F18).52.3％yield，mp157.3～159.4℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.785(s，2H，Ar-CH＝C×2)，6.999(dd，J₁＝1.2Hz，J₂＝8.4Hz，2H，Ar-H⁶×2)，6.936(d，J＝1.8Hz，2H，Ar-H²×2)，6.916(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H⁵×2)，3.937(s，6H，3-OCH₃×2)，3.915(s，6H，4-OCH₃×2)，3.833(s，4H，CH₂-N-CH₂)，2.497(s，3H，N-CH₃).ESI-MS m/z：410.1(M+1)⁺，calcdfor C₂₄H₂₇NO₅：409.47.

有效化合物F19：(3E，5E)-3，5-二(2，4-氯苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮(F19).92.21％yield，mp100.4～103.7℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.925(s，1H，Ar-CH＝C)，7.487(d，J＝1.8Hz，2H，Ar-H³×2)，7.294(dd，J₁＝1.8Hz，J₂＝7.8Hz，2H，Ar-H⁶×2)，7.175(d，J＝7.8Hz，2H，Ar-H⁵×2)，3.662(s，4H，N-CH₂×2)，2.546(q，J＝7.2Hz，2H，N-CH₂)，0.996(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃).ESI-MS m/z：442.1，440.2，444.0(M+1)⁺，calcd forC₂₁H₁₇C₁₄NO：441.18.

对比化合物F20：(3E，5E)-3，5-二(4-(二甲氨基)苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮(F20).34.2％yield，mp188.6～191.1℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.797(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.355(d，4H，Ar-H²×2，Ar-H⁶×2)，6.720(d，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁵×2)，3.909(s，4H，N-CH₂×2)，2.670(q，J＝7.2Hz，2H，N-CH₂)，1.115(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃).ESI-MS m/z：390.3(M+1)⁺，calcd for C₂₅H₃₁N₃O：389.53.

对比化合物F21：2-{[(3E，5E)-5-[(2-羧基苯基)亚甲基]-1-乙基-4-哌啶酮-3-亚基]甲基}苯甲酸(F21).25.0％yield，mp64.8～66.9℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.889(d，2H，Ar-H³×2)，7.709(t，2H，Ar-CH＝C×2)，7.592(m，4H，Ar-H⁵×2，Ar-H⁶×2)，3.932(m，4H，CH₂-N-CH₂).ESI-MS m/z：390.1(M-1)^-，calcd for C₂₃H₂₁NO₅：391.42.

对比化合物F22：(3E，5E)-3，5-二(2，4，6-三甲氧基苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮(F22).18.66％yield，mp193.7～196.2℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.782(s，2H，Ar-CH＝C×2)，6.118(s，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁵×2)，3.876(s，6H，4-OCH₃×2)，3.800(s，12H，2-OCH₃×2，6-OCH₃×2)，3.482(s，4H，CH₂-N-CH₂)，2.467(m，2H，NCH₂)，0.896(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃).ESI-MS m/z：484.4(M+1)⁺，calcd for C₂₇H₃₃NO₇：483.55.

对比化合物F23：(3E，5E)-3，5-二(2，5-二甲氧基苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮(F23).69.01％yield，mp88.9～92.1℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：8.010(s，2H，Ar-CH＝C×2)，6.875(d，J＝3.0Hz，2H，Ar-H³×2)，6.855(s，2H，Ar-H⁶×2)，6.775(d，J＝3.0Hz，2H，Ar-H⁴×2)，3.751～3.807(m，12H，OCH₃×4)，3.761(s，4H，N-CH₂×2)，2.541(q，J＝7.2Hz，2H，N-CH₂)，0.996(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃).ESI-MS m/z：424.2(M+1)⁺，calcd for C₂₅H₂₉NO₅：423.5.

对比化合物F24：(3E，5E)-3，5-二(2-溴苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮(F24).84.5％yield，mp133.4～136℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.946(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.655(d，J＝7.8Hz，2H，Ar-H³×2)，7.346((t，J＝7.2Hz，2H，Ar-H⁵×2)，7.187～7.236(m，4H，Ar-H⁴×2，Ar-H⁶×2)，3.667(s，4H，N-CH₂×2)，7.525(q，J＝7.2Hz，2H，N-CH₂)，0.972(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃).ESI-MS m/z：462.1，463.9，460.3，462.9，464.9(M+1)⁺，calcd for C₂₁H₁₉Br₂NO：461.19.

对比化合物F25：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二氟苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮(F25).68.69％yield，mp122.2～124.3℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.688(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.191～7.232(m，4H，Ar-H²×2，Ar-H⁶×2)，7.133～7.151(m，1H，Ar-H⁵×2)，3.766(s，4H，N-CH₂×2)，2.635(q，J＝7.2Hz，2H，N-CH₂)，1.082(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃).ESI-MS m/z：376.0，calcd for C₂₁H₁₇F₄NO：375.36.

对比化合物F26：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二甲氧基苯亚甲基)-1-乙基哌啶-4-酮(F26).66.32％yield，mp188.7～190.8℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.783(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.017(dd，J₁＝1.8Hz，J₂＝8.4Hz，2H，Ar-H⁶×2)，6.950(d，J＝1.8Hz，2H，Ar-H²×2)，6.922(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H³×2)，3.920(m，12H，OCH₃×4)，3.888(s，4H，N-CH₂-C×2)，1.085(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃)，2.641(d，J＝7.2Hz，2H，N-CH₂).ESI-MS m/z：424.5(M+1)⁺，calcdfor C₂₅H₂₉NO₅：423.5.

对比化合物F27：(3E，5E)-3，5-二(4-甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(F27).11.1％yield，mp182.0-184.6℃.ESI-MS m/z：336.1(M+1)⁺，calcd for C₂₁H₂₁NO₃：335.4.

对比化合物F28：(3E，5E)-3，5-二(2-氟苯亚甲基)哌啶-4-酮(F28).44.68％yield，mp139.6～142.5℃，¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.884(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.285～7.389(m，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁶×2)，7.204(t，J＝7.2Hz，2H，Ar-H⁴×2)，7.148(t，J＝9.0Hz，2H，Ar-H⁵×2)，4.049(s，4H，CH₂-N-CH₂).ESI-MS m/z：312.3(M+1)⁺，calcd forC₁₉H₁₅F₂NO：311.33.

有效化合物F29：(3E，5E)-3，5-二(4-羟基苯亚甲基)哌啶-4-酮(F29).7.6％yield，mp298.5℃Decompose.¹H-NMR(DMSO-d₆)，δ：10.270(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.392(d，J＝8.4Hz，4H，Ar-H²×2，Ar-H⁶×2)，6.920(d，J＝8.4Hz，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁵×2)，4.451(s，4H，CH₂-N-CH₂).ESI-MS m/z：308.1(M+1)⁺；306.0(M-1)^-，calcd forC₁₉H₁₇NO₃：307.34.

对比化合物F30：(3E，5E)-3，5-二(2，4，6-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(F30).30.61％yield，mp152.3～156.1℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.662(s，2H，Ar-CH＝C×2)，6.124(s，4H，Ar-H³×2，Ar-H⁵×2)，3.843(s，6H，4-OCH₃×2)，3.799(s，12H，2-OCH₃×2，6-OCH₃×2)，3.686(s，4H，CH₂-N-CH₂).ESI-MS m/z：456.2(M+1)⁺，calcd for C₂₅H₂₉NO₇：455.19.

对比化合物F31：(3E，5E)-3，5-二(2，4-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(F31).41.61％yield，mp150.7～154.1℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.993(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.108(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H⁶×2)，6.500(d，J＝7.8Hz，2H，Ar-H⁵×2)，6,464(s，2H，Ar-H³×2)，4.046(s，4H，N-CH₂-C×2)，3.843(s，6H，2-OCH₃×2)，3.834(s，6H，4-OCH₃×2)，1.975(brs，1H，N-H).ESI-MS m/z：396.1(M+1)⁺，calcd for C₂₃H₂₅NO₅：395.45.

对比化合物F32：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二氟苯亚甲基)哌啶-4-酮(F32).31％yield，mp81.6～83.5℃.ESI-MS m/z：337.8(M-1)^-，calcd for C₁₉H₁₃F₄NO：339.34.

有效化合物F33：(3E，5E)-3，5-二(3-羟基苯亚甲基)哌啶-4-酮(F33).41.2％yield，mp＞300℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：8.955(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.764(s，2H，Ar-H²×2)，7.405(t，2H，Ar-H⁶×2)，6.967～6.996(m，4H，Ar-H⁴×2，Ar-H⁵×2)，3.905(s，4H，CH₂-N-CH₂).ESI-MS m/z：308.7(M+1)⁺，calcd for C₁₉H₁₆O₄：307.34.

有效化合物F35：(3E，5E)-3，5-二(3，4，5-三甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(F35).29.73％yield，mp193.7～194.0℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.734(s，2H，Ar-CH＝C×2)，6.615(s，4H，Ar-H²×2，Ar-H⁶×2)，4.210(s，4H，CH₂-N-CH₂)，3.930(s，6H，4-OCH₃×2)，3.880(s，12H，3-OCH₃×2，5-OCH₃×2).ESI-MS m/z：456.2(M+1)⁺，calcd for C₂₅H₂₉NO₇：455.5.

有效化合物F36：(3E，5E)-3，5-二(3，4-二甲氧基苯亚甲基)哌啶-4-酮(F36).8.39％yield，mp162.2～165.4℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ：7.758(s，2H，Ar-CH＝C×2)，7.008(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H²×2)，6.908～6.933(m，4H，Ar-H⁵×2，Ar-H⁶×2)，4.191(s，4H，N-CH₂-C×2)，3.895～3.947(m，12H，OCH₃×4)，1.780(brs，1H，N-H).ESI-MS m/z：396.2(M+1)⁺，calcd for C₂₃H₂₅NO₅：395.45.

实施例2化合物对LPS刺激巨噬细胞释放炎症因子的抑制

采用化合物对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞释放炎症因子(IL-6)抑制的方法测试了化合物的体外初步抗炎活性，具体方法如下：1.2×10⁶个RAW264.7巨噬细胞用DMEM培养液培养于37℃，24小时后更新培养液，并加入受测化合物(终浓度为10μM)预处理2小时，再用0.5μg/mL的LPS继续处理22小时，收集培养液用ELISA法检测TNF-α和IL-6含量；收集细胞检测总蛋白浓度，ELISA结果用相应的总蛋白浓度相除较准，以LPS对照组的TNF-α和IL-6含量定标为100；每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。测试时用阳性药物姜黄素(curcumin，cur)做对照。化合物对IL-6释放的抑制活性见图1。本发明的有效化合物都具有较好的抑制IL-6和TNF-a释放的活性；而对比化合物活性不佳，不具有药用前景。大部分有效化合物对LPS刺激的IL-6释放减少了50％以上，具体而言，活性明显优于姜黄素的化合物：F4，F5，F6，F8，F11，F12，F13，F16，F18，F19，F29，F33，，F35，F36；比姜黄素较好的是：F9，F15，F20，F23，F24，F25，F26，F28。

实施例3活性化合物抑制LPS刺激巨噬细胞释放炎症因子的量效关系

进一步测试了活性化合物抑制LPS刺激RAW264.7巨噬细胞释放IL-6的量效关系，方法：同实施例2。实验数据见图2。化合物对IL-6的抑制活性均具有较好的量效关系，F8，F29，F33，F35，F36对IL-6抑制活性的IC₅₀分别为2.04、2.73、4.19、＜1.0、2.68μM，由此可见这些化合物都具有药用前景。

实施例4活性化合物对LPS诱导的IκB降解的逆转作用

核转录因子-κB(NF-κB)是一种具有基因转录多向调控作用的因子，NF-κB信号通路与炎症引发有着重要关系。正常生理状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，处于非活性状态，LPS刺激细胞后，可以引起IκB降解，释放出NF-κB p65，NF-κB的核定位位点暴露而使其进入细胞核，NF-κB能够结合一系列有基因启动子有κB位点的基因，启动相应基因的转录，TNF-α、IL-6等炎症因子的基因都属于此种基因。另一个方面，能够抑制IκB降解的药物具有较好的抗炎作用，因此，选择抗炎活性化合物进行化合物逆转LPS诱导的IκB降解的实验。培养原代ICR小鼠巨噬细胞，MPMs细胞分别用10μM化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h。western blot检测IκB的水平。实验结果见图3。所测试的四个化合物F8、F29、F35、F36，其中F8和F29对IκB降解的逆转作用不明显，F35和F36对IκB的降解均有很明显的逆转作用；选择最佳活性化合物F35和F36，进一步研究它们(浓度2.5、5.0和10μM)对IκB的降解的逆转活性的量效关系(实验结果见图4)，发现两个化合物浓度为2.5、5.0和10μM时，对IκB的降解的逆转均有较好的量效关系。

实施例5活性化合物对LPS诱导的ERK、JNK和P38磷酸化的抑制作用

在炎症引发信号通路的上游，MAPKs(尤其是ERK、JNK和p38)的磷酸化增强对LPS诱导的NF-κB依赖的各种炎症因子的表达起着重要作用，抗炎药物能够抑制ERK、JNK和p38的磷酸化，因此，选择活性化合物测定了它们对LPS诱导的ERK、JNK和P38磷酸化的抑制作用。培养原代ICR小鼠巨噬细胞，MPMs细胞分别用10μM化合物预处理2h，再用LPS(0.5μg/mL)刺激1h。western blot检测p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38和p38的水平。实验结果见图5。所测试的四个化合物F8、F29、F35、F36，F8和F29对三者磷酸化的抑制作用均不明显，F35和F36对p-ERK均有很明显的抑制作用，F36对p-JNK有很明显的抑制作用；选择最佳活性化合物F35和F36，进一步研究它们(浓度2.5、5.0和10μM)对p-ERK和p-JNK抑制活性的量效关系(实验结果见图6)，发现两个化合物浓度为2.5、5.0和10μM时，对p-ERK的抑制均有较好的量效关系，同时化合物F36对p-JNK的抑制亦有较好的量效关系。

实施例7活性化合物对LPS致小鼠死亡的生存率的影响

选择活性化合物F35和F36，用macrogol15hydroxystearate(BASF)在有或没有中碳链甘油酯(MCT， BASF)的情况下37℃水浴溶解化合物，化合物浓度为2mg/mL。选择18-22g的雄性B6小鼠，按照15mg/kg(每只200μL)的剂量腹腔注射给药，15分钟后注射LPS(20mg/kg)。连续7天每隔12h记录生存率(A)和体重(B)。空白对照组注射相同体积的载体。实验结果见图7。80％LPS组小鼠在4天之内死亡，加药组小鼠致死率明显降低，F35和F36组小鼠生存率分别为80％和60％。给化合物组在0-72h内体重有降低，但是72h后体重重新增加。由此可见，F35和F36能够明显增加LPS对小鼠致死的生存率，具有开发为抗炎药物的前景。

Claims (11)

1.如下所示的化合物之任一在制备抗炎症药物中的应用：

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述炎症是能够通过抑制巨噬细胞释放炎症因子(如，TNF-α和/或IL-6)的释放而治疗的炎症。

3.根据权利要求2所述的应用，所述炎症选自：类风湿关节炎、骨关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎、风湿性关节炎、各种慢性关节炎的急性发作、持续性的关节肿痛、非关节性的软组织风湿性疼痛(如，肩痛、腱鞘炎、滑囊炎、肌痛或运动后损伤性疼痛)、和急性的轻、中度疼痛(如，手术后、创伤后、劳损后、原发性的痛经、牙痛、头痛)。

4.根据权利要求2所述的应用，所述炎症还包括但不限于由炎症因子高表达所介导的急慢性炎症性疾病，如：脓毒血症、糖尿病并发症、动脉粥样硬化、慢性肾炎、心肌炎。

5.根据权利要求1所述的应用，其中化合物优选自如下化合物之任一：

6.根据权利要求5所述的应用，其中化合物优选自如下化合物之任一：

7.权利要求1、5或6所述的化合物或其可药用盐或其它制剂。

8.根据权利要求7所述的化合物或其可药用盐，所述化合物优选自如下化合物之任一：

9.用于治疗炎症的药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1、5或6所述的化合物或其可药用盐和药用辅料。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中权利要求1、5或6所述的化合物或其可药用盐作为唯一的活性成分。

11.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征是：所述药物组合物的制剂形式选自注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂和纳米制剂。

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